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文檔簡介
菌種保藏一、菌種的含義:菌種:菌種是指食用菌、工業(yè)菌、農(nóng)用菌菌絲及其生長基質(zhì)組成的繁殖材料。分為母種(一級種)、原種(二級種)和栽培種(三級種)三級,也可以理解為保存著的、具有活性的菌株。微生物工業(yè)對菌種的要求1.原料廉價,生長迅速、目標(biāo)產(chǎn)物高。2.易于控制培養(yǎng)條件,酶活性高,發(fā)酵周期較短。3.抗雜菌和噬菌體的能力強。4.菌種遺傳性能穩(wěn)定,不易變化和退化,不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素,保證安全生產(chǎn)。5.對放大設(shè)備的適應(yīng)強。二、菌種保藏的重要意義:菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料,特別是利用微生物進行有關(guān)生產(chǎn),如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè),都離不開菌種。所以菌種保藏是進行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是使菌種不死亡,同時還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來,而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。菌種是一種極其重要和珍貴的生物資源,1980年我國成立了中國微生物菌種保藏委員會。菌種保藏的原理與方法微生物菌種保藏的概念:收集實驗室和生產(chǎn)用微生物(菌種、菌株、病毒毒株等,也包括動、植物的細胞株和微生物質(zhì)粒),運用適當(dāng)方法和措施使其長期存活并保持原種的生物學(xué)性狀穩(wěn)定不變,使之不死、不衰、不亂,以達到便于研究、交換和使用等目的的措施。微生物個體微小、代謝活躍、生長繁殖快,很容易發(fā)生變異,或被其他微生物污染,甚至死亡。因此根據(jù)實際情況選擇合適的保藏方法十分重要。一、菌種保藏的原理:菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理、生化特性,人工創(chuàng)條件使其生長代謝處于最低或幾乎停止的狀態(tài),以減少其變異和保持生物性狀。保藏時,一般利用菌種的休眠體(孢子、芽孢等),創(chuàng)造最有利于休眠狀態(tài)的環(huán)境條件,如低溫、干燥、隔絕空氣或氧氣、缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等,以降低菌種的代謝活動,減少菌種變異,使菌種處于“休眠”狀態(tài),抑制其繁殖能力,達到長期保存的目的。一個好的菌種保藏方法,應(yīng)能保持原菌種的優(yōu)良特性和較高的存活率,同時也應(yīng)考慮到方法本身的經(jīng)濟、簡便。國內(nèi)外主要菌種保藏機構(gòu)介紹國外(1)ATCC美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所,美國,馬里蘭州,羅克維爾市.(2)CSH冷泉港研究室,美國.(3)IFO日本大阪發(fā)酵研究所,日本大阪.(4)NRRL美國北部地區(qū)研究實驗會(5)CBS荷蘭霉菌中心保藏所(6)NCTC英國國家典型菌種保藏所現(xiàn)有菌種保藏的大體方法有1.傳代培養(yǎng)法2.懸液法3.載體法4.真空干燥法5.冷凍法菌種保藏的注意事項(1)菌種保藏所處的狀態(tài)大部分以均保藏其休眠體,保藏前選擇合適的培養(yǎng)時間。培養(yǎng)時間過長,生產(chǎn)性能會下降,反之保存時容易死亡。一般以稍低于生長最適溫度培養(yǎng)至孢子成熟保藏的菌種進行保藏,效果較好。(2)保藏所用的基質(zhì)一般使其營養(yǎng)成份貧乏較好,降低其代謝活動。冷凍時應(yīng)加入保護劑。(3)操作過程盡量減少對細胞結(jié)構(gòu)的損害,如選擇合適的凍結(jié)速度,加入保護劑等。細胞結(jié)構(gòu)的損傷不僅使菌種保藏的死亡率增加,而且容易導(dǎo)致菌種變異,造成菌種性能衰退。二、實驗室和生產(chǎn)實踐中常用的菌種保藏技術(shù)方法:1.斜面低溫保藏法(冰箱保藏法)2.礦物油中浸沒保藏法3.穿刺法4.濾紙法5.固體曲保藏法6.砂土管保藏法7.普通冷凍保藏8.超低溫冷凍保藏法9.冷凍干燥法10.液氮冷凍保藏法11.
