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文檔簡(jiǎn)介
佛手種質(zhì)資源遺傳
1器材和方法
材料佛手的葉片,經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室張丹雁教授鑒定。樣品來(lái)源見(jiàn)表1。
儀器與試劑Beckman-15CSR冷凍高速離心機(jī);PCR儀;UVPGDS7600型凝膠成像儀;ECANSpectraFLUORplus多功能酶標(biāo)儀。大連寶生物DR001AMPCR擴(kuò)增試劑盒;上海生工隨機(jī)引物;上海生工進(jìn)口分裝瓊脂糖;上海申能博彩3s柱離心式植物基因組DNA試劑盒;天為時(shí)代DNAMarker;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>
表1樣品來(lái)源
方法
佛手總DNA的提取和檢測(cè)采用上海申能博彩公司的3s柱離心式植物基因組DNA試劑盒提取。將提取到的DNA用純水稀釋10倍后,用酶標(biāo)儀分別測(cè)定其在260,280nm處的吸收值,計(jì)算出OD260與OD280的比值及DNA濃度,并以%瓊脂糖凝膠電泳觀察提取結(jié)果的優(yōu)劣。
佛手RAPD反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序在對(duì)佛手PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化后,確定反應(yīng)的總體積為25μl,包括:MgCl22μl,引物μl,dNTPs2μl,10×buffer緩沖液3μl,μlTaq酶,60ngDNA樣品。
PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min,94℃變性1min,35℃退火lmin,72℃延伸,40次循環(huán),最后72℃延伸10min,-20℃保存。
引物篩選選取德慶、青衣童子兩種地理位置差異較大的DNA樣品做模板,用110個(gè)引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選。
擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)13個(gè)佛手DNA樣品作為擴(kuò)增模板,用篩選的引物及條件進(jìn)行RAPD反應(yīng),擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳、染色后在凝膠分子成像儀上檢測(cè)并拍照記錄。
數(shù)據(jù)分析將電泳圖譜上清晰且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為“1”,同一位置沒(méi)有出現(xiàn)條帶的記為“0”,從而生成由“1”和“0”組成RAPD表型數(shù)據(jù)矩陣。統(tǒng)計(jì)每條引物擴(kuò)增出的總帶數(shù)和多態(tài)性帶數(shù),計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分率p=×100%。利用求出Nei-Li相似系數(shù)矩陣,用UPGMA法對(duì)其進(jìn)行聚類分析。
2結(jié)果
引物篩選110個(gè)引物中有51條引物擴(kuò)增出條帶,每條引物擴(kuò)增帶數(shù)1~15條,平均6條,擴(kuò)增的譜帶分子量大小在300~2200bp,16條引物擴(kuò)增的多態(tài)性帶相對(duì)較多,且條帶清晰、重復(fù)性好。
擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析以16個(gè)10mer引物對(duì)供試的13份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。16個(gè)引物共擴(kuò)增出185條帶,其中多態(tài)性帶有168條,占%;平均每個(gè)引物可擴(kuò)增出條帶,平均每份材料可擴(kuò)增出條帶,擴(kuò)增的譜帶分子量大小在300~2200bp;各個(gè)引物間擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)相差較大,不同引物的擴(kuò)增帶數(shù)變幅從6~15條不等,其中擴(kuò)增帶數(shù)最多的引物為S23,具15條擴(kuò)增帶,最少的為引物S6,僅具6條擴(kuò)增帶,說(shuō)明不同引物與供試材料總基因組DNA部分區(qū)域的同源性具有較大的差異。部分引物的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。
表216個(gè)引物的擴(kuò)增結(jié)果
聚類分析13份供試材料的Nei遺傳相似系數(shù)矩陣如表3所示,經(jīng)聚類分析構(gòu)建親緣關(guān)系樹狀圖。相似系數(shù)分布在~之間,說(shuō)明佛手種質(zhì)的遺傳多樣性較為豐富。供試材料在相似系數(shù)為處分為3個(gè)類群,第1類群包括Sn1,Sn2,Sn3和Sn4,第2類群包括Sn5,Sn6,Sn7和Sn8,第3類群包括Sn9,Sn10,Sn11,Sn12和Sn13。
表313份佛手種質(zhì)資源的相似系數(shù)矩陣
圖中對(duì)應(yīng)的各個(gè)泳道的品種順序相同,從左到右依次為Sn1~Sn8,DNAMarker,Sn9~Sn13,陰性對(duì)照
圖1引物S24,S31,S80,S220的RAPD擴(kuò)增圖譜
3討論
本研究應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)佛手種間親緣關(guān)系進(jìn)行了闡明,來(lái)源不同的13份種質(zhì)的遺傳多樣性高達(dá)%,表明佛手現(xiàn)有的種質(zhì)遺傳變異較大,從而構(gòu)成了較為豐富的種質(zhì)資源基因庫(kù),說(shuō)明佛手遺傳基礎(chǔ)廣,具有較大的育種潛力和較強(qiáng)的進(jìn)化能力,這與佛手栽培歷史悠久和種植范圍較廣有關(guān)。
圖2基于RAPD分析產(chǎn)生的佛手種質(zhì)資源聚類圖
供試材料在相似系數(shù)為處分為3個(gè)類群,這與按照產(chǎn)地的不同將佛手分為廣佛手、浙佛手和川佛手的劃分一致。第1類群和第3類群中各種質(zhì)之間的親緣較近,這與它們?cè)谥参飳W(xué)形態(tài)上差異不大的情況相吻合。第2類群中4個(gè)栽培品種雖然在植物學(xué)形態(tài)上差異較大,但由于生長(zhǎng)環(huán)境相同,在相似系數(shù)處聚為一類,親緣關(guān)系也較近,可能是遺傳基因和環(huán)境相互作用的結(jié)果;其中,Sn8為Sn5的芽變選育品種,兩者在形態(tài)上有較大的差異,但分子水平上證明其遺傳關(guān)系較近;Sn6和Sn7兩者在葉片、花、果等植物學(xué)形態(tài)上差異較大,但其相似系數(shù)為,表明其親緣關(guān)系較近,形態(tài)上的差異并未在分子水平上反映。第3類群中,Sn9與Sn10代表佛手的兩種不同果型,以前通常按果型將佛手分為兩種農(nóng)家品種,但筆者在實(shí)地調(diào)查中
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