微生物常規(guī)鑒定技術(shù)

關(guān)于微生物常規(guī)鑒定技術(shù)課件第1頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三

培養(yǎng)特性：指微生物在培養(yǎng)基上所表現(xiàn)的群體形態(tài)和生長情況。

形態(tài)結(jié)構(gòu)：通過染色，在顯微鏡下微生物的形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性。

一、培養(yǎng)特性和形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察第2頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三細(xì)菌的培養(yǎng)特性固體培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)、顏色、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性液體培養(yǎng)基

表面生長情況（菌膜、環(huán)）、混濁度及沉淀半固體培養(yǎng)基

穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況（一）培養(yǎng)特性第3頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三1.點(diǎn)狀2.圓形3.絲狀4.不規(guī)則形5.假根狀6.紡錘狀7.扁平8.隆起9.凸起10.墊狀11.臍狀12.邊緣整齊13.波狀14.裂片狀15.嚙蝕狀16.絲狀17.卷發(fā)狀18.絲線狀19.刺毛狀20.串珠狀21.疏展?fàn)?2.樹根狀23.假根狀

第4頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三細(xì)菌的培養(yǎng)特征24.絲狀25.串珠狀26.乳頭狀27.絨毛狀28.樹根狀29.量杯狀30.蘿卜狀31.漏斗狀32.囊狀33.層狀34.絮狀35.環(huán)狀36.蹼狀37.膜狀第5頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三金葡在不同平板上的菌落特征大腸桿菌在不同培養(yǎng)基上的菌落特征第6頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三沙門氏菌在不同平板上的菌落特征李斯特氏菌在不同平板上的菌落特征第7頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三

固體斜面培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)第8頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三酵母的培養(yǎng)特性固體培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)、顏色、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征液體培養(yǎng)基

表面生長情況（菌膜、環(huán)）、混濁度及沉淀（一）培養(yǎng)特性第9頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三酵母的菌落特征第10頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三霉菌的培養(yǎng)特性固體培養(yǎng)基菌落大小、顏色（正反面）、菌落表面形狀、菌落組織形狀液體培養(yǎng)基

表面生長情況（菌膜、環(huán)）、混濁度及沉淀（一）培養(yǎng)特性第11頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三棉絮狀毛霉菌落特征第12頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三地毯狀青霉菌落特征蜘蛛網(wǎng)狀根霉菌落特征第13頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三絨毛狀曲霉菌落特征第14頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三放線菌的培養(yǎng)特性固體培養(yǎng)基菌落大小、顏色（正反面）、光澤度、質(zhì)地、菌落表面形狀、菌落組織形狀液體培養(yǎng)基

靜置培養(yǎng)：表面生長情況（菌膜、環(huán)）、沉淀振蕩培養(yǎng)：球狀菌絲團(tuán)

（一）培養(yǎng)特性第15頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三產(chǎn)抗菌素的放線菌的菌落特征A：卡特利鏈霉菌；B：弗氏鏈霉菌；C：吸水鏈霉菌金淚亞種；D：卡那霉素鏈霉菌；E：除蟲鏈霉菌；F：生磺酸鏈霉菌A：諾爾斯氏鏈霉菌；B：皮疽諾卡氏菌第16頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三（二）形態(tài)結(jié)構(gòu)細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)細(xì)菌的基本形態(tài)細(xì)菌大小細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)（染色觀察）細(xì)菌的基本形態(tài)第17頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三單球菌如尿素小球菌

雙球菌如肺炎雙球菌四聯(lián)球菌如四聯(lián)小球菌球菌形態(tài)第18頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三八疊球菌如尿素八疊球菌鏈球菌如乳鏈球菌葡萄球菌如金黃色葡萄球菌球菌形態(tài)第19頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三

