鏈霉素誘變育種的方案課件

關(guān)于鏈霉素誘變育種的方案第1頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三元芳!此事你怎么看?第2頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三看目錄一、誘發(fā)突變（一）、出發(fā)菌株選擇（二）、誘變劑及誘變劑量的選擇（三）、影響誘變效果的因素（四）、平板分離二、突變株的篩選（一）、初篩（二）、復(fù)篩（三）、產(chǎn)物活性測(cè)定三、營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選四、高產(chǎn)變株最佳環(huán)境條件的調(diào)整第3頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三插曲(很有必要)誘變育種的一般程序如下：出發(fā)菌株----菌種純化(出發(fā)菌株性能測(cè)定)----制備斜面孢子----制備單孢子懸液(懸液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù))----誘變劑處理(存活菌數(shù)的測(cè)定并計(jì)算存活率)----平板分離(測(cè)定變異率)----挑取變異菌落并移植至斜面上----初篩(初篩數(shù)據(jù)分析，生產(chǎn)性狀的粗測(cè))----斜面?zhèn)鞔?---復(fù)篩(復(fù)篩數(shù)據(jù)分析，精確測(cè)定生產(chǎn)性狀)----變異菌株(菌株參數(shù)分析)----小型或中型投產(chǎn)試驗(yàn)----大型投產(chǎn)試驗(yàn)。

第4頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三

（一）、出發(fā)菌株的選擇選擇從自然界(土壤）中分離鏈霉菌放線菌是產(chǎn)生抗生素活性最大的一類微生物，迄今已在工業(yè)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)上都有利用抗生素成功的實(shí)例，而鏈霉菌又是放線菌中抗生素的主要產(chǎn)生菌，具有廣泛的物種多樣性和代謝多樣性，是重要的資源微生物，但在鏈霉菌中普遍存在遺傳不穩(wěn)定性，而引起抗生素產(chǎn)量下降。因此,我們要研究提高抗生素產(chǎn)量的方法，已期獲得更大產(chǎn)量的抗生素，而提高產(chǎn)量的最重要途徑是通過(guò)育種改變生產(chǎn)菌種。誘變育種是一種簡(jiǎn)便易行而且快速的選育方法，因而在抗生素的菌種篩選中應(yīng)用最廣泛。一、誘發(fā)突變第5頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三菌種的純化：1、土壤用無(wú)菌水浸泡，靜置取上清2、做梯度——上清分別稀釋10倍、100倍、1000倍等等3、使用鏈霉菌優(yōu)勢(shì)培養(yǎng)基（在上邊鏈霉菌比其他菌長(zhǎng)的快），用步驟2的各個(gè)梯度液體分別鋪板。4、按照鏈霉菌最適生長(zhǎng)溫度培養(yǎng)。5、選取菌落數(shù)在100個(gè)左右，菌落清晰無(wú)重疊的平板。6、根據(jù)伯杰氏菌種鑒定手冊(cè)中鏈霉菌的菌落外觀介紹，粗選出基本符合的鏈霉菌。7、挑取選出的菌落搖瓶培養(yǎng)，按照伯杰氏手冊(cè)做理化指標(biāo)檢測(cè)。8、符合伯杰氏手冊(cè)上理化指標(biāo)的，提總DNA，做16SrDNA擴(kuò)增，測(cè)序9、測(cè)序結(jié)果在NCBI上blast，最終確定菌種第6頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三鏈霉菌單孢子懸液的制備：所處理的細(xì)胞必須是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期同步生長(zhǎng)的細(xì)胞，并且是均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸液，將121℃滅菌２０－３０ｍｉｎ的無(wú)菌水加入到培養(yǎng)有鏈霉菌斜面的試管中，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，(所處理的細(xì)胞必須是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期同步生長(zhǎng)的細(xì)胞，并且是均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸液），將含有孢子的無(wú)菌水轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入玻璃珠，在搖床上打碎，經(jīng)濾膜過(guò)濾后即得到單孢子率在98％以上的單孢子懸液。目的：在引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時(shí)，使存活個(gè)體中DNA的結(jié)構(gòu)變異頻率大幅度提高。第7頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇該出發(fā)菌株的原因如下：

