重組與鑒定課件

關(guān)于重組與鑒定第1頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三第七章基因的重組與轉(zhuǎn)移過程第2頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三切接轉(zhuǎn)增檢第3頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三一、

DNA的體外重組（切與接）同種內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端的連接同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接不同粘性末端的連接人工粘性末端的連接粘性末端的更換重組率第4頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三(1)同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG第5頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三(2)同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCGTACTAG

5'5'

GATCAT5'

5'

TGATCAACTAGT5'

BclIGCCTAGGATCC5'

TACTAG

GATCA退火T4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT第6頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三(3)不同種酶產(chǎn)生的粘性末端的連接用兩種限制性內(nèi)切酶分別消化載體和外源DNA片段,使載體和外源目的基因的兩端分別形成不同的粘性末端.將它們混合,在連接酶的作用下相同的粘性末端可退火形成重組DNA分子,實現(xiàn)DNA定向連接.第7頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三(4)不同粘性末端的連接

BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

GGATCGCCTAGC5'

CTGCAGGACGTC5'

PstI3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow補(bǔ)平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'5'第8頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三(5)人工粘性末端的連接5‘突出末端5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCG5'

5'Klenow補(bǔ)平Klenow補(bǔ)平GGATCCCTAGGATCCCTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火B(yǎng)amHIBamHIEcoRIBamHI第9頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三(6)人工粘性末端的連接3‘突出末端CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3C5'C3GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3C退火PstIPstIC3

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISphI第10頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三平末端DNA片段的連接同聚物加尾法銜接物加尾法DNA接頭連接法第11頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三同聚物加尾法不需要模板存在單一的脫氧核苷酸有帶3’-OH的單鏈延伸末端TdTa.用5’末端特異的核酸外切酶處理片斷A，B。形成延伸的末端b.分別加入dATP,dTTP及末端轉(zhuǎn)移酶，各自形成多聚尾巴c.退火；d.轉(zhuǎn)化大腸桿菌挑選重組子第12頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三銜接物加尾法銜接物(linker):用化學(xué)方法合成的一段由10-12個核苷酸組成,具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平齊末端的雙鏈寡聚核苷酸片段.第13頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三DNA接頭連接法接頭:人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段第14頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三第15頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三PCR產(chǎn)物的連接引入酶切位點

在引物兩端引入限制性內(nèi)切酶位點,同時要加3-4個保護(hù)堿基,或突變堿基創(chuàng)造酶切位點T/A克隆

目前使用最廣泛的PCR產(chǎn)物克隆方法平末端克隆第16頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三5.載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果

載體自身環(huán)化連接（能存活)載體之間互相連接（能存活)

插入片段互相連接（不能存活)一個載體與1個插入片段重組（能存活）幾個載體與一個插入片段重組（能存活）第17頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三重組率重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)在常規(guī)實驗條件下，重組率一般為25-75%

重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo)，較高的重組率可以大大簡化DNA重組的后續(xù)操作第18頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三提高重組率的方法提高外源DNA片段與載體的分子比：3:1-10:1載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)：

5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'

pGCTTAAOH

5'5'

AATTCG5'

HO退火5'

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-AG5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO堿性磷酸酶堿性磷酸酶第19頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三二、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增）轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染感染第20頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)化：指感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達(dá)質(zhì)粒載體DNA分子的生命過程。轉(zhuǎn)染：專指感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達(dá)噬菌體DNA分子的生命過程。第21頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三(一)轉(zhuǎn)化1細(xì)菌常用的轉(zhuǎn)化方法熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化顯微注射法轉(zhuǎn)化接合轉(zhuǎn)化噬菌體轉(zhuǎn)染第22頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效率Ca誘導(dǎo)107-8原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105-6噬菌體轉(zhuǎn)化107-8電穿孔法106-9（<100Kb）結(jié)合轉(zhuǎn)化104-5第23頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三1、Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài)

感受態(tài)細(xì)胞(Competentcells):就是處于能吸收外源DNA的生理狀態(tài)的細(xì)胞.第24頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三ThebindinganduptakeofDNAbyacompetentbacterialcell第25頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三第26頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三2、聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟MDNA分子酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化第27頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三細(xì)菌原生質(zhì)體的制備不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細(xì)菌需生長在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對溶菌酶的敏感性。在制備過程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無水無去污劑第28頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化取0.2-1ml的原生質(zhì)體懸浮液（108-109個原生質(zhì)體），加入10-20mlDNA重組連接液，同時加入含有PEG1000和Ca2+的等滲溶液，混勻細(xì)菌原生質(zhì)體的再生原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長出細(xì)胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素第29頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三3、電穿孔轉(zhuǎn)化

