親合組織化學(xué)技術(shù)_第1頁
親合組織化學(xué)技術(shù)_第2頁
親合組織化學(xué)技術(shù)_第3頁
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文檔簡介

親合組織化學(xué)技術(shù)第1頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月發(fā)展歷史60年代:發(fā)現(xiàn)生物素和卵白素70年代:植物凝集素、生物素、葡萄球菌A蛋白------BRAB、LAB、SPA-HRP、ABC…親和組織化學(xué):1976年Bayer首次提出包括植物凝集素和糖類、生物素和抗生物素、葡萄球菌A蛋白與IgG、陽離子與陰離子、激素、維生素、糖及類脂質(zhì)作用部位和受體等第2頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月植物凝集素(Lectin)生物素(Biotin)葡萄球菌A蛋白(SPA)SPA—HRP法、ABC法和LAB法等。親合組織化學(xué)技術(shù)定義:是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ),建立的組織細(xì)胞基礎(chǔ)化學(xué)技術(shù)。本質(zhì):區(qū)別于一般的組織化學(xué),非抗原抗體反應(yīng)。優(yōu)點:敏感性高,有利于微量抗原(或抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位。第3頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月一抗生物素—生物素免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

二葡萄球菌蛋白A技術(shù)

三凝集素組織化學(xué)技術(shù)四其它親和細(xì)胞化學(xué)第4頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月一、抗生物素—生物素免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

(一)基本原理

親合素(抗生物素/卵白素)是雞蛋白中含有的一種堿性蛋白,屬于糖蛋白;具有4個同維生素H(生物素)親合力極高的結(jié)合點。

鏈酶親合素

是一種從鏈酶菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì),和親合素一樣,也有四個生物素結(jié)合位點,是一種親和力更高的生物素結(jié)合蛋白。生物素(維生素H)是一種小分子的水溶性維生素,它與親合素/鏈酶親合素之間有很強的親合力,較之抗體對抗原的親合力要高出100萬倍,能夠彼此牢固結(jié)合而不影響彼此的生物學(xué)活性。★

生物素、親合素、鏈酶親合素:能與熒光素、鐵蛋白和過氧化酶等相結(jié)合。★

親合素、鏈酶親合素:同一定濃度的生物素化酶混合后,形成親合素一生物素一酶復(fù)合物。這種復(fù)合物可以和各種生物素標(biāo)記抗體結(jié)合。第5頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月(二)幾種親合素—生物素染色技術(shù)

1親合素一生物素—過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(ABC)2.鏈酶親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(SABC法)3.標(biāo)記生物素—抗生物素技術(shù)(LAB)4.SP/SAP法5.Envision法6.CSA法第6頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月ABC復(fù)合物:親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物1親合素一生物素—過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(ABC)第7頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月⑴基本原理

是將親合素作為“橋”與生物素化的抗體與生物素結(jié)合的酶(HRP)連接起來。

第一抗體:為未標(biāo)記特異性抗體,能結(jié)合組織中待測抗原;第二抗體:為生物素化的橋抗體,能與第一抗體結(jié)合;

第三抗體:是結(jié)合了過氧化物酶的親合素復(fù)合物(即ABC)。優(yōu)點:敏感性強(比PAP高20-40倍);特異性強,背景染色淡;方法簡便,節(jié)約時間(比PAP縮短2h)

;由于生物素與抗生物素具有和多種示蹤物結(jié)合的能力,可用于雙重或多重免疫染色。第8頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月⑵操作步驟①冰凍切片或石蠟切片均可。②冰凍切片:丙酮固定,PBS洗5min,更換3次。石蠟切片:脫蠟,系列酒精至水。③第一抗體孵育,過夜。④PBS洗5min,更換3次。⑤加生物素標(biāo)記的第二抗體,孵育15min。

⑥PBS洗5min,更換3次。⑦加ABC復(fù)合物室溫作用15min。⑧PBS洗5min,更換3次。⑨用DAB顯色。⑩復(fù)染、封片、觀察。⑶結(jié)果

呈棕黃色為陽性表達,核被蘇木精染成淺藍色。第9頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月(4)注意事項

①消除內(nèi)源性生物素:染色前以0.01%的親合素和0.01%生物素溶液分別作用20min以消除內(nèi)源性生物素活性,每次作用后用PBS漂洗3次,5min。②消除內(nèi)源性過氧化物酶:可用3%H2O2孵育5-10分鐘以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。蒸餾水洗3次。③試劑的保存:溫度以4℃為佳,可達2年之久,在-20℃時其生物活性反而在短期內(nèi)被破壞。