①對(duì)誘變劑的敏感性高；②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力；③可采用劃線分離法和稀釋分離法進(jìn)行純化；④該菌株變異幅度廣；⑤該菌株穩(wěn)定性較好。第8頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三（二）、誘變劑的選擇及誘變劑量的選擇選擇物理誘變劑中非電離輻射即紫外線。因?yàn)樽贤饩€是一種使用時(shí)間長(zhǎng)、效果好、設(shè)備簡(jiǎn)單、值得推廣的誘變劑，大約有80%的高產(chǎn)抗生素產(chǎn)生菌都曾經(jīng)用過(guò)紫外線這一誘變方法。紫外線的誘變育種紫外線的作用機(jī)制是使兩個(gè)嘧啶之間聚合，形成嘧啶二聚體，堿基不能正常配對(duì)。

紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長(zhǎng)為253.7nm，燈與處理物的距離為15～30cm，照射時(shí)間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。第9頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三最適誘變劑量的選擇在誘變育種中有兩條重要的實(shí)驗(yàn)曲線:①劑量-存活率曲線②劑量-誘變率曲線通過(guò)比較以上兩曲線，可找到劑量-存活率-誘變率三者的最佳結(jié)合點(diǎn)。在實(shí)際工作中，突變率往往隨劑量的增加而提高，但到達(dá)一定程度后，再提高劑量反而會(huì)使突變率降低。根據(jù)UV、X射線和乙烯亞胺等誘變效應(yīng)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)正變較多地出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負(fù)變較多地出現(xiàn)在偏高的劑量中。因此，在誘變工作中，大多傾向于采用較低劑量（致死率在70-80%）。第10頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三紫外線誘變的操作步驟：1．將細(xì)菌培養(yǎng)液以3000r／min離心5min，傾去上清液，加入無(wú)菌生理鹽水洗滌再離心。

2．將菌懸液放入巳滅菌的裝有玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)用手搖動(dòng)，以打散菌體。將菌液通過(guò)濾紙過(guò)濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，使細(xì)胞數(shù)約為108個(gè)／ml，作為待處理菌懸液。

3．取2～4ml制備的菌液加到直徑7cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無(wú)菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開(kāi)紫外燈預(yù)熱10min，然后開(kāi)啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或用黑紙包住，避免白熾光。第11頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三4．取未照射的制備菌液和照射菌液各0.5ml進(jìn)行稀釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。

5．取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶?jī)?nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120r／min振蕩培養(yǎng)4～6h。