短桿菌長桿菌梭狀芽孢桿菌桿菌形態(tài)單桿菌鏈狀桿菌桿菌細(xì)胞兩端的形態(tài)特征第20頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三弧菌螺旋菌螺旋體螺旋菌形態(tài)第21頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三特殊形態(tài)第22頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三異常形態(tài)第23頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三細(xì)菌大小細(xì)菌大小的測(cè)定：(1)測(cè)量：測(cè)微尺(2)長度單位：微米(μm)(3)表示：球菌：直徑桿菌：寬×長螺菌：寬、長、螺距第24頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三細(xì)菌的大小第25頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)陰性菌陽性菌革蘭氏染色法第26頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三芽孢染色法細(xì)菌芽孢的各種類型芽孢的在細(xì)胞中的位置第27頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三鞭毛染色法鞭毛的著生方式第28頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三莢膜染色法第29頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三（二）形態(tài)結(jié)構(gòu)酵母的形態(tài)結(jié)構(gòu)酵母的基本形態(tài)酵母大小酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)（染色觀察）第30頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三（二）形態(tài)結(jié)構(gòu)放線菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)放線菌的基本結(jié)構(gòu)鏈霉菌孢子絲形態(tài)第31頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三第32頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三分生孢子的形成過程第33頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三第34頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三（二）形態(tài)結(jié)構(gòu)第35頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三第36頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三第37頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三第38頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三二、微生物生理生化檢驗(yàn)碳水化合物代謝試驗(yàn)蛋白質(zhì)類代謝試驗(yàn)有機(jī)鹽類試驗(yàn)酶類試驗(yàn)其他生化試驗(yàn)第39頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三（一）碳水化合物代謝試驗(yàn)糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn)葡萄糖氧化／發(fā)酵試驗(yàn)（O/F試驗(yàn)）β-半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG試驗(yàn)）七葉苷水解試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)V-P試驗(yàn)第40頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn)方法原理：

多糖－→單糖－→丙酮酸－→酸性產(chǎn)物(或產(chǎn)酸產(chǎn)氣)－→pH↓－→指示劑呈酸性變色（若產(chǎn)氣者有氣泡出現(xiàn)）培養(yǎng)基指示劑

酚紅（pH：6.8~8.4）色澤變化（酸~堿：黃~紅）

第41頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三方法

將純種細(xì)菌以無菌操作接種到含有指示劑的培養(yǎng)基中，置35℃溫箱培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至兩周，觀察結(jié)果。↗傷寒沙門菌↖甲型副傷寒第42頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果第43頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三應(yīng)用：

主要用于腸桿菌科的鑒定。第44頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三原理：細(xì)菌分解葡萄糖對(duì)O2需求不同，氧化型：細(xì)菌只在有氧環(huán)境中分解葡萄糖；發(fā)酵型：細(xì)菌可在有氧、無氧環(huán)境中分解G;產(chǎn)堿型：細(xì)菌在有氧、無氧環(huán)境中都不分解葡萄糖;葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗(yàn)第45頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三方法：

取2支HL葡萄糖培養(yǎng)管煮沸，待冷后接種菌種。一管管口敞開，一管用液體石蠟封管，培養(yǎng)18~24h觀察結(jié)果。葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗(yàn)方法

大腸桿菌銅綠假單胞菌糞產(chǎn)堿桿菌第46頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果兩管均分解葡萄糖大腸桿菌發(fā)酵型開管分解葡萄糖封閉管不分解葡萄糖氧化型銅綠假單胞菌開管、封管均不分解葡萄糖

糞產(chǎn)桿菌產(chǎn)堿型第47頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三應(yīng)用：

主要用于革蘭陰性桿菌的鑒別。葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗(yàn)第48頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三原理：有β-半乳糖苷酶的細(xì)菌，可以分解鄰硝基酚β-半乳糖苷(ONPG),而釋放黃色的鄰硝基酚。應(yīng)用：常用于遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌的快速鑒定。

β-半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG）第49頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三β-半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG）方法方法：

取新鮮細(xì)菌一環(huán)，加人到0.25ml的無菌生理鹽水中，加甲苯一滴充分振動(dòng)，37℃、5min，再加入無色ONPG溶液0.25ml，置37℃水浴，懸液變黃則為陽性。。第50頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三β-半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG）結(jié)果

陰性陽性第51頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三原理：

七葉苷可以被細(xì)菌分解為葡萄糖和七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的Fe2+反應(yīng)，形成黑色化合物，使培養(yǎng)基變黑。七葉苷水解試驗(yàn)應(yīng)用：

