細胞增殖活性及原位檢測

細胞增殖活性原位

檢測(jiǎncè)技術(shù)及應(yīng)用重慶(zhònɡqìnɡ)醫(yī)科大學(xué)病理教研室葉秀峰第一頁，共七十四頁。精選ppt細胞周期（CellCycle)一、細胞周期概述概念(gàiniàn)：細胞周期是指連續(xù)分裂的細胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個過程。

主要事件：遺傳信息載體DNA復(fù)制，通過有絲分裂將兩份拷貝DNA平均分配到兩個子代細胞中第二頁，共七十四頁。精選ppt分期(fēnqī)：分為4個時期.即G1SG2M期第三頁，共七十四頁。精選ppt(一)Gl期(Gapphase)是指從有絲分裂完成到DNA復(fù)制之前這一階段，包括．RNAs及蛋白的合成，所以又稱復(fù)制前期或合成前期。這一時期細胞主要活動是為DNA的復(fù)制和蛋白質(zhì)合成作準備，主要特點為：(1)各種細胞的G1期持續(xù)時間變化很大。這可能與細胞在此期增加質(zhì)量有關(guān)。因此，連續(xù)增殖細胞的增殖率是受G1期細胞的平均(píngjūn)時間長度控制的，各種細胞群體之間細胞周期的差異取決于G1期的長短。

第四頁，共七十四頁。精選ppt(2)此期發(fā)生了與DNA合成有關(guān)(yǒuguān)的事件，主要是RNA和蛋白質(zhì)的合成。(3)RNA合成發(fā)生于G1早期，同時RNA聚合酶水平也迅速增高。(4)G1早期合成結(jié)構(gòu)蛋白和酶蛋白等，G1后期合成與DNA復(fù)制有關(guān)的酶類，如胸苷激酶、脫氧核苷酸激酶等，其中DNA聚合酶活性在G1末期至S初期增高最快。(5)蛋白質(zhì)磷酸化增加。組蛋白磷酸化增加使染色體解旋，以利于DNA復(fù)制；非組蛋白磷酸化增加可能與基因的活化有關(guān)。(6)染色體狀態(tài)由凝集轉(zhuǎn)變?yōu)榻饽?，為DNA合成創(chuàng)造條件。(7)細胞膜轉(zhuǎn)運功能增強。第五頁，共七十四頁。精選ppt(二)S期(synthesisphase)即DNA合成期或復(fù)制期，S期主要是DNA合成(自我復(fù)制)、遺傳物質(zhì)從二倍體(2n)到四倍體(4n)的整個過程。其中(qízhōng)主要的生物化學(xué)改變是遺傳物質(zhì)的復(fù)制，即．DNA的復(fù)制及組蛋白、非組蛋白等染色體蛋白的合成。由于每一條染色體復(fù)制成兩條染色單體，在S期末，DNA含量增加一倍。DNA的準確復(fù)制保證了分裂后子細胞遺傳物質(zhì)的平均分配。DNA合成的同時，形成新的染色質(zhì)的另一重要成分組蛋白的合成也同時進行。第六頁，共七十四頁。精選ppt(三)G2期(Gap2phase)指DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始這段時間，這段時間內(nèi)細胞有2套二倍體染色體，所以(suǒyǐ)又稱復(fù)制后期或合成后期。DNA復(fù)制完成后，細胞進入G2期。處于此期的細胞DNA合成已終止，但仍然進行著RNA和一定的蛋白合成，為細胞有絲分裂作準備。第七頁，共七十四頁。精選ppt(四)M期(mitosisphase)即有絲分裂期，細胞在M期進行分裂。M期又分為前期、前中期、中期、后期、末期。M期的末期一結(jié)束，就形成兩個新的子細胞，一次細胞周期即告結(jié)束，細胞就進入下一個細胞周期的G1期。細胞有絲分裂是一個復(fù)雜的過程，必須在DNA復(fù)制完成(wánchéng)后，細胞才能進行有絲分裂。此期細胞呈球形，不很牢固地附在它生長的基質(zhì)上。染色體在此期凝聚后分開，移向細胞兩端，解聚并再形成兩個完整的核，最后通過細胞質(zhì)分裂而結(jié)束M期。第八頁，共七十四頁。精選ppt第九頁，共七十四頁。精選ppt有絲分裂是一個核改組的連續(xù)過程(guòchéng)，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征可分為5個階段：前期(prophase)前中期(earlymetaphase)中期(metaphase)后期(anphase)末期(telophase)第十頁，共七十四頁。精選ppt1．前期這一期主要發(fā)生染色體凝集、分裂極的確定、核仁解體及核膜消失。2.前中期主要變化是紡錘體的形成和染色體排列在赤道面上形成赤道板。3．中期從染色體排列到赤道面上到兩條染色單體(子染色體)開始趨向(qūxiàng)兩極，這段時期稱為中期。中期的染色體濃縮成典型形態(tài)，在赤道面上形成赤道板。第十一頁，共七十四頁。精選ppt4．后期后期是姐妹染色單體分開并移向兩極的時期，當(dāng)子染色體到達兩極時，此期結(jié)束。染色單體的分開通常由著絲點開始，即兩個著絲點先分開，然后兩個染色單體的臂逐漸(zhújiàn)分開，完全分開后就向兩極移動。