6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。

7．挑取菌落進(jìn)行篩選。第12頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三（三）、影響誘變效果的因素（1）菌種遺傳特性各菌株因遺傳特性不同，對(duì)誘變劑敏感性也不一樣。（2）菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)絲狀菌孢子壁的厚度及表面的蠟質(zhì)會(huì)阻礙誘變劑滲入細(xì)胞。（3）環(huán)境條件的影響環(huán)境條件的影響包括：①誘變前預(yù)培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng)②溫度、pH、氧氣等外界條件對(duì)誘變效應(yīng)的影響第13頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三由接種環(huán)以無(wú)菌操作沾取少許待分離的材料，在無(wú)菌平板表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，使鏈霉菌細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開(kāi)來(lái)。如果劃線適宜的話，能將鏈霉菌細(xì)胞一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。并測(cè)定出其變異率（變異數(shù)與觀察總個(gè)體數(shù)的比值）。挑出變異菌落并移植至斜面上。（四）、平板分離：第14頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三分離后得到的菌落，真正能發(fā)生性能變好的所謂正突變個(gè)數(shù)極少，要從幾千萬(wàn)個(gè)菌落中選出幾個(gè)好的，與自然選育中的篩選方法相同?？煞譃槌鹾Y（平板篩選、搖瓶發(fā)酵篩選)和復(fù)篩。篩選的方法：隨機(jī)亂向篩選定向篩選突變是隨機(jī)不定向的，但是篩選是定向的，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是決定菌種某些特性保留或淘汰的“篩子”。二、突變株的篩選第15頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三初篩：以多為主，盡量擴(kuò)大篩選范圍。復(fù)篩：以質(zhì)和精為主，反復(fù)多次，結(jié)合自然分離，選育高產(chǎn)或其他優(yōu)良菌株。多級(jí)水平篩選：由于誘變產(chǎn)生高產(chǎn)突變株的頻率很低，而且實(shí)、驗(yàn)誤差又很難避免，所以篩選工作中常用多級(jí)篩選，一利于優(yōu)良菌株的獲得篩選根據(jù)主次分為初篩和復(fù)篩第16頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三平板菌落預(yù)篩根據(jù)特定代謝產(chǎn)物的特異性，利用瓊脂平板進(jìn)行篩選和活性粗測(cè)的方法，大幅度擴(kuò)大有效篩選量，提高篩選工作效率。搖瓶發(fā)酵篩選

優(yōu)點(diǎn)：不管種子或發(fā)酵過(guò)程的生產(chǎn)條件、生理?xiàng)l件如何，都與發(fā)酵罐大生產(chǎn)條件相近，可以模擬進(jìn)行。（一）、初篩缺點(diǎn)：在突變率小的情況下，如果菌落挑取少，很難篩選到理想的突變株第17頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三對(duì)初篩出來(lái)的菌株進(jìn)行復(fù)篩時(shí)，通常采用搖瓶培養(yǎng)法，一般一個(gè)菌株至少要重復(fù)3~5個(gè)瓶，培養(yǎng)后的發(fā)酵液必須采用精確分析方法測(cè)定。復(fù)篩過(guò)程中，要結(jié)合各種培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選，在不同培養(yǎng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)。（二）、復(fù)篩第18頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三篩選步驟如下：第19頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、步驟：搖瓶培養(yǎng)通常分為初篩和復(fù)篩，初篩因菌株多常常一株菌一瓶，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后逐個(gè)進(jìn)行活性測(cè)定，將生產(chǎn)性能高的菌株用沙土管或冷凍管保藏。復(fù)篩時(shí)取出，以一株3-5瓶，振蕩培養(yǎng)后，測(cè)定活性，以提高精確性。2、優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)條件與發(fā)酵罐接近，這樣篩選出來(lái)的菌容易在大生產(chǎn)中推廣。搖瓶培養(yǎng):3、注意事項(xiàng)：搖瓶的條件要盡量與發(fā)酵罐接近。且各搖瓶間的培養(yǎng)條件要盡量一致（搖瓶型號(hào)，裝量，瓶塞厚度或瓶口包扎紗布的層數(shù)，搖床轉(zhuǎn)數(shù)，溫度）第20頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三第21頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三培養(yǎng)基培養(yǎng)基脂肪酶產(chǎn)生菌透明圈法成色圈法果膠酶產(chǎn)生菌培養(yǎng)基培養(yǎng)基生長(zhǎng)圈法抑菌圈法嘌呤產(chǎn)生菌青霉素產(chǎn)生菌一、根據(jù)平板菌落生化反應(yīng)篩選變株第22頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三20℃37℃二、采用冷敏感菌篩選抗生素變株第23頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三加入抗生素不加抗生素三、濃度梯度法篩選法第24頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三四、復(fù)印技術(shù)快速篩選變株測(cè)定不同酵母菌胞內(nèi)脂肪含量的簡(jiǎn)單定量法蘇丹黑染色第25頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三1五、瓊脂大通量篩選變株第26頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三200搖瓶液體培養(yǎng)寥寥無(wú)幾產(chǎn)物活性鑒定培養(yǎng)基培養(yǎng)條件調(diào)整正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)第27頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三

