抗原與抗體的相互作用及免疫學檢測

關(guān)于抗原與抗體的相互作用及免疫學檢測第1頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三體液免疫的基礎(chǔ)是抗原和抗體分子的結(jié)合，這種結(jié)合可以是游離形式的，也可以結(jié)合在細胞表面。通過抗原抗體的結(jié)合繼發(fā)出各種生理效應，如：溶細胞效應、促吞噬作用、凝集作用、沉淀作用、調(diào)節(jié)作用等，形成一整套機體體液免疫功能。抗原決定簇與抗體結(jié)合部位的結(jié)合，要求分子結(jié)構(gòu)有互補性，也因此具有高度的特異性。第2頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第一節(jié)抗原與抗體反應的特點一、特異性抗原與抗體相互結(jié)合只局限于一些大分子表面的特定部位，即抗原決定簇和抗體結(jié)合位點之間，且以親和力的作用方式結(jié)合在一起?？乖贵w的結(jié)合并沒有共價鍵形成，而是由這些特定部位之間的短程分子力相互作用的結(jié)果。這些吸引力只有在極短的距離內(nèi)才有效。因此抗原決定簇與抗體結(jié)合位點在空間上必須處于緊密接觸狀態(tài)，才能產(chǎn)生足夠的結(jié)合力。這種分子間的互補結(jié)構(gòu)決定了抗原抗體結(jié)合的專一性。第3頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三抗原抗體分子間的作用力，即親和力包括以下幾種：1、鹽鍵（離子鍵）2、范德華力3、疏水作用4、氫鍵第4頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三二、抗原與抗體結(jié)合的可逆性抗原抗體的結(jié)合反應是一個可逆的反應Ab+AgAb:Ag

由于抗原抗體結(jié)合的可逆性，可利用親和層析法分離純化抗原或抗體；利用待測抗原和標準抗原與抗體的競爭結(jié)合，進行抗原或抗體的定量測定，如放免檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法等第5頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三三、抗原與抗體反應中量的關(guān)系當抗體與抗原結(jié)合時，如果是顆?？乖?，則出現(xiàn)凝集現(xiàn)象；如果是可溶性抗原，則產(chǎn)生沉淀作用。這些可見現(xiàn)象的出現(xiàn)是以抗原與抗體反應特異性和親和力為基礎(chǔ)的，同時也是抗原抗體反應的繼發(fā)過程。當抗原與同型抗體相遇時，在合適條件下，不論彼此量的多少，都立即發(fā)生特異性的結(jié)合形成抗原抗體復合物，這一過程通常只需要幾秒的時間便可完成，稱為反應的一級階段。第6頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

在一級階段之后，繼發(fā)出現(xiàn)抗原與抗體間進一步交聯(lián)而形成網(wǎng)絡(luò)狀凝集物，進而出現(xiàn)可見的凝集和沉淀，稱為反應的二級階段。這一階段是抗原抗體網(wǎng)格生長的階段，速率要慢的多，且在很大程度上依賴于溫度、離子強度等外界條件，但更重要的是需要合適的抗原抗體分子比例。只有當二者的結(jié)合價彼此飽和時，才能連接成一個大網(wǎng)格樣凝集物，出現(xiàn)凝集或沉淀。第7頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第8頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三抗原抗體凝集（沉淀）反應形成的特點：1、抗原結(jié)合價必須在2價以上；2、抗體結(jié)合價也必須是2價或2價以上；3、抗原抗體能形成復合物但不一定能形成沉淀；4、抗原抗體結(jié)合形成大分子凝集物的前提是要求其結(jié)合價彼此飽和；5、當抗原大大過量時，只有溶解狀態(tài)的抗原抗體復合物，而無沉淀出現(xiàn)，在免疫檢測中稱為前帶現(xiàn)象。第9頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第二節(jié)抗血清的制備和抗體的純化

抗體產(chǎn)生的特異免疫應答是指機體受外源物質(zhì)刺激后，產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫的過程。在這一免疫應答過程中，除依賴于抗原物質(zhì)有特定的化學結(jié)構(gòu)外，還依賴于動物機體的免疫應答能力。機體免疫應答能力又受遺傳因素的控制及機體的生理狀況、抗原物質(zhì)進入機體的途徑和佐劑的使用等因素的影響。由于動物的遺傳性不同，同一抗原對不同種動物、同種不同品系甚至不同個體，產(chǎn)生免疫應答的強弱是不同的。因此，在進行動物免疫時，必須選擇對該抗原敏感的動物，而且必須是年輕的、健康的。常用的動物有馬、羊、兔、鼠和豚鼠。第10頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