5．末期從子染色體到達兩極后開始到形成兩個子細胞這段時期稱為末期，包括子核的形成與胞質(zhì)分裂兩個過程。第十二頁，共七十四頁。精選ppt二、細胞周期的控制點細胞周期能夠順利地發(fā)生、發(fā)展和完成，取決于三個重要的控制點(controlpoint)，即決定G1期發(fā)生的G1控制點，決定S期發(fā)生的S控制點和決定M期發(fā)生的M控制點。每一個控制點控制著細胞周期一定階段的開始，但只有在細胞周期前一個階段徹底完成以后才能發(fā)生。(一)G1控制點:在G1期，哺乳動物細胞的趨向有3種可能性：一些細胞進入S期，通過G2期及有絲分裂期，即進入增殖周期；一些細胞離開細胞周期，處于靜止期，又稱G0期，它們在一定的條件刺激(tiáojiàncìjī)下可重新進入增殖周期；第十三頁，共七十四頁。精選ppt還有一些細胞向分化方向發(fā)展，使細胞的功能向?qū)Ｒ换?，而分裂能力趨向減弱。

在正常情況下多細胞的哺乳動物體內(nèi)(tǐnèi)的部分細胞處于非增殖狀態(tài)的休止期(Go期)，只在一定條件下才進人G1期。在G1期的后期中存在一個類似于酵母周期中起始點的限制點(restrictionpoint，簡稱R點)，它在細胞的每一次分裂中具有控制作用，故稱為G1控制點，只有通過R點的細胞才能進入S-G2-M期。

第十四頁，共七十四頁。精選ppt在通過R點前必須合成(héchéng)一種不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)(p105RB)，當(dāng)它積累到一定量時才能通過R點而啟動DNA合成(héchéng)。因為一旦啟動DNA合成(héchéng)后就可通過G2期而進入M期，所以R點是控制細胞增殖的關(guān)鍵，由此出發(fā)，細胞可能有3種不同的命運：

(1)繼續(xù)增殖細胞。這些細胞在分裂完成之后，可以超過R點繼續(xù)向前發(fā)展，它們不斷離開G1期，并通過細胞增殖周期中的各個不同時期完成細胞分裂。如骨髓干細胞，胃、腸上皮中的基底細胞等。第十五頁，共七十四頁。精選ppt(2)暫時不增殖細胞。這類細胞在分裂完成后，暫時處于G。期，并在R點被阻留很長時間。在正常情況下，這類細胞不合成(héchéng)DNA也不分裂，但在一定條件下可再進入細胞周期而進行增殖。屬于這種類型的有肝細胞、哺乳動物的初級卵母細胞等。(3)不增殖細胞。這類細胞可以由R點走向分化細胞，并成為執(zhí)行專門功能的終末分化細胞。如神經(jīng)細胞、哺乳動物的成熟紅細胞、皮膚上皮的角質(zhì)細胞等。第十六頁，共七十四頁。精選ppt(二)S控制點細胞在G1期完成后，細胞質(zhì)中含有DNA復(fù)制的激活因子，叫S期激活因子(Sphaseactivator)。S期激活因子的量決定Gl期完成和細胞進入S期的速度。DNA復(fù)制完成后，細胞結(jié)束S期進入G2期，某些細胞可停在G2期，在適當(dāng)?shù)臈l件下進入M期重新分裂。(三)M期控制點細胞開始有絲分裂(yǒusīfēnliè)時需要M期激酶(Mphasekinase)激活。M期激酶是由2個亞單位第十七頁，共七十四頁。精選ppt組成，一個是催化亞單位p34；另一個是調(diào)節(jié)亞單位，它是一種細胞周期蛋白(cyclin)，可以是周期蛋白A或周期蛋白B，它們是在有絲分裂間期不斷合成并積累的。