主要用于D群鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。

第52頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三方法：

將待檢菌接種于七葉苷培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。

七葉苷水解試驗(yàn)方法第53頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三甲基紅試驗(yàn)原理：

細(xì)菌分解培養(yǎng)基中的葡萄糖→丙酮酸→大量混合酸→培養(yǎng)基pH↓4.4以下→甲基紅試劑→培養(yǎng)基變紅。應(yīng)用：

主要用于大腸和產(chǎn)氣腸桿菌鑒定。

第54頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三方法：

將待檢菌種接種于葡萄糖蛋白胨水中,35℃培養(yǎng)6～18小時(shí)后,往培養(yǎng)基中加入甲基紅指示劑少許,觀察結(jié)果。甲基紅試驗(yàn)空白對(duì)照陰性陽性第55頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三原理：

某些細(xì)菌分解糖類→丙酮酸→繼續(xù)脫羧→乙酰甲基甲醇（堿性）→空氣氧化→雙乙酰+α-萘酚、肌酸→紅色化合物。V-P試驗(yàn)應(yīng)用：

主要用于鑒別大腸和產(chǎn)氣腸桿菌。第56頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三V-P試驗(yàn)方法：

將待檢菌種接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)48h后按每毫升培養(yǎng)基加入0.1ml含2％肌酸或肌酐的40％KOH溶液,數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)后觀察結(jié)果?？瞻讓?duì)照陰性陽性第57頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三（二）蛋白質(zhì)類代謝試驗(yàn)靛基質(zhì)試驗(yàn)硫化氫試驗(yàn)苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)?zāi)蛩孛冈囼?yàn)第58頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三原理：

含有色氨酸酶的細(xì)菌，能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，吲哚能與對(duì)二甲氨基苯甲醛作用，形成紅色玫瑰吲哚。吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)應(yīng)用：

主要用于腸桿菌科中產(chǎn)氣腸桿菌與大腸埃希菌的鑒別，常與MR試驗(yàn)聯(lián)用。第59頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)方法：

將待檢菌接種于胰蛋白胨水中，35℃培養(yǎng)24～48h，取出后沿試管壁緩慢加入靛基質(zhì)試劑數(shù)滴，在兩液面觀察結(jié)果。第60頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三硫化氫試驗(yàn)原理：

有些細(xì)菌能分解含硫氨基酸，產(chǎn)生H2S與培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽發(fā)生反應(yīng)，生成黑色的硫化鉛或硫化亞鐵沉淀。

應(yīng)用：

腸桿菌科的屬間鑒定第61頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三方法：

將細(xì)菌穿刺接種到醋酸鉛培養(yǎng)基中，35℃、24～48h，觀察結(jié)果。硫化氫試驗(yàn)第62頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)原理：

有苯丙氨酸脫氨酶的細(xì)菌，可以使苯丙氨酸脫氨形成苯丙酮酸，苯丙銅酸與三氯化鐵作用形成綠色化合物。應(yīng)用：多用于腸桿菌科的鑒定。第63頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)方法：瓊脂斜面法：將待檢細(xì)菌接種到苯丙氨酸瓊脂斜面上，35℃培養(yǎng)24～48h，取出，將三氯化鐵試劑4～5滴滴于斜面上，觀察結(jié)果?？焖偌埰ǎ簩⒋龣z菌涂于苯丙氨酸紙片上，孵育15min，取出，滴加三氯化鐵試劑，立即觀察結(jié)果。

綠色陽性黃色陰性第64頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三原理：

產(chǎn)生尿素酶的細(xì)菌,能分解尿素產(chǎn)生氨和CO2,氨在溶液中形成碳酸銨，使培養(yǎng)基變堿，酚紅指示劑變紅。尿素分解試驗(yàn)應(yīng)用：

腸桿菌科屬間鑒別。第65頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三方法：

將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24h取出觀察。對(duì)照陽性陰性尿素分解試驗(yàn)第66頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)（三）有機(jī)鹽類試驗(yàn)第67頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)原理：

