蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)蛋白質(zhì)制備

關(guān)于蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)蛋白質(zhì)制備第1頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)的電泳第2頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)的電泳分離電泳分離的原理:

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì),在一定的pH下,可以解離為帶電荷的離子。在電場中可以電泳移動(dòng)。電泳遷移率：帶電顆粒在溶液中遷移速度的快慢，用電泳遷移率(M)表示：

M為遷移率；dL為顆粒移動(dòng)的距離；L為通電的時(shí)間。E為兩個(gè)電極之間的電勢差。M=EtdL第3頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第4頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三影響蛋白質(zhì)電泳遷移率的因素蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。分子的電荷、大小和形狀。電場與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強(qiáng)度緩沖液離子強(qiáng)度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動(dòng)速度會(huì)減緩。支持介質(zhì)紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。第5頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第6頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三影響蛋白質(zhì)電泳遷移率的因素蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。分子的電荷、大小和形狀。電場與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強(qiáng)度緩沖液離子強(qiáng)度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動(dòng)速度會(huì)減緩。支持介質(zhì)紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。第7頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第8頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三影響蛋白質(zhì)電泳遷移率的因素蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。分子的電荷、大小和形狀。電場與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強(qiáng)度緩沖液離子強(qiáng)度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動(dòng)速度會(huì)減緩。支持介質(zhì)紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。第9頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三緩沖液和離子強(qiáng)度緩沖液離子強(qiáng)度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動(dòng)速度會(huì)減緩。離子強(qiáng)度增強(qiáng)，緩沖液所載的分電流隨之增加，樣品所載分電流降低，樣品電泳速度變慢離子強(qiáng)度太低，電導(dǎo)率太小，樣品移動(dòng)緩慢第10頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三影響蛋白質(zhì)電泳遷移率的因素蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。分子的電荷、大小和形狀。電場與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強(qiáng)度緩沖液離子強(qiáng)度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動(dòng)速度會(huì)減緩。支持介質(zhì)紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。第11頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三電泳的類型自由界面電泳使用支持物的區(qū)帶電泳。

區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個(gè)點(diǎn)或一薄層樣品溶液，然后加電場，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中遷移。支持介質(zhì)的作用主要是為了防止機(jī)械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液的高密度而產(chǎn)生的對(duì)流。區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺（PAGE）和瓊脂糖凝膠。第12頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三聚丙烯凝膠電泳SDS凝膠等電聚焦第13頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三SDS電泳在蛋白質(zhì)中加入摩爾比為1.4：1(SDS:蛋白質(zhì))的SDS(十二烷基硫酸鈉)。使所有蛋白質(zhì)都帶上負(fù)電。SDS是陰離子去污劑，能與蛋白質(zhì)的疏水部分結(jié)合，并且把大部分蛋白質(zhì)拆成組成他的亞基形式。在上樣緩沖液中加入巰基乙醇，可以使二硫鍵還原為巰基。使不同的蛋白質(zhì)分子的短軸一致，長軸與蛋白質(zhì)的分子量成正比。SDS-PAG中，蛋白質(zhì)電泳的速度不再取決于蛋白質(zhì)的電荷與形狀，只與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)。第14頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第15頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第16頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三SDS電泳當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logM=K-bX

M為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。第17頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三SDS電泳繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

按下式計(jì)算相對(duì)遷移率：

以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量，這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性。第18頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三SDS電泳PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類連續(xù)系統(tǒng)中,緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中,由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。第19頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三不連續(xù)SDS各部分凝膠配制電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進(jìn)行電泳，開始電流恒定在10mA，當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為20mA，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí)，停止電泳。第20頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第21頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第22頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第23頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三Figure6.2.4SDSresultsoffractionS1(SRA)兔磷酸化酶BMW=97,400牛血清白蛋白