此外,生物素制劑之間相互親和性差異大,注意廠家和批號。第10頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月SABC法原理:一抗+生物素化二抗+SABC復(fù)合物SABC復(fù)合物鏈霉卵白素-生物素-過氧化物酶生物素標(biāo)記的二抗鏈霉卵白素連接生物素標(biāo)記的酶。優(yōu)點:敏感性略高于SP法,低背景和操作簡便缺點:因體內(nèi)含有內(nèi)源性生物素,易產(chǎn)生非特異性染色。

一抗+生物素標(biāo)記二抗+滴加試劑SABC(鏈霉卵白素+辣根酶標(biāo)記生物素)+辣根酶底物顯色

2鏈酶親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(SABC法)第11頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月SABC試劑盒(含正常血清,生物素化二抗,SABC等)操作程序1)載玻片防脫處理:可選擇APES或Poly—Lysine,烤片。2)切片常規(guī)脫蠟至水。3)3%H202滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。4)抗原熱修復(fù):將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液(PH6.0),電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電,間隔5—10分鐘后,反復(fù)1—2次。冷卻后PBS洗滌。5)滴加5%BSA封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體,不洗。6)滴加適當(dāng)稀釋的一抗,37℃1小時左右或20℃2小時左右。也可4℃過夜。PBS(pH7.2—7.6)洗2分鐘×3次。對照切片用PBS代替一抗。第12頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月7)滴加生物素化二抗,20—37℃20分鐘。PBS(pH7.2—7.6)洗2分鐘×3次。8)滴加試劑SABC,20—37℃20分鐘。PBS(pH7.2—7.6)洗5分鐘×4次。9)DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒。取1ml蒸餾水,加試劑盒中A、B、C試劑各1滴,混勻后加至切片。室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時間,一般在5一30分鐘之間。蒸餾水洗滌。10)蘇木素輕度復(fù)染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。結(jié)果

棕褐色為陽性結(jié)果,而細(xì)胞核染為淡藍色。第13頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月

注意事項

1)染色背景過高:

在SABC反應(yīng)之后,DAB顯色之前,用加有0.0l一0.02%TWEEN20的PBS(pH7.2—7.6)洗滌切片4次,單純PBS洗2次,然后DAB顯色。

2)抗原熱修復(fù):可選0.01M枸櫞酸鹽緩沖液;也可以使用PBS、TBS等多種緩沖液。第14頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月3標(biāo)記生物素—抗生物素技術(shù)(LAB)原理:

第—抗體:生物素標(biāo)記;

第二抗體:酶標(biāo)記抗生物素(親合素)操作步驟:

⑴切片中加入生物素標(biāo)記一抗,室溫孵育1h,。⑵0.01MPBS洗3次,每次5min。⑶20-50ug/mlHRP-抗生物素液孵育。0.01MPBS漂洗3次。⑷DAB顯色。蒸餾水漂洗。⑸蘇木精復(fù)染核。梯度乙醇脫水、透明、封片、鏡檢。

應(yīng)用不如ABC普遍,但手續(xù)較簡便,但靈敏度低。第15頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月SP法(過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素/過氧化物酶標(biāo)記的堿性磷酸酶染色)

原理:一抗+生物素化二抗+酶標(biāo)記的鏈霉卵白素優(yōu)點:高靈敏度、低背景、操作方便缺點:不適用于內(nèi)源性生物素豐富的組織

第16頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月三步法(以SP試劑盒為例)

?

石蠟切片脫蠟至水。

?

蒸餾水沖洗,PBS浸泡5分鐘,如需采用抗原修復(fù),可在此步后進行。

?3%H2O2室溫孵育5-10分鐘,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,PBS沖洗,2分鐘×3次。

?5-10%正常山羊血清封閉,室溫孵育10分鐘。傾去血清,勿洗,滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液,37℃孵育1-2小時或4℃過夜。

?PBS沖洗,2分鐘×3次。

?

滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋),37℃孵育10-30分鐘;或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液,37℃或室溫孵育10-20分鐘。

?PBS沖洗,2分鐘×3次。

?

滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋),37℃孵育10-30分鐘;或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37℃或室溫孵育10-20分鐘。

?PBS沖洗,2分鐘×3次。

?

顯色劑顯色(DAB或AEC)。

?