能利用枸櫞酸鹽的細(xì)菌，也能利用銨鹽作為唯一的碳源，分解后生成碳酸鈉和氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使指示劑溴麝香草酚藍(lán)由淺綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。應(yīng)用：

主要用于腸桿菌科屬間的鑒別。第68頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)方法：

將待檢菌接種于含有枸櫞酸鹽和銨鹽的西蒙和柯氏培養(yǎng)基培養(yǎng)18～24h后，觀察結(jié)果。藍(lán)色為陽性綠色為陰性第69頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三原理：

使硝酸鹽還原的細(xì)菌能從硝酸鹽中獲得氧，使其成為亞硝酸鹽或其它還原物。培養(yǎng)基中的亞硝酸基能與α-萘氨和苯磺酸形成紅色的N-α-萘氨偶氮苯磺酸。若出現(xiàn)紅色現(xiàn)象則說明該菌還原硝酸鹽。

硝酸鹽還原試驗(yàn)應(yīng)用：

有助于鑒別腸桿菌科、嗜血桿菌屬、奈瑟菌屬、布蘭漢菌屬、假單胞菌屬等第70頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三方法：

取一環(huán)待檢菌接種到硝酸鹽瓊脂斜面上，35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，然后依次加入含α-萘氨和對(duì)氨基苯磺酸的試劑各1mL，30s后觀察結(jié)果。硝酸鹽還原試驗(yàn)紅色為陽性無色為陰性第71頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三（四）酶類試驗(yàn)細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)過氧化氫酶試驗(yàn)?zāi)堂冈囼?yàn)第72頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三原理：

某些細(xì)菌具有細(xì)胞色素氧化酶，能將二甲基對(duì)苯二胺或四甲基對(duì)苯二胺試劑氧化成紫紅色醌類化合物。氧化酶試驗(yàn)應(yīng)用：用于科別鑒定試驗(yàn)第73頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三方法：

濾紙法：用潔凈濾紙蘸取菌落，加一滴試劑，觀察結(jié)果菌落法：直接在菌落上加試劑，觀察結(jié)果紙片法：使用試劑浸泡制成的試劑紙片，取足夠的菌落，觀察結(jié)果。氧化酶試驗(yàn)第74頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三濾紙法：陽性結(jié)果紙片法：陽性、陰性結(jié)果氧化酶試驗(yàn)第75頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三原理：

有觸酶的細(xì)菌能催化過氧化氫生成水和初生態(tài)氧，繼而形成氧分子出現(xiàn)氣泡。觸酶試驗(yàn)應(yīng)用：用于革蘭陽性球菌初步分屬。第76頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三觸酶試驗(yàn)方法：用接種環(huán)取備檢菌少許，置于潔凈的玻片上，滴加3%的過氧化氫1～2滴，觀察結(jié)果。試管法：用潔凈的玻棒蘸取待檢菌少許，置于裝有3%過氧化氫的試管內(nèi)，觀察結(jié)果。第77頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三血漿凝固酶試驗(yàn)原理：

有些細(xì)菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可以使人和動(dòng)物血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白，從而使血漿凝固。應(yīng)用：

主要用于金葡菌的鑒定。第78頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三血漿凝固酶試驗(yàn)方法：玻片法：取潔凈玻片一張，加生理鹽水兩小滴于玻片兩端，用接種環(huán)挑取待檢菌落和對(duì)照菌均勻涂于鹽水中，制成濃菌液，加兔或人血漿一滴于菌液中，觀察結(jié)果。試管法：于3支試管中分別加入1:4稀釋的血漿0.5ml，1支管加入待檢菌肉湯培養(yǎng)物0.5ml,另兩支分別加陰陽性對(duì)照菌肉湯培養(yǎng)物0.5ml，35℃培養(yǎng)3～4h后觀察結(jié)果。第79頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三血漿凝固酶試驗(yàn)第80頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三（五）其他試驗(yàn)?zāi)懼芫囼?yàn)CAMP試驗(yàn)氫氧化鉀拉絲試驗(yàn)第81頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三原理：