將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強(qiáng)大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻?xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大第30頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三4、結(jié)合轉(zhuǎn)化法通過細(xì)菌供體細(xì)胞同受體細(xì)胞間的直接接觸而傳遞外源DNA的方法。尤其適用于那些難以采用前面一些方法進(jìn)行重組質(zhì)粒DNA分子直接轉(zhuǎn)化的受體菌。轉(zhuǎn)化過程是由接合型質(zhì)粒完成。第31頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三（二）感染將以l噬菌體為載體的DNA分子包裝成病毒顆粒，使其感染受體菌的過程稱為感染。第32頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三（三）轉(zhuǎn)染

以噬菌體為載體，但不經(jīng)過蛋白包裝成病毒顆粒，而是用DNA連接酶使噬菌體DNA環(huán)化，再通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入受體菌的過程。感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)：

將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5吸附：加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30℃保溫10分鐘轉(zhuǎn)染裂解:加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2小時，直至培養(yǎng)液中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選第33頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三(四)、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的方法1、重組DNA導(dǎo)入酵母菌細(xì)胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化PEG轉(zhuǎn)化法電擊法第34頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三(1)酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%。但該程序操作周期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)重制約原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的一個顯著特點是，一個受體細(xì)胞可同時接納多個質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25-33%第35頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三(2)堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍第36頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三(3)酵母菌電擊轉(zhuǎn)化法

酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA,但在此過程中應(yīng)避免使用PEG，它對受電擊的細(xì)胞具有較很大的負(fù)作用。電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點是不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達(dá)105/mgDNA。第37頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運單雙鏈DNA均可轉(zhuǎn)化酵母菌，但單鏈的轉(zhuǎn)化率是雙鏈的10-30倍含有復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制不含復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能高效地同源整合入染色體克隆在YIp整合型質(zhì)粒上的外源基因，如果含有受體細(xì)胞的染色體DNA的同源序列，會發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的50-80%第38頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三2、重組DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化法雙子葉植物的轉(zhuǎn)化效率可高達(dá)80%-90%植物病毒介導(dǎo)的感染用病毒作為載體將外源基因?qū)胫参锝M織和細(xì)胞，不受單子葉和雙子葉限制?；驑尫姄舴ㄔ|(zhì)體融合花粉管通道法第39頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三1、植物病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染程序

在大約300種特征清楚的植物病毒中，單鏈RNA病毒約占91%，雙鏈RNA病毒、雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒各占3%。利用植物病毒載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞大致有以下兩種戰(zhàn)略：第40頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞原生質(zhì)體以雙鏈DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因組作為載體，去除有關(guān)的致病性基因，換上外源基因，體外包裝成有感染力的病毒顆粒，轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞原生質(zhì)體，并由此再生成整株植物。第41頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)染植物組織

植物雙生病毒（Geminiviruses）為一單鏈DNA病毒，成熟的雙生病毒呈雙顆粒狀，每一個顆粒中含有一條不同的DNA單鏈。其中A鏈能單獨在植物細(xì)胞中復(fù)制，并含有一部分病毒包衣蛋白基因；B鏈編碼另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B兩條鏈必須同處于一個植物細(xì)胞中，方能形成有感染力的病毒。雙生病毒具有廣泛的宿主細(xì)胞范圍，因此是一種很有潛力的植物病毒載體。第42頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三2、植物細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化程序槍擊法將待轉(zhuǎn)化的DNA沉淀在細(xì)小金屬珠的表面，用特制槍將金屬珠直接打入植物細(xì)胞，槍的威力為430m/s，植物細(xì)胞通常是胚胎細(xì)胞、玉米籽、葉子等，但進(jìn)去的DNA片段整合效率極低第43頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三3、電擊法

將高濃度的質(zhì)粒DNA加入到植物細(xì)胞的原生質(zhì)體懸浮液中，混合物在200-600V/cm

的電場中處理若干秒鐘，然后將原生質(zhì)體在組織培養(yǎng)基中生長1-2周，再生出整株植物第44頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三4、融合法將外源DNA與特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中這些疏水性化合物分子形成球狀的脂質(zhì)體，后者與植物細(xì)胞原生質(zhì)體融合，篩選融合子，再生植物細(xì)胞壁所有涉及到植物原生質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)化方法均存在一個難題，即：原生質(zhì)體很難再生出整株植物第45頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三5、花粉管導(dǎo)入法將外源DNA沿著花粉管經(jīng)過珠心進(jìn)入尚未形成正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞中，從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。是我國科學(xué)家周光宇首先提出設(shè)計的特點：直接、簡便。受體材料為植株整體，省略了細(xì)胞組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)和傳代過程，排除了植株再生的障礙，特別適合于難以建立有效再生系統(tǒng)的植物。由于轉(zhuǎn)化的是完整植株的卵細(xì)胞、受精卵或早期胚胎細(xì)胞，導(dǎo)入的DNA分子整合效率較高第46頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三3、重組DNA導(dǎo)入動物細(xì)胞磷酸鈣沉淀法脂質(zhì)體介導(dǎo)感染法顯微注射法轉(zhuǎn)基因動物的有效途徑；包括外源基因的制備、收集受精卵、顯微注射、受精卵移植病毒感染法DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)然技術(shù)電擊法第47頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三(1)磷酸鈣沉淀法：經(jīng)典而簡單的方法

