忍冬藤葉中綠原酸的分離純化工藝研究

忍冬藤葉中綠原酸的分離純化工藝研究【摘要】目的研究忍冬藤葉中的綠原酸分離純化工藝。方法用靜態(tài)吸附法考察不同大孔樹脂的吸附、解吸性能，并以綠原酸保留率為指標，采用L9(34)正交實驗設(shè)計對忍冬藤葉中綠原酸的分離純化工藝條件進行優(yōu)化。結(jié)果綜合考慮，最佳大孔樹脂為LSA-21，溶媒濃度為25％，溶媒為2BV，洗脫流速為·h-1。結(jié)論該工藝合理，穩(wěn)定可行，可用于工業(yè)化推廣。

【關(guān)鍵詞】忍冬藤葉；分離純化工藝；大孔吸附樹脂；正交實驗設(shè)計；綠原酸

Abstract：ObjectiveTostudythepurificationofChlorogenicacidintwigandleafLoniceraJaponicaThunb.MethodsThedifferentmacroporousresinpropertiesofabsorptionanddesorptionwereobservedbystaticabsorptionmethod.Withthereservationrateofchlorogenicacidasindexes．orthogonaldesignwithL9(34)wasusedtoselecttheconditionofpurification.ResultsThemacroporousresinofLSA-21hadthebestperformance,andtheoptimumconditionsasfollows：25％alcoholand2BVamountofsolution，theflowratewasBV·conditionofpurificationisstableandpracticable,itcanbeusedforthepreparationinlargescale．

Keywords：LonicerajaponicaThunb.；Purification;Macroporousresin；Orthogonaldesign;Chlorogenicacid

綠原酸是植物在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑形成的一種苯丙素類化合物，屬酚酸類化合物，具有抗菌、抗病毒、升高白細胞、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂等作用［1］，是金銀花、忍冬藤葉的主要有效成分之一。因以金銀花為原料提取綠原酸的生產(chǎn)成本較高，而與花同株的忍冬藤葉中綠原酸含量與花相近，所以從忍冬藤葉中提取分離綠原酸具有顯著經(jīng)濟意義。本實驗在研究忍冬藤葉中綠原酸提取工藝的基礎(chǔ)上對分離純化工藝進行優(yōu)選。

1儀器與材料

儀器島津LC-10ATvp高效液相色譜儀；N2000色譜數(shù)據(jù)工作站；DZF-6021型真空干燥箱；METTLER-TOLEDDAB265-S型電子分析天平(瑞士)。

材料忍冬藤葉，批號070822，江西中醫(yī)藥高等?？茖W校附屬中藥飲片廠提供；AB-8，HPD-100A，HPD-400A，HPD-826A，LSA-21，LSA-80等大孔吸附樹脂，分別購自天津大學化工廠，滄州寶恩化工有限公司，西安藍深有限公司；綠原酸對照品，批號110753-200212，購自中國藥品生物制品檢定所；試劑除HPLC用乙腈為色譜純外，其他均為分析純。

2方法與結(jié)果

含量測定

色譜條件［2］色譜柱為hypersilODS2柱；柱溫35℃；流動相為乙腈-％磷酸；檢測波長327nm；流速ml·min-1；理論塔板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于1000。

對照品溶液的制備精密稱取綠原酸對照品mg，置25ml棕色量瓶中，加50%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1ml，置10ml棕色量瓶中加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，貯存于棕色量瓶并置4℃冰箱，備用。

標準曲線的繪制分別精密量取綠原酸對照品溶液1，2，3，4，5，6ml置10ml容量瓶中，加50％甲醇稀釋至刻度，依次精密吸取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以進樣量對峰面積A作線性回歸，回歸方程為：A=9×106X+8,r=9，可知綠原酸在6～6μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

原藥材含量測定取樣品適量，粉碎成粗粉，分別稱取3份各g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，稱定重量，超聲30min，放冷，再稱定重量，用50％甲醇補足減失重量，搖勻，μm微孔濾膜濾過，精密吸取對照品溶液與樣品濾液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。用外標法，以峰面積計算樣品中綠原酸的含量，結(jié)果平均含量按質(zhì)量分數(shù)計為mg·g-1。

上柱前樣品溶液的制備取忍冬藤葉粗粉1kg，以流速為12ml·kg-1·min-1，溶媒為40％乙醇滲漉，收得8倍量滲漉液,回收乙醇，精密測定殘留液體積并依法測定綠原酸含量，備用。

