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文檔簡介
佛手種質資源遺傳
1器材和方法
材料佛手的葉片,經廣州中醫(yī)藥大學鑒定教研室張丹雁教授鑒定。樣品來源見表1。
儀器與試劑Beckman-15CSR冷凍高速離心機;PCR儀;UVPGDS7600型凝膠成像儀;ECANSpectraFLUORplus多功能酶標儀。大連寶生物DR001AMPCR擴增試劑盒;上海生工隨機引物;上海生工進口分裝瓊脂糖;上海申能博彩3s柱離心式植物基因組DNA試劑盒;天為時代DNAMarker;其他試劑均為國產分析純試劑。
表1樣品來源
方法
佛手總DNA的提取和檢測采用上海申能博彩公司的3s柱離心式植物基因組DNA試劑盒提取。將提取到的DNA用純水稀釋10倍后,用酶標儀分別測定其在260,280nm處的吸收值,計算出OD260與OD280的比值及DNA濃度,并以%瓊脂糖凝膠電泳觀察提取結果的優(yōu)劣。
佛手RAPD反應體系和擴增程序在對佛手PCR擴增體系優(yōu)化后,確定反應的總體積為25μl,包括:MgCl22μl,引物μl,dNTPs2μl,10×buffer緩沖液3μl,μlTaq酶,60ngDNA樣品。
PCR擴增程序為:94℃預變性4min,94℃變性1min,35℃退火lmin,72℃延伸,40次循環(huán),最后72℃延伸10min,-20℃保存。
引物篩選選取德慶、青衣童子兩種地理位置差異較大的DNA樣品做模板,用110個引物對其進行PCR擴增篩選。
擴增與產物檢測13個佛手DNA樣品作為擴增模板,用篩選的引物及條件進行RAPD反應,擴增產物經電泳、染色后在凝膠分子成像儀上檢測并拍照記錄。
數據分析將電泳圖譜上清晰且可重復出現的條帶記為“1”,同一位置沒有出現條帶的記為“0”,從而生成由“1”和“0”組成RAPD表型數據矩陣。統(tǒng)計每條引物擴增出的總帶數和多態(tài)性帶數,計算多態(tài)性位點百分率p=×100%。利用求出Nei-Li相似系數矩陣,用UPGMA法對其進行聚類分析。
2結果
引物篩選110個引物中有51條引物擴增出條帶,每條引物擴增帶數1~15條,平均6條,擴增的譜帶分子量大小在300~2200bp,16條引物擴增的多態(tài)性帶相對較多,且條帶清晰、重復性好。
擴增產物的多態(tài)性分析以16個10mer引物對供試的13份材料進行PCR擴增,統(tǒng)計結果見表2。16個引物共擴增出185條帶,其中多態(tài)性帶有168條,占%;平均每個引物可擴增出條帶,平均每份材料可擴增出條帶,擴增的譜帶分子量大小在300~2200bp;各個引物間擴增的位點數相差較大,不同引物的擴增帶數變幅從6~15條不等,其中擴增帶數最多的引物為S23,具15條擴增帶,最少的為引物S6,僅具6條擴增帶,說明不同引物與供試材料總基因組DNA部分區(qū)域的同源性具有較大的差異。部分引物的擴增結果見圖1。
表216個引物的擴增結果
聚類分析13份供試材料的Nei遺傳相似系數矩陣如表3所示,經聚類分析構建親緣關系樹狀圖。相似系數分布在~之間,說明佛手種質的遺傳多樣性較為豐富。供試材料在相似系數為處分為3個類群,第1類群包括Sn1,Sn2,Sn3和Sn4,第2類群包括Sn5,Sn6,Sn7和Sn8,第3類群包括Sn9,Sn10,Sn11,Sn12和Sn13。
表313份佛手種質資源的相似系數矩陣
圖中對應的各個泳道的品種順序相同,從左到右依次為Sn1~Sn8,DNAMarker,Sn9~Sn13,陰性對照
圖1引物S24,S31,S80,S220的RAPD擴增圖譜
3討論
本研究應用RAPD技術對佛手種間親緣關系進行了闡明,來源不同的13份種質的遺傳多樣性高達%,表明佛手現有的種質遺傳變異較大,從而構成了較為豐富的種質資源基因庫,說明佛手遺傳基礎廣,具有較大的育種潛力和較強的進化能力,這與佛手栽培歷史悠久和種植范圍較廣有關。
圖2基于RAPD分析產生的佛手種質資源聚類圖
供試材料在相似系數為處分為3個類群,這與按照產地的不同將佛手分為廣佛手、浙佛手和川佛手的劃分一致。第1類群和第3類群中各種質之間的親緣較近,這與它們在植物學形態(tài)上差異不大的情況相吻合。第2類群中4個栽培品種雖然在植物學形態(tài)上差異較大,但由于生長環(huán)境相同,在相似系數處聚為一類,親緣關系也較近,可能是遺傳基因和環(huán)境相互作用的結果;其中,Sn8為Sn5的芽變選育品種,兩者在形態(tài)上有較大的差異,但分子水平上證明其遺傳關系較近;Sn6和Sn7兩者在葉片、花、果等植物學形態(tài)上差異較大,但其相似系數為,表明其親緣關系較近,形態(tài)上的差異并未在分子水平上反映。第3類群中,Sn9與Sn10代表佛手的兩種不同果型,以前通常按果型將佛手分為兩種農家品種,但筆者在實地調查中
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