先將DNA溶解在鈣鹽溶液中，不停攪拌逐滴加到磷酸鹽溶液中，形成磷酸鈣微結(jié)晶與DNA的共沉淀物，再與受體細(xì)胞混合、保溫，DNA可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并整合到寄主染色體上，多用于單層培養(yǎng)的細(xì)胞，也可用于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞。第48頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三(2)脂質(zhì)體載體法：

用脂質(zhì)體包埋核酸分子，然后導(dǎo)入細(xì)胞(3)顯微注射法理想外源基因的制備收集受精卵：從供體動物中取出單細(xì)胞的受精卵顯微注射將帶有目的基因的受精卵移入代理母體內(nèi)，收受精卵得到孕育，轉(zhuǎn)化率，50-100%(4)DAGE葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù)一般用于基因的瞬時表達(dá)，對細(xì)胞有毒性,有挑選性用于轉(zhuǎn)染少量DNA第49頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實驗規(guī)模下，每個受體細(xì)胞最多只能接受一個載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納DNA的個數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞不長）（五）轉(zhuǎn)化率及其影響因素第50頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中只有108個分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.4X1011個分子（6.02X1017/2686X660），也就是說，每3400個pUC18分子才有一個分子進(jìn)入受體細(xì)胞另一方面，在實際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2ml感受態(tài)細(xì)胞，大約含有2X1010個大腸桿菌細(xì)胞，也就是說，每200個細(xì)胞只有一個細(xì)胞能接納pUC18DNA

第51頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三普通轉(zhuǎn)化實驗中,pBR322質(zhì)粒:106轉(zhuǎn)化子菌落/ugλ噬菌體:104-106

噬菌斑/ug重組DNA分子轉(zhuǎn)化頻率一般下降102-104倍原因:

載體分子同插入DNA片段間的連接作用常是無效的,降低了有功能的質(zhì)?；蚴删wDNA的實際數(shù)量.

含有插入外源DNA片段的載體分子一般比較大,導(dǎo)致轉(zhuǎn)化頻率再度明顯下降.第52頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)化率的影響因素載體本身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同載體的空間構(gòu)象質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個數(shù)量級,插入片段的大小對質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低第53頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三受體細(xì)胞方面:

受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高轉(zhuǎn)化方法方面Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化106-107/mgDNA

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105-106/mgDNAl-DNA轉(zhuǎn)染107-108/mgDNA電穿孔轉(zhuǎn)化106-109/mgDNA供受體的比例:50-100ngDNA對應(yīng)于108

個受體細(xì)胞,加大DNA不能提高轉(zhuǎn)化率第54頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時間培養(yǎng)。在實驗時，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如：

Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的37℃培養(yǎng)一個小時原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過程

l噬菌體轉(zhuǎn)染后的30℃培養(yǎng)等，均屬擴(kuò)增操作第55頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三三、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）

由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子第56頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三1、載體表型檢測法(1)根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子的直接選擇法.質(zhì)粒及柯斯質(zhì)粒:具有抗藥性標(biāo)記或營養(yǎng)標(biāo)記噬菌體:形成噬菌斑.抗藥性記號的插入失活或β-半乳糖苷酶基因一類的顯色反應(yīng)是兩個典型的方法.第57頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三編碼有四環(huán)素抗性基因(tet)和氨卞青霉素抗性基因(amp)將外源DNA片段插在EcoRI位點非重組子呈Ampr、Tetr重組子呈Ampr、Tetr將外源DNA片段插在BamHI位點非重組子呈Ampr、Tetr

重組子呈Ampr、TetsROPROISalIBamHITetPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAmporipBR3224363bp（2）抗藥性標(biāo)記插入失活選擇法第58頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三抗藥性篩選法的基本操作：

先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Amp的平板再將Amp平板上的轉(zhuǎn)化子原位影印至含有Tet的平板上