p34本身沒有活性，當(dāng)它與調(diào)節(jié)亞單位結(jié)合時，通過調(diào)節(jié)亞單位變構(gòu)形成p34-cyclinA或p34-cyclinB二聚體。二聚體中的p34蛋白絲氨酸與蘇氨酸殘基去磷酸化，產(chǎn)生激酶活性位點，使細胞進入M期。在M期中，調(diào)節(jié)亞單位被破壞，使M期激酶失活，從而(cóngér)使分裂的兩個子細胞分開，結(jié)束M期。第十八頁，共七十四頁。精選ppt

第二節(jié)細胞周期的調(diào)控目前，人們已揭示了細胞周期的主要生物化學(xué)過程，并獲得了自酵母至人類普遍(pǔbiàn)適用的模式。一．細胞因子與相應(yīng)的受體細胞因子是一類能與特異的、高親和性的細胞外基質(zhì)、可溶性受體及細胞膜上的受體結(jié)合，向細胞內(nèi)傳遞信號，刺激細胞增殖的多肽類物質(zhì)。生長因子為一類促進細胞生長的細胞因子。根據(jù)生長因子的靶細胞的不同，可將其第十九頁，共七十四頁。精選ppt

分為兩類：一類為具有廣泛作用(zuòyòng)的生長因子，如表皮生長因子(EGF)、血小板衍化生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、類胰島素生長因子(IGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等；另一類為細胞特異性生長因子，如白細胞介素2(IL-2)、神經(jīng)生長因子(NGF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)等。正常情況下，哺乳動物體內(nèi)的大部分細胞處于非增殖狀態(tài)的G0期，此期細胞主要表達與細胞生長有關(guān)的基因，但不合成與細胞周期調(diào)控體系有關(guān)的蛋白。細胞因子作用于細胞表面的各種相應(yīng)的受體，受體多是增殖信號的跨膜傳遞者。這些受體都是糖蛋白，和生長因子結(jié)第二十頁，共七十四頁。精選ppt

合后產(chǎn)生變構(gòu)，激活了蛋白激酶的活性，可使細胞內(nèi)靶蛋白的酪氨酸發(fā)生磷酸化，進一步觸發(fā)由細胞質(zhì)到細胞核的一系列信號傳遞反應(yīng)。核內(nèi)調(diào)控蛋白接受從細胞質(zhì)經(jīng)一系列反應(yīng)傳來的增殖信號后，才能變構(gòu)而被激活，與基因組中特定的調(diào)控序列發(fā)生相互作用，開動一組與細胞增殖調(diào)控有關(guān)的特定基因的轉(zhuǎn)錄，首先刺激fos、jun、myc等早期(zǎoqī)反應(yīng)基因的表達，并在這些轉(zhuǎn)錄因子的作用下，激活周期蛋白與周期蛋白依賴性激酶

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的基因表達，合成與細胞周期調(diào)控體系有關(guān)的蛋白，調(diào)控細胞周期的進行。下面介紹幾種主要的生長因子及受體:(一)表皮生長因子EGF是一種含有53個氨基酸殘基的多肽。EGF分子內(nèi)有對維持其生物活性必需的3個二硫鍵，當(dāng)用巰基乙醇或尿素還原二硫鍵后，EGF活性就會喪失。EGF主要分布于人的尿液、乳汁和血漿(xuèjiāng)中。作為一種作用很強的促細胞分裂因子，EGF能刺激多種組織細胞在體內(nèi)和體外的分裂和增殖。EGF是通過位于細胞膜上的受體而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的。EGF受體第二十二頁，共七十四頁。精選ppt(EGFR)是具有內(nèi)在的酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，EGFR的分布較廣泛，來源于內(nèi)、中、外三個胚層的細胞均有EGFR表達。EGF與EGFR結(jié)合后形成復(fù)合物，通過細胞內(nèi)吞進入細胞，在細胞內(nèi)EGF最終被溶酶體降解(jiànɡjiě)，EGFR在與EGF解離后被送回質(zhì)膜表面重新利用。(二)血小板衍化生長因子血小板衍化生長因子(platelet—derivedgrowthfactor，PDGF)來源于血小板，由含二硫鍵的二聚體組成，PDGF也是一種較強的促有絲分裂因子。第二十三頁，共七十四頁。精選pptPDGF以啟動性生長因子的身份，刺激靜止細胞進入對推進因子敏感的狀態(tài)，離開G0期進入生長周期。反轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化基因v-sis的產(chǎn)物P28V-sis蛋白質(zhì)氨基酸的順序(shùnxù)與PDGF的β鏈同源，這說明癌基因可能通過編碼生長因子參與細胞增殖調(diào)控。PDGF也是通過與細胞表面的特異性受體結(jié)合發(fā)揮作用的。PDGF受體(PDGFR)是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，通過與PDGF結(jié)合被活化，發(fā)揮多種生理活性。第二十四頁，共七十四頁。精選ppt(三)轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)生長因子轉(zhuǎn)化生長因子(transforminggrowthfactor，F(xiàn)GF)是一組誘導(dǎo)非瘤細胞表達轉(zhuǎn)化表型的多肽類物質(zhì)。FGF中最主要的有TGF-α和TGF-β兩大類。TGF-α在結(jié)構(gòu)上與EGF相關(guān)，生物學(xué)特性非常相似。TGF-α和EGF都能與EGFR結(jié)合，結(jié)合后均可活化EGFR的蛋白激酶活性并誘導(dǎo)受體對信號傳導(dǎo)鏈下游的調(diào)節(jié)作用。TGF-β不與EGFR結(jié)合，其受體是含二硫鍵的糖基化復(fù)合物。TGF-β的轉(zhuǎn)化活性需EGF或TGF-α的協(xié)同。TGF-β對于各種腫瘤細胞。第二十五頁，共七十四頁。精選ppt