膽鹽、取氧膽酸鈉和硫磺膽酸鈉能選擇性地溶解肺炎鏈球菌，其它鏈球菌則能耐受這些試劑。膽汁溶菌試驗(yàn)應(yīng)用：

主要用于肺炎鏈球菌與甲型鏈球菌。第82頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三方法：平板法：取膽酸鈉溶液一環(huán)，放在平板的菌落上，35℃30min觀察結(jié)果。試管法：于0.9ml培養(yǎng)了18～24小時(shí)的菌液中，加入取氧膽酸鈉試劑0.1ml或牛膽鹽0.2ml混勻，37℃水浴10～30min，觀察結(jié)果。。膽汁溶菌試驗(yàn)第83頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三CAMP試驗(yàn)原理：

B群鏈球菌能產(chǎn)生一種胞外因子—CAMP,它能增強(qiáng)金黃色葡萄球菌β-溶血毒素的活性，因此，在兩菌交界處出現(xiàn)箭頭樣的溶血增強(qiáng)區(qū)。應(yīng)用：

用于鑒定B群鏈球菌。第84頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三方法：

取血平板一塊，用產(chǎn)生β-溶血毒素的金葡菌在中央劃一道線，將待檢菌據(jù)此線0.5cm處垂直劃線。35℃18~24小時(shí)培養(yǎng)，觀察結(jié)果。CAMP試驗(yàn)第85頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三三、微生物血清學(xué)檢驗(yàn)血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。在微生物檢驗(yàn)中，常用血清學(xué)反應(yīng)來鑒定分離到的細(xì)菌，以最終確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。第86頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三經(jīng)典的免疫學(xué)反應(yīng)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)中和反應(yīng)第87頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三凝集反應(yīng)顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)（Agglutinationreaction）。直接凝集反應(yīng)玻片凝集法：痢疾桿菌的檢測(cè)試管凝集法：傷寒、付傷寒桿菌的檢測(cè)間接凝集反應(yīng)第88頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三沉淀反應(yīng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時(shí)間，形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)（Precipitation）。液相沉淀反應(yīng)絮狀試驗(yàn)環(huán)狀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀反應(yīng)擴(kuò)散試驗(yàn)免疫電泳技術(shù)第89頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三液相內(nèi)沉淀反應(yīng)絮狀沉淀反應(yīng)環(huán)狀沉淀反應(yīng)++——抗血清抗原抗原抗體第90頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三凝集內(nèi)沉淀反應(yīng)免疫擴(kuò)散技術(shù)免疫電泳技術(shù)單向擴(kuò)散試驗(yàn)雙向擴(kuò)散試驗(yàn)火箭電泳對(duì)流電泳免疫電泳第91頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三第92頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(Complementfixationreaction)是在補(bǔ)體參與下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。待檢系統(tǒng)指示系統(tǒng)補(bǔ)體待檢系統(tǒng)指示系統(tǒng)（不溶血）補(bǔ)體消耗第93頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三中和反應(yīng)細(xì)菌外毒素或病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合所致的中和反應(yīng)第94頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三美國細(xì)菌學(xué)家Salmon與Smith于1885年分離出豬霍亂沙門菌。1990年為紀(jì)念Salmon，定名這類細(xì)菌為沙門菌屬。沙門菌是腸桿菌科的重要致病菌。包括傷寒、副傷寒甲、乙、丙型，腸炎，鼠傷寒等沙門菌，現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)2324個(gè)血清型。四、沙門菌檢測(cè)（一）沙門菌特性第95頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三生物學(xué)特性形態(tài)

兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌，（0.4-0.9）μm

×(1-3)μm，無芽孢，周生鞭毛，一般無莢膜，少數(shù)有包膜。光滑型的細(xì)菌大小均勻，粗糙型則大小不一，長短不一。第96頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三培養(yǎng)特性在營養(yǎng)瓊脂平板上18-24h培養(yǎng)形成無色半透明，表面光滑、濕潤、隆起的菌落，直徑2-3mm。有些菌株在營養(yǎng)瓊脂平板上生長不良，形成“侏儒”菌落，加葡萄糖或甘油，生長良好，但易使菌株粗糙,呈干燥、無光澤、邊緣不整齊。光滑型菌在肉湯中無菌膜、無沉淀；粗糙型則產(chǎn)生沉淀，上層液透明。生長溫度在10-42℃，最適38℃；pH4.5-9，最適pH6.8-7.8；需氧或兼性厭氧。第97頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三生化特性靛基質(zhì)-，甲基紅+，v-p-，檸檬酸鹽反應(yīng)d，產(chǎn)硫化氫，尿素酶反應(yīng)-，還原硝酸鹽，?-葡萄糖醛酸苷酶d，不能發(fā)酵乳糖，可以被噬菌體裂解。第98頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三

抗原結(jié)構(gòu)（1）抗原構(gòu)造菌體抗原（o）：不被乙醇、0.1%石炭酸所破壞。與特異性抗血清呈顆粒狀凝集，形成慢，不易搖散。表面抗原（K抗原）：沙門菌中有三種K抗原，即Vi抗原、M抗原和5抗原?？勺柚筄抗原被抗O血清所凝集，具有O不凝集性。常用于菌型鑒定。M抗原：粘液抗原，在菌型鑒定上無特殊意義。5抗原：第99頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三鞭毛抗原（H抗原）：經(jīng)乙醇或酸處理后失去與特異性抗體的結(jié)合力。制備時(shí)，應(yīng)用具有豐滿鞭毛的菌種18-24h的培養(yǎng)物，加甲醛固定或60℃以下加熱后即成H抗原。H抗原與抗H血清56℃2h后，可出現(xiàn)疏松易于搖散的絮狀凝集。

抗原結(jié)構(gòu)第100頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三

沙門菌的H抗原有兩相，特異性高的稱為第1相（特異相）抗原；特異性低的稱為第2相（非特異相）抗原；多數(shù)沙門菌同一菌株，?？煞蛛x出兩種H抗原的菌落，菌落的外觀性狀完全一樣，但與相應(yīng)抗體作凝集反應(yīng)時(shí)則明顯不同。具有兩相抗原的稱為雙相菌，僅有一相抗原的則稱為單相菌。

抗原結(jié)構(gòu)第101頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三菌量大活菌和菌體內(nèi)毒素協(xié)同作用小腸和結(jié)腸里繁殖，侵入粘膜，由淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液潛伏期8-48h急性期，每克糞便中沙門菌多至10億個(gè)