自來水充分沖洗,復(fù)染,脫水透明(如需要)、封片。第17頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月原理:將二抗和酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個多聚體

優(yōu)點:1簡便、快速、敏感性是SP、SABC法的幾十倍。2人體組織中不含有這種多聚物,從而避免了組織中生物素的干擾缺點:因大分子穿透核膜困難,對于核內(nèi)抗原的定位不能選用此法。Envision法一抗+二抗標(biāo)記多聚螯合物酶Envision法第18頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月EnVision工作程序:

1)脫蠟、水化組織切片。

2)預(yù)處理組織切片(據(jù)一抗具體說明而定)

3)蒸餾水漂洗,置于PBS中。

4)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶(僅用于EnVisionTM/HRP)

5)蒸餾水漂洗,置于PBS,10分鐘

6)一抗孵育10-30分鐘

7)PBS漂洗10分鐘

8)EnVisionTM孵育10-30分鐘

9)PBS漂洗10分鐘

10)色源底物溶液孵育10分鐘

11)蒸餾水漂洗

12)復(fù)染及封片第19頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月CSA法(催化信號放大法)原理:是酪胺的過氧化物酶反應(yīng)(即HRP催化酪胺鹽,形成共價鍵結(jié)合位點),產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物,該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合,這樣在抗原—抗體結(jié)合部位就有大量的生物素沉積,與隨后加入的鏈霉親和素—HRP結(jié)合,如經(jīng)幾次這樣的循環(huán)放大,可以網(wǎng)絡(luò)許許多多的酶分子,最后通過DAB的顯色反應(yīng),其敏感性得到幾何級放大。優(yōu)點:比EnVision法敏感20~100倍。適合于實驗病理學(xué)和第一抗體昂貴、抗原性較弱的IHC檢測以及抗原破壞嚴(yán)重、抗原量較少的組織細(xì)胞抗原的檢測方法;核內(nèi)抗原的檢測(原為雜交)。缺點:操作步驟多、孵育時間長,存在嚴(yán)重的內(nèi)源性干擾,背景染色有時較重。第20頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月二、葡萄球菌蛋白A技術(shù)

葡萄球菌蛋白A(SPA):

金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì),作為橋抗體或標(biāo)記抗體不受種屬特異性的限制,它能和人及許多動物IgG結(jié)合,對IgG免疫球蛋白亞型的結(jié)合有選擇性。

葡萄球菌蛋白A(SPA)技術(shù)原理:結(jié)合部位是Fc段,不影響抗體的活性;結(jié)合力是雙價的,可同時結(jié)合兩個IgG分子;可將酶、熒光素、膠體金等標(biāo)記在SPA上。第21頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月SPA應(yīng)用:

1免疫球蛋白的制備和分析

能和IgG及其某些Fc段結(jié)合,可提純、分析免疫球蛋白制劑。

2應(yīng)用于免疫細(xì)胞化學(xué)

結(jié)合力是雙價的,可作為橋抗體或標(biāo)記抗體。且不受種屬特異性限制;

分子量小,穿透力強。

3應(yīng)用于多種細(xì)菌、支原體和病毒的簡易快速診斷

SPA菌體為載體,結(jié)合特異性抗體成為一種吸附原,作協(xié)同凝集素,用于細(xì)菌、病毒的定群和分型。

4可作為固相吸附劑研究免疫復(fù)合物、膜抗原、膜受體和膜Ig

第22頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月SPA在免疫細(xì)胞化學(xué)染色中的應(yīng)用SPA可被熒光素、酶、膠體金、鐵蛋白等標(biāo)記,其中最常用的酶為HRP1SPA-HRP用于間接法的染色

(1)切片脫蠟至水,3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。

(2)水洗后,PBS漂洗。

(3)加一抗,37℃孵育60min或4℃過夜。0.01MPBS漂洗3次。

(4)SPA-HRP室溫30min。0.01MPBS漂洗3次。

(5)DAB顯色。

(6)蘇木精復(fù)染,脫水,透明,封固。第23頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月2SPA用于PAP法的染色

(1)切片脫蠟至水,0.3%H202甲醇處理切片。

(2)10%卵蛋白Tris緩沖液處理20min。

(3)加第一抗體37℃孵育60min或4℃過夜。

(4)0.05MTris-HCl,pH7.6,洗滌3次。

(5)SPA(1ug/m1)孵育15min,0.05MTris-HCl溶液漂洗3次。

(6)PAP復(fù)合物(無動物種屬限制)孵育15min。0.05MTris-HCl溶液漂洗3次。(抗酶抗體+足量的酶==形成穩(wěn)定的五角形復(fù)合物)

(7)DAB顯色。

(8)蘇木精復(fù)染,脫水,透明,封固。第24頁,課件共27頁,創(chuàng)作于2023年2月三、凝集素組織化學(xué)技術(shù)凝集素(1ectin):從各種植物、無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白,能凝集紅細(xì)胞。常用:刀豆素(ConA)、麥胚素(WGA)、花生凝集素(PNA)、

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