如上皮細胞、胚胎成纖維細胞及大鼠的原代培養(yǎng)均為一種抑制增殖作用。因此，TGF-β可能主要是參與抑制細胞增殖。對細胞生長起負調(diào)節(jié)作用。(四)抑素抑素(chalone)是與生長因子(yīnzǐ)作用相反的、具有組織特異性的內(nèi)源性、生理性生長抑制因子(yīnzǐ)，其作用有組織或細胞特異性，而無種屬特異性。對細胞無毒性，僅使細胞增殖阻滯于細胞周期某一時相，作用消失后，細胞增殖可被逆轉(zhuǎn)。第二十六頁，共七十四頁。精選ppt抑素是肽類、蛋白質(zhì)或與糖結(jié)合的復(fù)合體，水溶性，存在于組織細胞和血清內(nèi)。目前確定的抑素有表皮細胞抑素、肝細胞抑素、紅細胞抑素、中性粒細胞抑素、淋巴細胞抑素等。各種抑素的分子量和理化性質(zhì)不同，其分子水平的作用尚不清楚。目前認為抑素主要作用于G1～S期，阻止細胞進入S期的稱為(chēnɡwéi)G1抑素或S因子，阻止細胞進入M期的稱為G2抑素或M因子。第二十七頁，共七十四頁。精選ppt二、周期蛋白與周期蛋白依賴性激酶對細胞周期的調(diào)控(一)周期蛋白與周期蛋白依賴性激酶過去人們一直認為細胞周期受核的控制，細胞質(zhì)的活動是被動的。但研究發(fā)現(xiàn)，細胞質(zhì)中存在有調(diào)節(jié)細胞周期的因子，其活動不完全受細胞核的控制，這種因子被稱為有絲分裂促進(cùjìn)因子(mitosispromotingfactor，MPF)。MPF由兩種蛋白分子組成，一種是“周期蛋白”(cyclin)，另一組分是具有蛋白激酶活性的催化亞單位，由于此激酶的活性依賴于和周期第二十八頁，共七十四頁。精選ppt蛋白結(jié)合，又稱為周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin—dependentkinase，CDK)。