發(fā)病機(jī)理和癥狀第102頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三食物中毒的特征性癥狀腹瀉惡心腹痛低燒和寒顫有時(shí)嘔吐、頭痛、倦怠傷寒的典型癥狀持續(xù)發(fā)熱39-40℃昏睡癥劇烈腹痛（腹部痙攣）頭痛食欲不振出現(xiàn)扁平的玫瑰紅色點(diǎn)狀紅疹第103頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三供試品供試液預(yù)增菌增菌DHLS.SEMBMaCCTSI（三糖鐵瓊脂）氰化鉀賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)?zāi)蛩孛冈囼?yàn)吲哚試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)半固體營養(yǎng)瓊脂革蘭染色、鏡檢報(bào)告沙門菌常規(guī)檢查法（二）沙門菌檢驗(yàn)程序第104頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三預(yù)增菌將供試液接種在無選擇性增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使受損傷的細(xì)菌得以修復(fù)，然后再轉(zhuǎn)接至增菌培養(yǎng)基中。一般在營養(yǎng)肉湯中。但美、英、日、歐均選用乳糖肉湯作預(yù)增菌液。以1：10的比例接種，18-24h,35-37℃。第105頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三預(yù)增菌培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基商品緩沖蛋白胨水（BPW）使用于所有商品BPW+酪蛋白巧克力乳糖肉湯蛋和蛋制品，火腿，pH〉6的著色食品乳糖肉湯+表面活性劑7或曲拉通X-100椰肉，肉，干燥或加工過的動(dòng)物食品乳糖肉湯+0.5%凝膠酶凝膠脫脂乳+亮綠巧克力，糖，糖衣胰蛋白胨大豆肉湯香料、香草、干酵母胰蛋白胨大豆肉湯+0.5%硫酸鉀洋蔥和蒜粉等水+亮綠奶粉第106頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三選擇性增菌取1mL預(yù)增菌液轉(zhuǎn)種至增菌培養(yǎng)基10mL。37℃24h，培養(yǎng)基可采用亞硒酸鹽胱氨酸肉湯培養(yǎng)基或四硫磺酸鹽煌綠肉湯培養(yǎng)基，我國與英國相同采用后者。美、日采用二者聯(lián)用有助于提高沙門菌的檢出率。第107頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三分離培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)基：DHL：無色半透明，產(chǎn)硫化氫的菌落中心黑色或全黑，乳糖陽性菌株粉紅色、中心黑色HE：藍(lán)綠或藍(lán)色，產(chǎn)硫化氫的菌落中心黑色或全黑，乳糖陽性菌株黃色、中心黑色SS：無色半透明，產(chǎn)硫化氫的菌落中心黑色或全黑，乳糖陽性菌株粉紅色、中心黑色第108頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三分離沙門菌應(yīng)以出現(xiàn)單個(gè)菌落為準(zhǔn)，否則應(yīng)重新分離。由于平板用前未烘干，或因分離不良菌落連片均須重新分離。致病菌菌落一般在經(jīng)36℃24h培養(yǎng)后，再放置室溫2-3天后不發(fā)生變化，而非致病菌則繼續(xù)增生、增厚，并帶黃灰色，并產(chǎn)生臭味。對(duì)可疑菌落可放置室溫觀察幾天，再?zèng)Q定取舍第109頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三(1)初步鑒別試驗(yàn)：三糖鐵瓊脂

乳糖:蔗糖:葡萄糖=10:10:1以酚紅作指示劑當(dāng)待檢菌發(fā)酵乳糖或蔗糖時(shí)，產(chǎn)酸量多，使整個(gè)培養(yǎng)基均呈黃色；如僅發(fā)酵葡萄糖，則產(chǎn)酸少，斜面由于細(xì)菌生長分解蛋白胨而釋放氨，酚紅顯堿性紅色、而底層黃色細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)基中硫代硫酸鈉或硫酸鈉、亞硫酸鈉的還原作用，生成硫化氫。硫化氫遇硫酸亞鐵或檸檬酸鐵銨產(chǎn)生不溶性黑色硫化亞鐵。生化試驗(yàn)第110頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三斜面紅色、底層黃色，出現(xiàn)部分黑色或全部黑色斜面紅色、底層黃色，無黑色斜面、底層均黃色，出現(xiàn)部分黑色或全部黑色

除沙門菌外，變形桿菌、檸檬酸鹽菌、志賀菌等也可出現(xiàn)上述反應(yīng)。吲哚試驗(yàn)：陰性第111頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三志賀氏菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)生H2S。大腸桿菌，能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大多數(shù)能分解乳糖，不產(chǎn)生H2S。沙門氏菌，能分解葡萄糖，不發(fā)酵乳糖、蔗糖，大多數(shù)產(chǎn)生H2S，多數(shù)產(chǎn)氣。下面照片所示2-3-4，可能是大腸桿菌、沙門氏菌還是志賀氏菌？第112頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三第113頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三（2）賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)純培養(yǎng)菌落賴氨酸脫羧酶產(chǎn)酸含糖蛋白胨培養(yǎng)基溴甲酚紫產(chǎn)堿(尸胺)

CO2對(duì)照為黃色,陽性為紫色培養(yǎng)時(shí)間不超過四天傷寒和雞沙門菌除外，均為陽性含糖蛋白胨培養(yǎng)基紫色第114頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三(3)尿素酶試驗(yàn)區(qū)別變形桿菌具有尿素酶的細(xì)菌分解培養(yǎng)基中的尿素，產(chǎn)生氨，培養(yǎng)基堿性，使酚紅變紅。沙門菌反應(yīng)陰性