當抗原初次進入具有應答能力的動物體內(nèi)后，經(jīng)過一段較長的潛伏期才出現(xiàn)抗體，又經(jīng)過一段高峰期后，抗體量逐漸下降直至消失。這段時間總的抗體量是較低的，主要成分是IgM，此為機體對抗原的初次反應。但當抗原再次進入該機體時，血清中抗體很快出現(xiàn)，含量也遠高于初次反應，其抗體成分主要是IgG，此為再次反應。第11頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三佐劑在抗血清制備中的作用：由于佐劑有吸附和包埋抗原的“儲藏所”作用，延長了抗原在體內(nèi)的存留時間，便于抗原較長時間的、不間斷的刺激機體免疫系統(tǒng)，使初次反應與再次反應結(jié)合在一起，其免疫效果更為理想。另外，在佐劑中含有激活巨噬細胞等生理功能的卡介苗類物質(zhì)，可提高抗原的免疫原性，因此要獲得高效價的抗血清，常使用各種類型的佐劑。第12頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

動物個體的不同組織部位對抗原刺激的敏感性也是不同的。淋巴結(jié)、脾臟、足掌、眼瞼結(jié)膜等是反應敏感部位，也是免疫動物的常用部位。第13頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三一、動物的免疫1、抗原用量：0.5mg/kg2、佐劑：弗氏佐劑弗氏佐劑的成分和使用3、免疫方法：淋巴結(jié)注射、腹部皮下注射、四足掌皮內(nèi)注射。4、免疫次數(shù)：每隔7-10天免疫一次，共需3-4次。第二次免疫后開始測效價。第14頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三二、抗血清制備和抗體效價測定1、采血方法：兔頸動脈放血、兔心臟取血、兔耳緣靜脈放血、鼠心臟取血、剪尾采血、眼窩采血。2、抗血清制備：血液室溫放置1-2h或冰箱內(nèi)4度過夜，血清便可充分析出，用滴管吸出或離心分離取得。分離好的血清加入0.02%疊氮化鈉，在4度冰箱內(nèi)保存可長達半年。3、效價測定：用免疫動物時的抗原濃度作抗體效價測定的抗原濃度。以出現(xiàn)沉淀反應的抗血清的最大稀釋倍數(shù)來表示抗血清的效價。第15頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三三、免疫球蛋白的純化

由于抗原抗體的結(jié)合具有高度的特異性，在免疫檢測中常常直接運用抗血清進行，而無需對抗體進行純化。隨著免疫檢測技術(shù)的發(fā)展，如用鐵蛋白、膠體金等標記抗體作免疫電鏡觀測，用熒光素、酶、同位素標記抗體作組織細胞染色，或?qū)乖M行定量測定，就必須對抗體進行純化，但這類的純化多數(shù)是類別的純化。第16頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三抗體純化的方法：1、硫銨鹽析法：簡便、蛋白質(zhì)變性較少，33%飽和度的硫銨可以沉淀所有各類免疫球蛋白；缺點是分離的純度較差，對IgA類抗體來說，濃鹽可使其形成二聚體，不宜采用。第17頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三2、Cohn冷酒精沉淀法：第18頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三IgA相對分子量160000，IgM相對分子量1000000，故可通過分子篩將兩者分開而得到純品。第19頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三3、硫銨鹽析和DEAE-纖維素柱層析法純化IgG

在pH7.5的溶液中IgG帶正電，其他血清蛋白帶負電，因此陰離子交換劑DEAE-纖維素可以一次將IgG提純到很高的純度第20頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三4、IgM的純化方法：18%飽和度硫銨沉淀+DEAE-纖維素柱層析法。第21頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第三節(jié)抗原與抗體反應-免疫檢測法

抗原與抗體結(jié)合后，只有出現(xiàn)可見的反應，如凝集、溶血、沉淀實驗等，或用熒光素、酶、放射性同位素等標記方法提高可測性，才便于在免疫檢測中運用。可見性反應的出現(xiàn)，對抗原抗體分子合適比例的要求遠比對彼此絕對量方面要高得多。這就是說，一方面在進行免疫檢測時要注意抗原抗體的用量；另一方面只要提高可見度或可測性，便可大大提高免疫檢測方法的靈敏度。第22頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三一、凝集反應

凝集反應是指顆粒抗原與相應抗體結(jié)合反應出現(xiàn)的可見性現(xiàn)象。顆?？乖缤暾募毦⒓t細胞等與相應抗體相混合，在一定條件下出現(xiàn)凝集。凝集反應中抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。第23頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三二、沉淀反應