寄主保藏保藏方法通常基于溫度、水分、通氣、營養(yǎng)成分和滲透壓等方面考慮1.斜面低溫保藏(冰箱保藏法)原理是利用低溫(4℃)降低菌種的新陳代謝,使菌種的特性在短時期內(nèi)保持不變。方法是:將菌種轉(zhuǎn)接在適宜的固體培養(yǎng)基斜面上,待其充分生長好后,用封口膜或油紙將棉塞部分包扎好,置于4℃冰箱中保存。斜面法保藏菌種的時間依微生物的種類不同而異。霉菌、放線菌以及形成芽孢的細菌保存3~5個月移種一次,普通細菌最好每月移種一次,假單胞菌則兩周傳代一次,酵母菌間隔2個月。注意事項1.保存期間要注意冰箱的溫度,不可波動太大,不能在0℃以下保存,否則培養(yǎng)基會結(jié)冰脫水,造成菌種性能衰退或死亡。2.此方法是一種短期、過渡的保藏方法此方法,一般不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長期保藏,一(4)抽樣進行無菌檢查,每10支沙土管抽一支,將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)48小時,若仍有雜菌,則需全部重新滅菌,再作無菌試驗,直至證明無菌,方可備用。
(5)選擇培養(yǎng)成熟的(一般指孢子層生長豐滿的,營養(yǎng)細胞用此法效果不好)優(yōu)良菌種,加入2~3mL無菌水,用接種環(huán)輕輕地將菌苔洗下,制成孢子懸液。(6)于每支沙土管中加入約0.5ml(一般以剛剛使沙土潤濕為宜)孢子懸液,以接種針拌勻。
(7)放入真空干燥器內(nèi),用真空泵抽干水分。每10支抽取一支,用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒,接種于斜面培養(yǎng)基上,進行培養(yǎng),觀察生長情況和有無雜菌生長,如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長,則說明制作的沙土管有問題,尚須進一步抽樣檢查。若經(jīng)檢查沒有問題,用火焰熔封管口(也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口),放冰箱(4℃)或室內(nèi)干燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌情況。
(8)需要使用菌種,復(fù)活培養(yǎng)時,取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi),置溫箱中培養(yǎng)。
此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌、放線菌,因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣,效果亦好,可保存2年左右,但對于營養(yǎng)細胞效果不佳。7.普通冷凍保藏由于該法的保藏溫度為-20℃,為了避免微生物受損傷致死,需要甘油作為保護劑。甘油的最終濃度為25%。具體操作如下:①配制濃度為50%的甘油溶液,121℃滅菌后備用;②制備菌懸液,一般菌懸液的濃度為108~1010個/mL;③將菌懸液和甘油溶液以等體積混合均勻后,置-20℃保藏?;蛘?,將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上,待生長適度后,將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好,同上置于冰箱中保存。普通冷凍保藏可以維持若干微生物的活力1~2年。應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度,培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴格密封。這一方法雖簡便易行,但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。8.超低溫冷凍保藏要求長期保藏的微生物菌種,一般都要求在-60~-80℃以下進行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是:1.離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞2.用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞;3.加入等體積的20%甘油或10%二甲亞砜;4.混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中,于-70℃超低溫冰箱中保藏。如果待保藏菌種生長在斜面上,則可用含10%甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃/min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。9.冷凍干燥法其基本原理是在較低的溫度下(-18℃),快速地將細胞凍結(jié),并且保持細胞完整,然后在真空中使水分升華。這樣菌種的生長和代謝活動處于極低水平,不易發(fā)生變異或死亡,因而能長期保存,一般為5~10年。此法適用于各種微生物。具體的做法是先將微生物制成懸浮液,與保護劑(一般為蔗糖、脫脂牛奶或血清等)混合,放在安瓿管內(nèi),用低溫酒精或干冰(-15℃以下)使之速凍,在低溫下用真空泵抽干,最后將安瓿管真空熔封,低凍溫保存?zhèn)溆?。冷凍干燥后的菌株無需進行冷凍保藏,便于運輸。(1)準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造,形狀可用長頸球形底的,亦稱淚滴型安瓿管,大小要求外徑6—7.5mm,長105mm,球部直徑9—11mm,壁厚0.6—1.2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞,1.05kg/cm2>,121.3℃滅菌30分鐘,備用。(2)準(zhǔn)備菌種,用冷凍干燥法保藏的菌種,其保藏期可達數(shù)年至十?dāng)?shù)年,為了在許多年后不出差錯,故所用菌種要特別注意其純度,即不能有雜菌污染,然后在最適培養(yǎng)基中用最適溫度培養(yǎng),使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細菌和酵母的菌齡要求超過對數(shù)生長期,若用對數(shù)生長期的菌種進行保藏,其存活率反而降低。