不同型號的大孔吸附樹脂對綠原酸吸附、解吸能力的比較稱取10g預處理好的大孔吸附樹脂置于100ml錐形瓶中，加入一定量提取液，浸漬24h，不時振搖，依法測定含量，并根據(jù)公式(1)［3］計算吸附量及吸附率。在吸附飽和的10g樹脂中，加入50ml90%乙醇，不斷振搖，依法測定含量，根據(jù)公式(2)［3］計算解吸量和解吸率。結(jié)果見表1。

Qa＝(Co-Ce)×V/WEa＝(Co-Ce)/Co×100%(1)

Qd＝Cd×V/WEd＝Qd/Qa×100%(2)

式中：Qa-吸附量(mg·ml-1)；C0-吸附液起始濃度(mg·ml-1)；Ce-吸附液平衡濃度(mg·ml-1)；V-溶液體積(ml)；W-樹脂重量(g)；Ea-吸附率；Cd-解吸液平衡濃度(mg·ml-1)；Qd一解吸量(mg·ml-1；Ed-解吸率表1大孔吸附樹脂對綠源酸吸附、解吸附能力比較結(jié)果表明，LSA-21吸附量與解吸量最大，LSA-80與HPD-100A吸附量也較大，但解吸量稍低于LSA-21，以吸附量和解吸量為參考指標，綜合考慮最佳大孔吸附樹脂為LSA-21。

優(yōu)化分離純化工藝參數(shù)

正交實驗設(shè)計為優(yōu)化分離、純化工藝參數(shù)，在預實驗的基礎(chǔ)上，采用L9正交實驗設(shè)計，以綠原酸保留率為指標，考察乙醇濃度、收集量、洗脫流速對LSA-21分離、純化效果的影響。因素與水平見表2。

表2因素水平

水平A乙醇濃度正交實驗設(shè)計安排表進行實驗，收集醇洗脫液，搖勻，精確測定體積，依法測定綠原酸含量并計算保留率。結(jié)果見表3，方差分析見表4。

由表3～4可知，對綠原酸保留率的影響因素依次是B＞C＞A，其中因素B有顯著性影響，最佳工藝條件為A3B3C2?？紤]到A1與A3、B2與B3水平對綠原酸保留率影響相近，本著降低成本的原則，確定優(yōu)化工藝為A1B2C2，即溶媒為25％乙醇，收集洗脫液2BV，洗脫流速為BV·h-1。表3正交實驗安排及結(jié)果表4正交實驗方差分析

驗證實驗為進一步考察上述最佳工藝的穩(wěn)定性和合理性，按該工藝條件進行重復性實驗3次，依法測定綠原酸含量并計算保留率。結(jié)果見表5。實驗結(jié)果表明該工藝重復性好，且穩(wěn)定可行。表5最佳工藝的驗證實驗%

3討論

曾比較水提石灰乳沉淀法、乙醇回流法、乙醇滲漉法等3種提取方法對忍冬藤葉中綠原酸提取率的影響，結(jié)果表明乙醇滲漉法為最佳，并經(jīng)L9正交實驗優(yōu)化提取工藝條件為：以40％乙醇為溶媒，收集8倍量滲漉液，流速為12ml·kg-1·min-1。

在提取液上柱吸附平衡后，經(jīng)實驗確定水洗脫流速BV·h-1。同時進行了3BV蒸餾水洗脫實驗，每1BV收集1份，共3份。實驗結(jié)果表明，第1份水洗脫液中含有少量綠原酸，而第2，3份水洗脫液中幾乎不含綠原酸；將3份水洗脫液分別干燥，得浸出物，稱重，結(jié)果除第1份中浸膏收率較大外，第2，3份水洗脫液中浸膏收率均很低。因此，確定先用1BV蒸餾水洗脫，再依實驗安排用不同濃度乙醇洗脫。

經(jīng)對上柱醇洗脫液進行濃縮，干燥，稱重并依法測定含量，結(jié)果干膏收率為％，綠原酸平均含量按質(zhì)量分數(shù)計為％，計算綠原酸總保留率為％。依企業(yè)實際要求，我們在上述提取分離工藝條件的基礎(chǔ)上，又進行了第2步分離純化工藝研究，最終實驗結(jié)果是干膏收率％，綠原酸含量按質(zhì)量分數(shù)計