已發(fā)現(xiàn)的周期蛋白有10多種，如酵母細胞中的Clnl、Cln2、Cln3及哺乳動物細胞中的CyclinA、B、C、D、E、F、H等。依據(jù)它們在細胞周期中調(diào)控階段的不同(bùtónɡ)分別歸人G1期周期素和M期周期蛋白。在周期蛋白分子中都含有一段高度保守的氨基酸序列，它是與CDK互相結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)，稱“周期蛋白盒”(cyclinbox)。周期蛋白周期性地合成、與CDK結(jié)合、降解，起到了對細胞周期的調(diào)節(jié)作用。第二十九頁，共七十四頁。精選pptCDK是具有蛋白激酶活性的催化亞單位。目前已發(fā)現(xiàn)6種CDK。CDK與細胞分裂周期(celldivisioncycle，cdc)基因(jīyīn)cdc2編碼產(chǎn)物p34cdc具有同源性。與周期蛋白結(jié)合的p34cdc的活性還受其他某些特異性的激酶和磷酸酶的調(diào)控。包括Cdc2(CDKl)、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5和CDK6，它們分別對細胞G1-S期和G2-M期的過渡進行調(diào)控。第三十頁，共七十四頁。精選ppt當(dāng)細胞進入G2期后，M期cyclin逐漸增加，并與CDK形成無活性MPF復(fù)合物，在其他激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)镸PF。通過MPF對這兩類酶的正反饋調(diào)節(jié)作用，不斷加速MPF的產(chǎn)生。當(dāng)MPF增加到相當(dāng)高的濃度時就引發(fā)一系列變化。(二)細胞周期蛋白(dànbái)對細胞周期的調(diào)控1.G1期周期蛋白正常情況下，哺乳動物體內(nèi)細胞的G1期后期具有一個控制樣的限制點，稱為G1控制點。人類細胞在G-期表達3種周期蛋白：

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CyclinC、D和E。處于Go期的細胞受生長因子刺激后，首先表達C、D型周期蛋白，再表達E型周期蛋白，然后進入DNA合成期。CyclinC的水平在G0期稍有增加(zēngjiā)，在細胞周期的其他時期內(nèi)波動很小。CyclinD在不斷增殖的細胞中的水平波動不明顯。CyclinD的表達對生長因子有明顯的依賴性。在G0早期，D型周期素開始表達，并與CDK4為主的數(shù)種激酶結(jié)合，在細胞由Go期進入Gl的過程中起重要作用。如果抑制CyclinD在G0期的表達，細胞將不能進入s期。第三十二頁，共七十四頁。精選ppt

CyclinE的表達時間比CyclinD晚，在細胞內(nèi)呈周期性表達，峰值在G1-S過渡點，在控制(kòngzhì)細胞由G1期進人S期起限速作用。當(dāng)人類CyclinE在人包皮成纖維細胞中穩(wěn)定地過渡表達時，可以縮短被轉(zhuǎn)染細胞的G1間期，細胞在較小的狀態(tài)通過G1-S期過渡點，并可減少由G1向S期過渡時血清的需要量，而CyclinE在周期中產(chǎn)生的時間并未改變；但是，由于細胞提前進入S期，影響了為復(fù)制DNA所需要的因子的積累，縮短的G1期的時間由延長s期和G2期得以補差平衡。由此可見，CyclinE的合成程度是細胞G1-S過渡的限制因素。第三十三頁，共七十四頁。精選ppt2．S期和M期的周期蛋白(1)CyclinA和CyclinB。CyclinA的合成(héchéng)早于CyclinB，它的合成(héchéng)起始接近于Gl-S期過渡點，并在間期就進入細胞核內(nèi)。破壞CyclinA的功能將抑制染色體的復(fù)制。CyclinB的合成(héchéng)起始于S期，在G2-M期過渡中逐漸增加，直至有絲分裂中期和后期之間發(fā)生驟然降解。而且，CyclinB在核膜破裂前才進入細胞核內(nèi)。CyclinA和CyclinB分別與CDK2和CDKl相結(jié)合，使細胞從G2期進入M期。第三十四頁，共七十四頁。精選ppt

(2)CyclinH。CyclinH與一種與CDK相關(guān)的激酶M015相結(jié)合，M015-CyclinH復(fù)合物能增強CDK2-CyclinA的激酶活性。因此，與其他已知的CDK—Cyclin復(fù)合物不同，MOl5一CyclinH復(fù)合物不是細胞周期次級反應(yīng)中的有關(guān)成分，而是中心調(diào)控體系本身，提示細胞周期中心調(diào)控機制(jīzhì)中存在Cyclin—CDK的級聯(lián)反應(yīng)。第三十五頁，共七十四頁。精選ppt第三十六頁，共七十四頁。精選ppt第三十七頁，共七十四頁。精選ppt第三十八頁，共七十四頁。精選ppt第三節(jié)細胞增殖與腫瘤人類腫瘤的發(fā)生與癌基因激活和抑癌基因失活有關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)，癌基因和抑癌基因作用的歸結(jié)點在于對細胞周期的調(diào)控。腫瘤細胞周期的調(diào)控多表現(xiàn)為起正調(diào)控作用的Cyclin過度表達，而發(fā)揮(fāhuī)負調(diào)控作用的抑制因子CKI卻常常失活。如在多數(shù)惡性腫瘤中都有CyclinD的過度表達或/和P21、P27低表達。細胞周期的監(jiān)測點異常也可能導(dǎo)致細胞周期紊亂而癌變。特別是約半數(shù)以上惡性腫瘤中有分子警察P53的突變。第三十九頁，共七十四頁。精選ppt