1.瓊脂平板活性圈法2.紙片法:發(fā)酵液濃度高時(shí)3.瓊脂薄層紙片法4.自動(dòng)生化儀器分析法（三）、產(chǎn)物活性測(cè)定：第28頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三透明圈變色圈生長(zhǎng)圈抑菌圈(水解酶、有機(jī)酸）(產(chǎn)酸菌)(工具菌+待檢菌)(抗生菌)

本組方案采用瓊脂平板活性圈法中的抑菌圈來(lái)測(cè)定其活性。第29頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三與營(yíng)養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個(gè)體野生型菌株wildtypestrain原始菌株?duì)I養(yǎng)缺陷型auxotroph人工誘變或自然突變?cè)B(yǎng)型菌株prototroph回復(fù)突變或重組變異三、營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選第30頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型有關(guān)三類培養(yǎng)基

(1)基本培養(yǎng)基MM(2)完全培養(yǎng)基CM(3)補(bǔ)充培養(yǎng)基SM第31頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三突變株的表型 檢出方法營(yíng)養(yǎng)缺陷型補(bǔ)充培養(yǎng)基（auxotroph）

抗性突變型藥物培養(yǎng)基（resistantmutant）條件致死型培養(yǎng)條件改變（conditionallethalmutant）基因突變的類型第32頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三誘發(fā)突變淘汰野生型菌株檢出缺陷性鑒別缺陷性營(yíng)養(yǎng)缺陷性菌株的分離和篩選第33頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇合適的誘變劑與誘變方法誘變劑和誘變方法都要簡(jiǎn)便有效主要的誘變劑亞硝基胍,紫外線,亞硝酸誘變方法物理方法化學(xué)方法注意突變率還與誘變劑量有關(guān)（一）、營(yíng)養(yǎng)缺陷性的誘變第34頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.抗生素法青霉素法（細(xì)菌）作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖制霉菌法（酵母菌）作用于真菌細(xì)胞膜上的甾醇（二）、淘汰野生型菌株第35頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.菌絲過(guò)濾法適用于真菌和放線菌作用于絲狀菌的孢子3.高溫殺菌法適用于芽孢菌類作用于芽孢菌類的芽孢和營(yíng)養(yǎng)體第36頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三（三）、檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型①夾層培養(yǎng)法

②限量補(bǔ)充培養(yǎng)法

③影印接種法

④逐個(gè)檢出法

第37頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.夾層培養(yǎng)法（延遲補(bǔ)給法）第38頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.限量補(bǔ)充培養(yǎng)法第39頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三3.影印接種法第40頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三第41頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三需要注意兩點(diǎn)第一防止菌落擴(kuò)散和蔓延，在培養(yǎng)基中加入脫氧膽酸鈉第二為了克服孢子擴(kuò)散而帶來(lái)不純現(xiàn)象，在操作方法上改進(jìn)。第42頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三4.逐個(gè)檢出法第43頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、鑒定方法一種方法是加入一種物質(zhì)測(cè)定多株缺陷型菌株一種方法是測(cè)定一種缺陷型菌株對(duì)許多生長(zhǎng)因子的需求情況稱為生長(zhǎng)譜法（四）、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定第44頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、營(yíng)養(yǎng)缺陷型鑒定步驟<1測(cè)定缺陷性菌株所需生長(zhǎng)因子的類別<2具體測(cè)缺陷該類別物質(zhì)中的哪種因子<3用單一因子進(jìn)行復(fù)證試驗(yàn)（一）、營(yíng)養(yǎng)缺陷性的誘變第45頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)譜法鑒定

1.氨基酸混合液；

2.核酸堿基混合液；

3.維生素混合液；

營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定第46頁(yè)，講稿共56頁(yè)，2023年5月2日，星期三測(cè)定方法缺陷性菌株和基本培養(yǎng)基混合制成板，把