在Amp平板上生長、但Tet平板上不長的轉(zhuǎn)化子即為重組子

挑出這樣的陽性克隆,擴(kuò)增分離帶有外源DNA插入片段的重組體質(zhì)粒AmpAmp+Tet影印挑選第59頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三β-半乳糖苷酶顯色篩選法顯色篩選法的基本原理原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍(lán)色反應(yīng)）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應(yīng)）等.外源基因插入到lacZ基因上,導(dǎo)致β-半乳糖苷酶失活,通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在X-gal-IPTG培養(yǎng)基中的顏色變化直接觀察出來.β-半乳糖苷酶可把乳糖水解成半乳糖和葡萄糖第60頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三載體：含有β-半乳糖苷酶基因lacZ的調(diào)控序列和頭146個aa的編碼序列宿主：缺失了lacZ’基因，可編碼β-半乳糖苷酶C端序列α-互補(bǔ)：lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體可以與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶隱性突變體之間實現(xiàn)互補(bǔ)第61頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三顯色篩選法的基本操作：將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標(biāo)記基因內(nèi)部，使之失活，此時重組子呈Ampr、lacZ-白色菌落；而非重組子則呈Ampr、lacZ+，藍(lán)色菌落pUC18AmplacZ'oriAp+X-gal第62頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三2、根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體分子的直接選擇法轉(zhuǎn)化進(jìn)來的外源DNA編碼的基因,能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主菌株所具有的突變發(fā)生體內(nèi)抑制或互補(bǔ)效應(yīng),從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征.第63頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三營養(yǎng)缺陷型篩選法

如載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細(xì)胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉(zhuǎn)化子

用于大腸桿菌的營養(yǎng)標(biāo)記基因常選用色氨酸生物合成基因trp+;用于高等哺乳動物細(xì)胞的營養(yǎng)標(biāo)記基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相應(yīng)的受體細(xì)胞則選擇tk-缺陷型:第64頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三局限性要求克隆的DNA片段包含一個完整的基因序列編碼的基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞中實現(xiàn)功能表達(dá).第65頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三3、凝膠電泳檢測法根據(jù)電泳比較它們的泳動速率挑選重組陽性菌第66頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三4.克隆DNA序列檢測（1）限制性酶切圖譜法所謂的限制性酶切圖譜法就是對載體上插入的外源DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時，工作量極大，實驗成本也高第67頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三限制性酶切圖譜法全酶解圖譜法：區(qū)分重組子與非重組子用BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA電泳觀察酶解產(chǎn)物片段重組子：2.7kb+4.0kb非重組子：2.7kb如果外源DNA片段也是2.7kb，最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，然后通過其長度來鑒定其是否為重組子pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBP4.0kb1.0kb0.8kbE第68頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三（2）序列分析DNA測序是最為準(zhǔn)確的重組子鑒定方法。第69頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三5.PCR擴(kuò)增檢測法PCR能在模板序列上擴(kuò)增出預(yù)期DNA片斷第70頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三6.核酸雜交法原理:利用放射性同位素32P或125I標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行的DNA-DNA或RNA-DNA雜交,利用堿基配對的原理檢測特定的重組克隆.核酸雜交的優(yōu)點:可以普遍應(yīng)用;適合于大量群體的篩選,只要有可用的特異性探針,就可以有效檢測任何一種插入的外源基因.第71頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三篩選目的克隆最常用的方法是探針雜交法。

探針是由目的基因的已知的信息決定的，有三種可能性：

1）目的基因在特定細(xì)胞中的豐度

2）基因所編碼的蛋白質(zhì)或者部分序列

3）基因是一個基因家族中的一個

第72頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三原位雜交篩選法原位雜交亦稱菌落雜交或噬菌斑雜交:指生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來的位置不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上,并在原位發(fā)生溶菌,DNA變性和雜交作用菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基因或DNA片段的同源序列設(shè)計并合成探針，以此搜尋篩選含有目的基因的目的重組子。其中，DNA同源序列之間的特異性互補(bǔ)雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù)第73頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三菌落原位雜交法的基本操作用硝酸纖維素薄膜影印克隆平板用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜80℃烘干固定影印薄膜薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫用SSC-SDS液洗滌雜交薄膜用X光膠片覆蓋薄膜感光

影印洗滌雜交感光第74頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三雜交探針的制備：用于菌落或噬菌斑原位雜交的探針必須滿足下列條件：單鏈結(jié)構(gòu)（雙鏈DNA可用堿變性）

足夠長度（至少12個堿基）內(nèi)部不含互補(bǔ)區(qū)

探針的制備方法或來源包括：人工合成cDNA合成同源序列mRNA

第75頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三探針標(biāo)記:(1)放射性同位素標(biāo)記:

常以32P-dNTP為標(biāo)記前體,通過缺口轉(zhuǎn)移的方法把天然DNA或RNA片段標(biāo)記上放射性同位素.優(yōu)點:制作簡單,高比放射性,好的放射性自顯影強(qiáng)度缺點:放射性同位素半衰期只有14.5天,對人體有一定損害.第76頁，講稿共85頁，2023年5月2日，星期三