第四節(jié)細胞增殖常用的檢查方法

1.細胞核分裂計數(shù)核分裂象是細胞周期中惟一可以用形態(tài)學(xué)方法識別的時期(shíqī)，在普通光學(xué)顯微鏡下即能夠進行。Baak提出核分裂的識別標(biāo)準的為：核膜消失；在核分裂中央缺乏透明區(qū)；核分裂象兩側(cè)或外周可見毛發(fā)樣突起；胞漿嗜堿性。核分裂計數(shù)有高倍視野法(highpowerfields，HPF)和核分裂指數(shù)法(mitoticindex，MI)。

第四十頁，共七十四頁。精選ppt

高倍視野法在高倍(×400)下，隨機選擇多個視野(≥10)，分別觀察并計數(shù)其中(qízhōng)的核分裂象，然后計算出每個HPF中核分裂象的平均值。由于不同型號的顯微鏡HPF的面積太小可能存在一定差異，且所測細胞的大小不同，單位面積內(nèi)的細胞數(shù)亦不相同，該方法存在結(jié)果可比性和重復(fù)性較差的問題。第四十一頁，共七十四頁。精選ppt核分裂指數(shù)法:在目鏡上加一單線狀標(biāo)尺，計數(shù)高倍(×400)視野下與標(biāo)尺相交的細胞數(shù)(n)，該視野內(nèi)細胞總數(shù)A=π(n／2)2。計數(shù)10個高倍視野，其中(qízhōng)第1、5、10視野按上述公式計算，3個視野細胞數(shù)之和除以3，乘以10，則為10個視野的細胞總數(shù)。以10個高倍視野的核分裂象數(shù)除以細胞總數(shù)，求得MI值。第四十二頁，共七十四頁。精選ppt第四十三頁，共七十四頁。精選ppt第四十四頁，共七十四頁。精選ppt第四十五頁，共七十四頁。精選ppt在不同腫瘤中，核分裂數(shù)多少的意義(yìyì)是不一樣的。如：胃腸道平滑肌腫瘤：≤5/10HPF；良性或潛在惡性≥5/10HPF：惡性子宮平滑肌腫瘤：≥10/10HPF+異型性+腫瘤性壞死：惡性≥10/10HPF、無異型性、無壞死：潛在惡性胃腸道間質(zhì)瘤：5/50HPF+腫瘤＞5cm：惡性第四十六頁，共七十四頁。精選ppt2.DNA合成情況的檢測(jiǎncè)直接反映處于S期細胞的多少。可通過測定標(biāo)記的DNA前體物質(zhì)，如3H-去氧胸腺嘧啶核苷，或核苷酸類似物質(zhì)5-溴-2脫氧尿苷（Bromodeoxyoridine,BrdU),應(yīng)用放射自顯影、免疫組化或閃爍測定儀、流式細胞儀定性或定量測定標(biāo)記的細胞術(shù)。第四十七頁，共七十四頁。精選ppt3H標(biāo)記胸腺嘧啶(mìdìnɡ)脫氧核苷摻人標(biāo)記技術(shù)

3H標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷摻人標(biāo)記技術(shù)(thymidinelabeling,3H-TdR)由Johnson等于1961年首次建立，是顯示s期細胞的經(jīng)典方法。用活細胞或新鮮組織與3H標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷孵育1～2h，有DNA合成能力的s期細胞將攝人3H—TdR合成新的DNA，通過放射自顯影顯示，可在顯微鏡下直接辨認s期細胞，計數(shù)全部細胞中s期細胞的百分率作為胸腺嘧啶脫氧核苷標(biāo)記指數(shù)(thymidinelabelingindex，TLI)表示增殖活性。第四十八頁，共七十四頁。精選ppt操作步驟a.剪碎的無菌新鮮組織或體外培養(yǎng)細胞加入培養(yǎng)基和3H標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h；b．集組織和細胞，PBS清洗后，10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片；c.室內(nèi)將脫蠟水化后的切片浸人感光乳膠(rǔjiāo)，然后在4℃的暗盒內(nèi)曝光3天；d.在暗室內(nèi)放射自顯影的切片在顯影液中顯影，然后在定影液中定影；e.切片經(jīng)蘇木素伊紅染色；f.計數(shù)2000～5000個細胞，計算陽性細胞的百分率，求得TLI。第四十九頁，共七十四頁。精選ppt應(yīng)用:

