細(xì)胞爬片固定及免疫熒光的操作步驟

細(xì)胞爬片、固定及免疫熒光的操作步驟細(xì)胞爬片、固定及免疫熒光的操作步驟/細(xì)胞爬片、固定及免疫熒光的操作步驟細(xì)胞爬片、固定及免疫熒光的操作步驟爬片的準(zhǔn)備爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用爬片；用蓋玻片晌，可依照自己的需要用小砂輪或玻璃刀剪裁成合適的大小，以備置于6孔板、12孔板或24孔板；2)將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡過夜，第二天先用自來水沖洗20遍，爾后置于無水酒清中浸泡6小時，再用三蒸水沖洗3遍，放在飯盒也許玻璃培養(yǎng)皿中烘干后高壓消毒。高壓消毒后取出放入烘箱中烘干，烘干后可放入超凈臺中備用。可將爬片用多聚賴氨酸辦理，以使細(xì)胞與爬片結(jié)合更牢固。1mg/ml的多聚賴氨酸用的濾器過濾除菌后分裝于經(jīng)過無菌辦理的1ml細(xì)胞凍存管內(nèi)保存在4℃里，三個月內(nèi)依舊能夠使用。用時將高壓滅菌過的爬片放到ml的多聚賴氨酸溶液內(nèi)浸泡5min，無菌晾干即可（放入培養(yǎng)板孔內(nèi)注意爬片的正反面）。或?qū)⑴榔佊谂囵B(yǎng)皿中，將多聚賴氨酸溶液滴于爬片上，室溫10分鐘后，吸除玻片上的溶液，在超靜臺內(nèi)晾干后使用。儲蓄、稀釋和吸取多聚賴氨酸要使用塑料制品。細(xì)胞爬片胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完好培養(yǎng)基中，充分吹打，使之成單細(xì)胞懸液，計數(shù)。依照自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入培養(yǎng)板內(nèi)。滴加細(xì)胞懸液時，依照爬片的大小，先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的地址滴少量培養(yǎng)基，爾后將爬片置于液滴上，壓緊，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，防范加細(xì)胞懸液時爬片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。若細(xì)胞貼壁能力不強(qiáng)，爬片可經(jīng)多聚賴氨酸浸片后放入。細(xì)胞的固定及免疫熒光在培養(yǎng)板中培養(yǎng)好細(xì)胞后，吸除培養(yǎng)基，一般先使用PBS輕洗細(xì)胞2×3min，爾后再做固定（凋亡的TUNEL染色等能夠不沖洗）。固定：加入4%多聚甲醛(PBS配制)固定20分鐘。若是暫時不能夠馬上做組化檢測，使用含%多聚甲醛的PBS浸泡細(xì)胞（注意在免疫組化檢測完成前不要讓細(xì)胞變干，否則細(xì)胞縮短形態(tài)不好）。除去多聚甲醛，使用PBS輕洗細(xì)胞3×3min。通透：%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min（細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟）。除去TritonX-100，使用PBS輕洗細(xì)胞3×3min。內(nèi)源性過氧化物酶辦理：3%H2O2孵育15min（選作，二抗連HRP必需做，其他的如做免疫熒光染色不用做）。除去H2O2，使用PBS輕洗細(xì)胞3×3min。封閉：用10%的與二抗同源的血清(PBS配制)封閉半小時。封閉結(jié)束后千萬不要洗，直接上一抗。一抗：滴加足夠量合適濃度的一抗，4℃孵育過夜（或37℃，60min）；若有兩種一抗（若是不同樣種屬的）則同時孵育，兩種二抗亦同時孵育（二抗同時使用時最好是同一種屬）。除去一抗，使用PBS輕洗細(xì)胞3×3min。二抗：滴加足夠量合適濃度的二抗，37℃，30min（從加熒光二抗起，后邊所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行）。除去二抗，使用PBS輕洗細(xì)胞3×3min。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物顯色：室溫下避光孵育5至10分鐘，或直至樣本出現(xiàn)棕褐色（選作，二抗連得是酶的必做，顯色時間嚴(yán)格控制，要防范顯色過分引起假陽性；二抗連的是熒光素的不用做）。除去顯色工作液，使用PBS沖洗細(xì)胞3~4次。復(fù)染核：mlDAPI（或200nMHoechst33342）避光孵育5min。使用PBS輕洗細(xì)胞4×5min，洗去節(jié)余的DAPI。取爬片晌由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大，可將注射器針頭針尖向反面做個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，爾后在熒