MW=66,200兔肌動(dòng)蛋白

MW=43,000牛碳酸酐酶

MW=31,000胰蛋白酶抑制劑

MW=20,100雞蛋清溶菌酶

MW=14,400第24頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三SDS應(yīng)注意的幾個(gè)問題制備凝膠時(shí)，TEMED要加膠之前再加。電泳之前蛋白質(zhì)要溶解在含1%的SDS和1%的巰基乙醇的磷酸緩沖液(0.01mol/L,pH7.2),1000C加熱2~5分鐘。如凝膠中含有雜質(zhì)，可以在加入樣品前先預(yù)電泳0.5~1小時(shí)。SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生變化，解離為亞單位，電泳結(jié)果顯示的只是亞單位的大小，同時(shí)蛋白質(zhì)也會(huì)失去原來的活性。已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用SDS測定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。第25頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三等電聚焦電泳

蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負(fù)電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。在電場存在下的一定pH溶液中，帶正電的蛋白分子將向負(fù)極移動(dòng)而帶負(fù)電的蛋白分子將向正極移動(dòng)，在某一pH時(shí)，蛋白分子在電場中不再移動(dòng)，此時(shí)的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。等電聚焦(IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運(yùn)動(dòng)，最后各自停留在其等電點(diǎn)的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點(diǎn)。第26頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三等電聚焦電泳根據(jù)要分離的蛋白質(zhì)的pI的不同，訂購不同pH梯度的凝膠，可以對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離。

如3.5~9.5、2.5~6.0、5.0~8.5、7.5~10等。凝膠的pH值范圍越窄，分辨力越高?？煞蛛x等電點(diǎn)相差0.01個(gè)pH單位的蛋白質(zhì)，最高可以分辨0.0025個(gè)pH單位的蛋白質(zhì)。等電凝膠可以抵消擴(kuò)散作用，蛋白質(zhì)可以富集在很窄的區(qū)帶上。適用于少量蛋白質(zhì)樣品的分析鑒定，不適用于大量制備。要求用無鹽的溶液，而蛋白質(zhì)在無鹽溶液中容易沉淀；在等電點(diǎn)發(fā)生沉淀和變性的蛋白質(zhì)也不適合用次方法分離。第27頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第28頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第29頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三pI的測定可以用染色法觀察蛋白質(zhì)，然后用表面電極直接測量pH值。或?qū)⒛z切成小塊，加蒸餾水，再搗碎凝膠塊并且測量pH。第30頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三雙向電泳雙向電泳:由第一向等電聚焦(IEF)電泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)組成，第一向使等電點(diǎn)不同的蛋白得到分離，第二向使分子量不同的蛋白得到分離，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。1975年，O’Farrell首先運(yùn)用雙向電泳技術(shù)將大腸桿菌總蛋白分離出1100多個(gè)蛋白點(diǎn)。后來此技術(shù)一直用于原核生物和真核生物總蛋白的分離。目前，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，雙向電泳技術(shù)越來越廣泛的用于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。第31頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第32頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三第33頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三PAGE電泳分離的大分子的檢測考馬斯亮藍(lán)染色法

可檢出0.3~1ug的蛋白質(zhì)。銀染色法銀離子與蛋白質(zhì)以鹽或配價(jià)絡(luò)鹽的形式結(jié)合，用甲醛將銀離子還原為可見的銀顆粒?？蓹z測ng水平的蛋白質(zhì)。熒光染色技術(shù)熒光合成物質(zhì)與PAGE上的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，可檢測到PAGE中的蛋白質(zhì)。第34頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三免疫印跡法蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。具體操作為經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。第35頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三免疫印跡法抗原包被的實(shí)驗(yàn)?zāi)l