當抗原是可溶性分子時，與抗體結(jié)合則形成沉淀。1、絮狀沉淀反應一系列試管中加入等量的抗體和遞增量的抗原，在中性條件下37度保溫1-2h，便可見到絮狀的蛋白質(zhì)沉淀。可用于尋找抗原抗體反應的合適比例，檢測抗原抗體的分子比。2、環(huán)狀沉淀反應在試管中加入抗體后，小心加入相應抗原，使抗原抗體步混合，37度保溫10-20min，在二者界面上出現(xiàn)環(huán)狀沉淀。不能用于定量測定。第24頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三3、雙向擴散：又稱瓊脂擴散，是利用瓊脂凝膠作介質(zhì)的一種沉淀反應。瓊脂是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可使大分子物質(zhì)通過，分子的擴散作用使分別兩處的抗原抗體相遇，比例合適時形成沉淀。可觀測到沉淀弧。沉淀弧的特征與位置取決于抗原分子的大小、結(jié)構(gòu)、擴散系數(shù)和濃度等。當抗原、抗體存在多種體系時，會出現(xiàn)多條沉淀弧。第25頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三雙向擴散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在顯微鏡用的載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測定抗體效價，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測抗原的存在和定性抗原。第26頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

抗原抗體為單一體系時，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同：抗原抗體為多體系時，出現(xiàn)的沉淀弧有多條，彼此互不干擾。第27頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三4、單向免疫擴散：又稱單向瓊脂擴散，是定量抗原的一種檢測方法。與雙向擴散不同的是在瓊脂中含有一定量的抗體，孔內(nèi)加入未知量的相應抗原。在37度保溫過程中，孔內(nèi)的抗原向周圍擴散，與抗體形成沉淀圈。根據(jù)沉淀圈的大小確定抗原的含量第28頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

另外還有其他眾多的免疫檢測技術(shù)和手段，其機理都利用了抗原抗體的沉淀反應。例如微量免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳等。只不過其檢測的對象和檢測的目的各有不同。第29頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三三、補體結(jié)合試驗

當抗體與細菌、紅細胞等顆?？乖Y(jié)合并形成抗原抗體復合物后，可結(jié)合補體引起溶菌、溶血效應。用補體結(jié)合試驗既可以測知患者血清中補體的總量，也可以檢測未知抗原或抗體的量。測定人血清補體總量的方法是以綿羊紅血球的溶血為指示。當綿羊紅血球與抗綿羊紅血球結(jié)合后，加患者血清，觀測溶血程度。第30頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

用于測定未知抗原/抗體時，采用兩套系統(tǒng)，一套是待測的抗原抗體系統(tǒng)，稱為檢測系統(tǒng)，一套是包括綿羊紅血球和抗綿羊紅血球抗體的指示系統(tǒng)。待測系統(tǒng)中有無待測得抗原/抗體是利用指示系統(tǒng)中是否出現(xiàn)溶血來判斷。反應的過程是首先加待測得抗原/抗體，反應一段時間后加入補體，在反應一段時間后加指示系統(tǒng)。有待測抗原抗體結(jié)合時，必然結(jié)合補體，不會出現(xiàn)溶血，沒有待測物質(zhì)時出現(xiàn)溶血。第31頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第32頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三四、熒光抗體技術(shù)

免疫熒光法是將熒光素與特異性血清抗體以化學方式結(jié)合起來，然后將此熒光標記了的抗體作為一種試劑在特定條件下浸染標本，使與標本中相應的抗原產(chǎn)生結(jié)合反應，再在熒光顯微鏡下，以紫外光為光源進行觀察。當出現(xiàn)熒光時，表明標記抗體存在，相應的抗原也存在。免疫熒光法有直接法和間接法兩種。第33頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第34頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第四節(jié)免疫親和層析

生物高分子具有能和某種相對應的專一分子可逆結(jié)合的特性，例如酶的活性中心或別構(gòu)中心能和專一的底物、抑制劑、輔助因子效應劑通過某些次級鍵相結(jié)合，并在一定條件下又可以解離?？贵w與抗原，激素及其受體，核糖核酸與其互補的脫氧核糖核酸等體系，都具有類似的特性。這種高分子和配基之間形成專一的可解離的復合物的能力稱為親和力。根據(jù)這種具有親和力的生物分子間可逆的結(jié)合和解離的原理發(fā)展起來的層析就稱為親和層析。第35頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三親和層析法的基本過程：1、偶聯(lián)：將欲分離的高分子物質(zhì)的配