3H-TdR標(biāo)記技術(shù)自建立以來，已得到廣泛應(yīng)用。Iinden研究證實高TLI與乳腺癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)、病理(bìnglǐ)分型及臨床亞型有關(guān)，與其他預(yù)后指標(biāo)相比，TLI是最有價值的。存在的問題:TLI只顯示s期細胞數(shù)量，而未顯示s期長短，因而可能出現(xiàn)細胞增殖速度慢而TLI增高的情況

第五十頁，共七十四頁。精選ppt由于腫瘤生長的異質(zhì)性，對腫瘤組織取材的代表性不夠亦會造成結(jié)果偏差；觀察者的經(jīng)驗、計數(shù)細胞的多少、組織的新鮮程度以及放射性同位素的活性均可影響結(jié)果的可靠性；需要新鮮組織及放射性同位素是TLI應(yīng)用受限的主要(zhǔyào)原因。第五十一頁，共七十四頁。精選ppt溴脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記技術(shù)溴脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記技術(shù)(5-bromodeoyuridine，Brdu)由于3H-TdR標(biāo)記技術(shù)需要同位素，推廣受限。5一溴脫氧尿嘧啶核苷(5一bromodeoyuridine，Brdu)是胸腺嘧啶核苷的相似物，像胸腺嘧啶脫氧核苷一樣可摻人到細胞(xìbāo)合成的DNA中，摻人到細胞(xìbāo)DNA的Brdu可通過抗5一Brdu單克隆抗體在組織切片和細胞(xìbāo)爬片上顯示或通過FCM檢測s期細胞(xìbāo)。第五十二頁，共七十四頁。精選ppt操作步驟a.剪成0.5mm3大小的無菌新鮮組織或體外培養(yǎng)細胞加入含Brdu的培養(yǎng)基，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h；2.集組織和細胞，用PBS清洗后，70％乙醇固定，常規(guī)石蠟包埋切片；c.切片脫蠟水化，3％H202阻斷內(nèi)源性過氧化物酶20min，蒸餾水洗；d.0.1NNaCl于4℃處理5min，再用90％的甲酰胺水溶液58℃孵育30min，以變性DNA；e.4℃預(yù)冷的PBS清洗2min，以停止DNA變性；f.利用抗Brdu抗體，按免疫組織化學(xué)方法染色；g.蘇木素襯染；h.計數(shù)2000～5000個細胞，計算陽性細胞的百分率，求得標(biāo)記(biāojì)指數(shù)LI。第五十三頁，共七十四頁。精選ppt應(yīng)用1982年，Gratzner等首先利用抗5-Brdu和抗5一碘脫氧尿啼啶核苷單克隆抗體顯示DNA復(fù)制，與用3H-TdR標(biāo)記法所獲結(jié)果一致。隨后該方法得到廣泛應(yīng)用，獲得滿意結(jié)果，認為此法能對細胞周期進行迅速而穩(wěn)定的測量。