特異性人抗體標(biāo)記的二抗標(biāo)記第36頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三免疫印跡法第37頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)的結(jié)晶第38頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)的結(jié)晶可以作為蛋白質(zhì)提純的方法之一。蛋白質(zhì)純度達(dá)到一定值時(shí)可以結(jié)晶。通過反復(fù)重結(jié)晶可以除去其中的雜質(zhì)，使蛋白質(zhì)得到更大程度的純化。蛋白質(zhì)結(jié)晶體是比較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，所以結(jié)晶可以作為一個(gè)穩(wěn)定的儲(chǔ)存的方法。在蛋白質(zhì)結(jié)晶之后，可以提供作X射線衍射分析用的材料，來分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)等數(shù)據(jù)。第39頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)結(jié)晶的原理蛋白質(zhì)溶液在合適的過飽和狀態(tài)，溶質(zhì)分子通過擴(kuò)散、旋轉(zhuǎn)、碰撞等運(yùn)動(dòng)形式，可以形成晶核。溶質(zhì)分子以相互碰撞的作用方式有序而反復(fù)地堆砌在晶核上，直到晶核成長到晶體，最后從溶液中析出。第40頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三晶體結(jié)晶的條件蛋白質(zhì)純度越高，結(jié)晶越容易，至少要在50%以上。蛋白質(zhì)濃度。濃度越高，結(jié)晶機(jī)會(huì)越大。但過大會(huì)因雜質(zhì)存在而導(dǎo)致晶形不好。一般結(jié)晶的蛋白質(zhì)濃度在10~50mg/mL。溫度。蛋白質(zhì)結(jié)晶溫度在0~400C。一般在40C冷室或250C溫箱中進(jìn)行。pH。一般在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH附近結(jié)晶。金屬離子和離子強(qiáng)度。一些二價(jià)離子可以引起或有利于蛋白質(zhì)的結(jié)晶過程。沉淀劑。沉淀劑(如鹽類和各種有機(jī)溶劑)可改變蛋白質(zhì)的溶解度。理想的沉淀劑有：聚乙二醇(PEG)和2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)。第41頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)結(jié)晶方法鹽析法在蛋白質(zhì)溶液中加入鹽，使蛋白質(zhì)溶解度降低，之后以結(jié)晶形式從溶液中析出。有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑可以使蛋白質(zhì)介電常數(shù)降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)晶析出。等電點(diǎn)結(jié)晶。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，可以形成結(jié)晶。脫鹽結(jié)晶。一些球蛋白溶于鹽而幾乎不溶于水，可將溶于鹽溶液的蛋白質(zhì)結(jié)晶而出，然后透析除鹽。溫差除鹽。適用于一些對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)，不同溫度溶解度變化大?？蛇\(yùn)用此法。金屬離子。在某些蛋白質(zhì)溶液中加入金屬離子，可以促進(jìn)晶體的形成。第42頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)提純過程中的定量第43頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)的定量(1)定氮法測量蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量（克%）

=每克生物樣品中含氮的克數(shù)

6.25第44頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)的定量(2)雙縮脲法第一個(gè)用比色法測定蛋白質(zhì)濃度的方法。

雙縮脲試劑的成分是質(zhì)量濃度為0.1g/mL的氫氧化鈉溶液和質(zhì)量濃度為0.01g/mL的硫酸銅溶液。在堿性溶液(NaOH)中,雙縮脲(H2NOC－NH－CONH2)能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物,這個(gè)反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵,因此,含兩個(gè)或亮個(gè)以上的肽鍵化合物尤其是蛋白質(zhì)都可與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)。第45頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三雙縮脲反應(yīng)產(chǎn)物可在540nm處進(jìn)行比色測定可以測定蛋白質(zhì)的含量，可測定范圍為0.1~1.0mg/mL。

！此反應(yīng)為肽及蛋白質(zhì)特有的，而為氨基酸所沒有的一個(gè)顏色反應(yīng)。第46頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)的定量(3)福林-酚試劑法：

在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反應(yīng)，生成藍(lán)色化合物，在600nm下測光吸收?？筛鶕?jù)測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。靈敏度較高，可達(dá)25g-250g/ml。靈敏度比280nm處的紫外吸收法靈敏10倍，比雙縮脲法靈敏100倍。

第47頁，講稿共55頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)的定量(4)紫外吸收法A.280nm光吸收法

根據(jù)得到的280nm的光吸收值與蛋白質(zhì)的濃度正比，可以測量蛋白質(zhì)溶液中的濃度。B.280nm和260nm的吸收差法用280nm下的紫外吸收減去260nm下的紫外吸收，可以排除260nm下由于核酸吸光帶來的干擾