注意：用無尿素的培養(yǎng)基作對(duì)照

第115頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三(4)氰化鉀試驗(yàn)沙門菌、志賀菌和埃希菌的生長受KCN抑制。KCN濃度為1：13300或1：10000。沙門菌此反應(yīng)陰性。待檢菌新鮮培養(yǎng)物KCN培養(yǎng)基36℃48h不生長鐵卟啉呼吸酶失活注意：氰化鉀的濃度控制接種量試管封口嚴(yán)密操作謹(jǐn)慎用后的培養(yǎng)管加硫酸亞鐵和氫氧化鉀去毒對(duì)照不加KCN第116頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三第117頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三動(dòng)力檢查沙門菌周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。豬霍亂沙門氏菌（S.gallinarum）和雞白痢沙門氏菌（S.pullorum）沒有運(yùn)動(dòng)性第118頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三血清學(xué)凝集試驗(yàn)（1）沙門菌屬診斷血清診斷血清規(guī)格：10種1套：主要供傷寒、副傷寒沙門菌初步診斷用。包括Vi及A-F群多價(jià)血清各1種；O因子血清4種；H因子血清4種26種1套：主要供沙門菌常見菌型定群和初步定型用。包括Vi及A-F群多價(jià)血清各1種；O因子血清9種；H因子血清15種第119頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三57種1套：主要供沙門菌常見菌型定型用。包括Vi及A-F群多價(jià)血清各1種；O因子血清16種；O復(fù)合因子血清各1種；H因子血清31種；H復(fù)合因子血清3種144種全套：供各型沙門菌診斷用。包括診斷各型沙門菌用的各種多價(jià)O、多價(jià)H血清和單因子及復(fù)合因子血清第120頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三

群別菌種名稱O抗原成分A甲型副傷寒杜雷佐變種(S.paraTyphiA)2,12B里丁沙門菌(S.reading)4,12C1豬霍亂沙門菌1350(S.cholerae-suis)6,7C2新港(紐波特)沙門菌(S.newport)6,8D1傷寒沙門菌0901(S.typhi)9,12E倫敦沙門菌(S.London)3,10F阿伯丁沙門菌(S.aberdeen)11A-F群O多價(jià)血清的代表菌株根據(jù)沙門菌菌型調(diào)查結(jié)果，95%以上的沙門菌都屬于A-F六個(gè)O群，常見菌型不過20個(gè)左右，因此沙門菌檢驗(yàn)，主要是對(duì)A-F群沙門菌做出初步鑒定。按常規(guī)方法選用A-F群多價(jià)O血清。第121頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三凝集試驗(yàn)方法二者比例適當(dāng)，菌量過多過少均不易觀察到正確結(jié)果。陽性反應(yīng)通常在3min內(nèi)發(fā)生。血清效價(jià)低反應(yīng)遲緩時(shí)，應(yīng)將玻片置培養(yǎng)皿內(nèi)，放一個(gè)濕棉球，蓋上皿蓋，經(jīng)約20min再觀察結(jié)果。出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的待檢菌培養(yǎng)物，應(yīng)以滅菌的生理鹽水溶液代替A-F多價(jià)O血清，與培養(yǎng)物混勻做對(duì)照試驗(yàn)，對(duì)照應(yīng)無凝集現(xiàn)象，方可判為陽性反應(yīng)。A-F多價(jià)O血清稀釋接種環(huán)沾取2-3環(huán)1.5cm×0.5cm條形涂抹待檢菌36℃

18-24h接種環(huán)刮取少許混勻第122頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三待檢菌在生理鹽水溶液中產(chǎn)生凝集，稱自家凝集現(xiàn)象，這種現(xiàn)象多為S-R所致。當(dāng)A-F多價(jià)O血清凝集試驗(yàn)為陰性時(shí)，還應(yīng)當(dāng)考慮是否因?yàn)榇龣z菌含有Vi抗原所致。第123頁，講稿共134頁，2023年5月2日，星期三結(jié)果判斷及報(bào)告（1）生化試驗(yàn)符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬A-F多價(jià)O血清凝集試驗(yàn)陽性反應(yīng)，做出供試品檢出沙門菌報(bào)告。（2）生化試驗(yàn)不符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