存在的問題Brdu標(biāo)記技術(shù)雖然不用(bùyòng)放射性同位素，但仍需要新鮮組織；組織或細胞的離體時間、Brdu濃度是影響結(jié)果的重要參數(shù)。離體時間超過15min將嚴重影響結(jié)果的可靠性。第五十四頁，共七十四頁。精選ppt3.細胞核仁組成區(qū)嗜銀相關(guān)蛋白（AgNOR)概述：核仁組成區(qū)（Nucleolusorganizerregion,NORs)位于核仁rDNA袢，由rDNA、rRNA組蛋白、非組蛋白等組成。參與蛋白質(zhì)、核糖體合成及核仁組成。NORs的酸性非組蛋白又稱為核仁組成區(qū)相關(guān)蛋白，能與Ag結(jié)合(jiéhé)并被還原為氧化銀沉淀，故稱為核仁組成區(qū)嗜銀相關(guān)蛋白（AgNOR)。常用明膠液和硝酸銀等作為染色劑?？捎迷谑炃衅蚣毎科校瑧?yīng)用廣泛。是常用的檢測細胞增殖活性方法。第五十五頁，共七十四頁。精選ppt細胞核內(nèi)AgNOR數(shù)目反映：核仁內(nèi)rDNA的轉(zhuǎn)錄活性水平；在染色體組中NOR染色體的數(shù)目，及細胞分裂周期中所處的階段。組織切片中AgNOR平均計數(shù)(jìshù)增加的原因：（1）細胞增殖活躍，以致細胞核內(nèi)核仁分解，AgNOR分散于細胞核中（2）核仁融合缺陷，使AgNOR分散（3）細胞的染色體倍體數(shù)增加（4）rDNA轉(zhuǎn)錄活性增加第五十六頁，共七十四頁。精選ppt染色方法NORs的染色方法很多，有銀染一步法、火棉薄膜覆蓋法、PEG法、雙重染色法和鉍染法等，應(yīng)用最廣的還是銀染一步法。HoweU銀染一步法1．切片的制備手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本，lO％甲醛溶液(福爾馬林)固定，常規(guī)石蠟包埋，作連續(xù)4gm切片。2．膠質(zhì)銀工作液配制將明膠溶于1％甲酸液使其成為2％溶液(即2克明膠溶于100ml1％甲酸液中)，將此液按1：2容積比與50％硝酸銀混合即成。3．染色(1)切片常規(guī)脫蠟至去離子水水化。(2)暗室內(nèi)(shìnèi)，室溫(20~25C)下滴加膠質(zhì)銀工作液覆蓋切片表面，一般以27—60分鐘為宜。(3)流水充分沖洗切片(4)對比染色(中性紅蘇木素或甲基綠等)。(5)常規(guī)脫水透明封片4．結(jié)果切片背景為淺黃色，AgNOR顆粒為深棕色。第五十七頁，共七十四頁。精選ppt固定劑的選擇由于AgNOR技術(shù)在組織病理學(xué)上的應(yīng)用日益廣泛，Smith等(1988)及時(jíshí)研究了一系列固定劑對AgNOR的影響。他們發(fā)現(xiàn)乙醇類固定劑效果最佳，10％甲醛溶液固定劑效果是滿意的，10％中性甲醛溶液的效果接近于乙醇類固定劑。一般說來，可選用的固定液為：乙醇、丙酮、10％甲醛溶液、10％中性甲醛溶液，Carnoy’s固定液、Clark’s固定液。不應(yīng)選用的固定液為：升汞甲醛溶液、Helly’S固定液、Zenker’s固定液、戊二醛／苦味酸固定液。第五十八頁，共七十四頁。精選pptAgNOR的形態(tài)分型:1.單一型為境界清楚邊緣光滑的圓形顆粒,顆粒周圍常有一空暈.顆粒位于核中央或偏位,此型在良性病變中多見2．彌散型在核漿內(nèi)散在分布、大小不一的顆粒。數(shù)目一般可多達10～20個，甚至更多。顆粒形態(tài)可為圓點狀、條塊狀或不規(guī)則形，有時亦可見相互重疊的現(xiàn)象(xiànxiàng)。此型在惡性腫瘤中多見。3．聚集型耷核漿內(nèi)散在分布大小不一的顆粒，顆粒常聚集成團塊狀、條索狀或不規(guī)則形，無法明確計數(shù)。4．核仁內(nèi)型胞核內(nèi)有一個或數(shù)個核仁，核仁大小不一，大者直徑可達2．5～6扯m，核仁周邊常有空暈。每個核仁內(nèi)有境界清晰或不清晰的顆粒，數(shù)量不等。5．混合型上述各型均可相互混合，混合所占的比例大致相同。

第五十九頁，共七十四頁。精選ppt計數(shù)方法:為了便于與修改后的標(biāo)準化方案比較，1993年的“上海方案”的計數(shù)原則如下：，1．每例涂片至少計數(shù)50個細胞，切片至少計數(shù)100個細胞。計數(shù)細胞內(nèi)每一個可辨別的顆粒。2．直徑≥2．5μm的團塊或顆粒按5個顆粒計算(jìsuàn)。3．最后按單位細胞核內(nèi)的．AgNOR數(shù)計算。4．除計數(shù)外，尚須注明形態(tài)分型。AgNOR顆粒形態(tài)的觀察與計數(shù)同樣重要，特別是病變介于良惡性之間或細胞增生活躍者更應(yīng)注意顆粒形態(tài)類型。第六十頁，共七十四頁。精選pptFigure1.Silver-stainedHodgkin'sandReed-SternbergcellsinlymphnodeimprintsfromapatientwithHodgkin'sdisease(originalmagnificationx1000).

第六十一頁，共七十四頁。精選pptFig3A-B.Highpowerfieldofsilverstainedpreparationof(A)parostealand