一般,細菌要求24—48小時的培養(yǎng)物;酵母需培養(yǎng)3天;形成孢子的微生物則宜保存孢子;放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7—10天。(3)制備菌懸液與分裝以細菌斜面為例,用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中,制成濃菌液,每支安瓿管分裝0.2ml。(4)冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售,價值昂貴,此處介紹的是簡易方法與裝置,可達到同樣的目的。(5)真空干燥為在真空干燥時使樣品保持凍結(jié)狀態(tài),需準(zhǔn)備冷凍槽,槽內(nèi)放碎冰塊與食鹽,混合均勻,可冷至-15℃。安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶內(nèi)。抽氣一般若在30分鐘內(nèi)能達到93.3Pa(0.7mmHg)真空度時,則干燥物不致熔化,以后再繼續(xù)抽氣,幾小時內(nèi),肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥,一般抽到真空度26.7Pa(0.2mmHg),保持壓力6—8小時即可。(6)封口抽真空干燥后,取出安瓿管,接在封口用的玻璃管上,可用L形五通管繼續(xù)抽氣,約10分鐘即可達到26.7Pa(0.2mmHg)。于真空狀態(tài)下,以煤氣噴燈的細火焰在安瓿管頸中央進行封口。封口以后,保存于冰箱或室溫暗處。此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一,對一般生活力強的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用,即使對一些很難保存的致病菌,如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長期保存,一般可保存數(shù)年至十余年,但設(shè)備和操作都比較復(fù)雜。凍干菌種的保藏與再生1.保藏:冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20~-70℃)對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好。2.復(fù)蘇:在安瓿中加入0.5~1ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基,慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿,使凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中,或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀,可以將此直接振落入盛有l(wèi)~2ml液體培養(yǎng)基的試管中,輕輕振蕩5~l0min,然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。10.液氮冷凍保藏法液氮超低溫保藏法是近幾年才發(fā)展起來的,此法國外已較普遍采用,是適用范圍最廣的微生物保藏法。尤其是一些不產(chǎn)孢子的菌絲體,用其他保藏方法不理想,可用液氮保藏法,其保存期最長。原理:用液氮能長期保存菌種,這是因為液氮的溫度可達-196℃,遠遠低于其新陳代謝作用停止的溫度(-130℃),所以此時菌種的代謝活動已基本停止,化學(xué)作用亦隨之消失。
保藏方法1.冷凍管的制備:液氮保藏用的冷凍管要求既能經(jīng)121℃高溫滅菌又能在-196℃低溫長期存放。冷凍管一般容量為兩毫升。用自來水洗凈后經(jīng)蒸餾水沖洗多次,烘干,121℃滅菌30min.2.保護劑:配制10%~20%的甘油,121℃滅菌30min。使用前隨機進行無菌檢查。3.菌懸液制備:取新鮮的培養(yǎng)健壯的斜面菌種加入2~3mL保護劑,用接種環(huán)將菌苔洗下震蕩,制成菌懸液。4.樣品分裝:有不易褪色的記號筆在冷凍管上注明菌種編號,用無菌吸管吸取菌懸液,加入冷凍管中,每只管加入0.5mL菌懸液,擰緊螺旋帽。5.欲凍處理:設(shè)定降溫程序,室溫~0℃,5℃/min;0℃~-40℃,-1℃/min;-40℃~-70℃,-5℃/min,再轉(zhuǎn)入液氮管吊桶內(nèi),作好記錄。不具備程控降溫可以利用冰箱實現(xiàn)逐級降溫。先將冷凍管置4℃冰箱中放30min后轉(zhuǎn)入冰箱上格-18℃處放置20~30min,再置-30℃低溫冰箱或冷柜20min后,快速轉(zhuǎn)入-70℃超低溫冰箱。也可以使用干冰、鹽冰等方法降溫。6.保存:經(jīng)-70℃1h冷凍,將冷凍管快速轉(zhuǎn)入液氮罐液相中,并記錄菌種、位置、管數(shù)、存放日期以及操作者。7.解凍:需使用樣品時,戴上棉手套從液氮罐中取出冷凍瓶,用鑷子迅速放入37℃水浴鍋中搖動1~2min,樣品很快融化。然后在超凈臺上用無菌吸管取出菌懸液加入適宜的培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)。11.寄主保藏
適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的動植物病原菌和病毒。用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物,如病毒、立克次氏體、螺旋體等,它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代,此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進行保藏。核酸的保藏DNA和RNA常采用的保存方法1、以溶液形式置低溫保存:DNA溶于無菌TE緩沖液(10mmol/LTris·Cl,1mmol/LEDTA,pH8.0)中,其中EDTA的作用是螯合溶液中二價金屬離子,從而抑制DNA酶的活性(Mg2+是DNA酶的激活劑)。pH調(diào)至8.0是為了減少DNA的脫氫反應(yīng)。哺乳動物細胞DNA樣品中加入1滴氯仿,避免細菌和核酸的污染。RNA一般溶于無菌0.3mol/L醋酸鈉(pH5.2)或無菌雙蒸餾水中,也可在RNA溶液中加1滴0.3mol/LVRC(氯釩核糖核苷復(fù)合物),其作用
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