熒光光譜分析法課件

1第五章熒光分析法第一節(jié)熒光分析法的基本原理第二節(jié)熒光定量分析方法第三節(jié)熒光分光光度計2某些物質(zhì)受到光照射，除吸收某種波長的光之外，發(fā)射出比原來所吸收光的波長更長的光——光致發(fā)光（二級光）。光致發(fā)光熒光fluorescence磷光phosphorescence熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線的位置及其強度進行物質(zhì)鑒定和含量測定的儀器方法。

3分子熒光分析的特點：靈敏度高：一般紫外一可見分光光度法的檢出限約為10-7g/ml，而熒光分析法的檢出限可達到10-10甚至10-12

g/ml。選擇性好線性范圍寬應(yīng)用范圍窄4第一節(jié)熒光分析法的基本原理1.分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光molecularfluorescence★分子能級比原子能級復(fù)雜★在分子體系中，每個電子能級上都存在振動、轉(zhuǎn)動能層★室溫下大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動能層★在基態(tài)時，含有偶數(shù)個電子的分子，電子的ms為+1/2和-1/2,s=0，M=1。則該分子所處的電子能態(tài)稱為基態(tài)單重態(tài),用符號S0表示5分子吸收輻射后電子被激發(fā)且不發(fā)生自旋方向的改變ms為+1/2和-1/2,s=0，M=1。則該分子所處的電子能態(tài)稱為激發(fā)單重態(tài),用符號S表示。（S1S2S3…）電子被激發(fā)且伴隨著自旋方向的改變ms為+1/2和+1/2,s=1，M=3。則該分子所處的電子能態(tài)稱為激發(fā)三重態(tài),用符號T表示。（T1T2T3…）S06S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

4

外轉(zhuǎn)換l

3T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫9激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；熒光延遲熒光磷光輻射躍遷無輻射躍遷傳遞途徑內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛豫熒光：10-7～10-9s，第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)磷光：10-4～10s；

第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)10輻射和非輻射能量傳遞過程振動弛豫：同一電子能級中，以熱能量交換形式由高振動能層至低相鄰振動能層間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10-12s內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)的電子能級間的等能級的無輻射躍遷。通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換的時間10-13s。熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能層→基態(tài)(熒光多為S1→S0躍遷)，發(fā)射波長為3的熒光，10-7~10-9s。

發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長：

3>2>1；11系間跨越：激發(fā)態(tài)的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的非輻射躍遷。禁阻躍遷，但當(dāng)能層有較大重疊時S1T1就可發(fā)生系間跨越，通過自旋—軌道耦合進行。10-6s外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子之間碰撞引起的轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷。常發(fā)生在S1或T1S0外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)(T1→S0躍遷)；發(fā)光速度很慢：10-4~100s、磷光的能量比熒光小電子由S0進入T1的過程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動弛豫→T1光照停止后，可持續(xù)一段時間122.熒光的激發(fā)光譜與熒光光譜excitationspectrumandfluorescencespectrum（1）熒光的激發(fā)光譜

激發(fā)光譜：表示不同激發(fā)波長下所引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光的相對效率。

繪制激發(fā)光譜：固定發(fā)射波長(選最大發(fā)射波長),然后以不同波長的入射光激發(fā)熒光物質(zhì)，以熒光強度F對激發(fā)波長作圖，即為激發(fā)光譜。熒光分子都具有兩個特征光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）。13激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大，稱為最大激發(fā)波長ex（2）熒光的發(fā)射光譜（熒光光譜）熒光光譜表示在所發(fā)射的熒光中各種波長組分的相對強度。繪制發(fā)射光譜時，使激發(fā)光波長固定在ex處，然后對發(fā)射光譜掃描，測定各種波長下相應(yīng)的熒光強度，以熒光強度F

對發(fā)射波長作圖，得發(fā)射光譜圖（即熒光光譜）。發(fā)射光譜（熒光光譜）的位置？磷光光譜的位置？1415激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

a.Stokes位移

熒光光譜總是位于物質(zhì)激發(fā)光譜的長波一側(cè)，即熒光波長大于激發(fā)光波長的現(xiàn)象。

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值：振動弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換等物輻射躍遷損失了部分能量。

b.熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

電子可以躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖2、1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但熒光光譜卻只有一個發(fā)射態(tài)，如3。為什么？16c.

鏡像規(guī)則由于電子基態(tài)的振動能級分布與激發(fā)態(tài)相似，故通常熒光光譜與它的激發(fā)光譜成鏡像對稱關(guān)系。各小峰波長遞減值與振動能級差有關(guān)，各小峰的高度與躍遷幾率有關(guān)。17基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；基態(tài)上的某振動能級若躍遷到第一激發(fā)態(tài)的某振動能級的幾率較大的話，相反躍遷也如此。18二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure

1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率（）：物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率范圍一般是多少?如果一個分子將吸收的光子全部釋放，則其量子產(chǎn)率為100%。192.有機化合物的分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電子基，使熒光增強。（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強的熒光，酚酞卻沒有。2021三、影響熒光強度的因素

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure影響熒光強度的外部因素1.溶劑的影響同一物質(zhì)在不同溶劑中，其熒光光譜的形狀和強度都有差別。一般情況下，熒光波長隨著溶劑極性的增大而長移，熒光強度也有所增強。這是因為在極性溶劑中，ππ*躍遷所需的能量差△E小，而且躍遷幾率增加，從而使紫外吸收波長和熒光波長均長移，強度也增強。溶劑粘度減小時，可以增加分子間碰撞機會，使無輻射躍遷增加而熒光減弱。故熒光強度隨溶劑粘度的減小而減弱。由于溫度對溶劑的粘度有影響，一般是溫度上升，溶劑粘度變小，因此溫度上升，熒光強度下降。222.溫度的影響

熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，分子運動速度加快，分子間碰撞的幾率增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加，熒光效率降低。例如熒光素鈉的乙醇溶液，在0℃以下，溫度每降低10℃，f增加3％，在80℃時，f為1。23當(dāng)熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時，溶液的pH值對該熒光物質(zhì)的熒光強度有較大影響，這主要是因為在不同酸度中分子和離子間的平衡改變，離子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此熒光強度也有差異。每一種熒光物質(zhì)都有它最適宜的發(fā)射熒光的存在形式，也就是有它最適宜的pH值范圍。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡關(guān)系：

苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，由于NH2為提高熒光效率的取代基，故苯胺分子會發(fā)生藍色熒光。但在pH<2和pH＞13的溶液中均以苯胺離子形式存在，故不能發(fā)射熒光。3.溶液pH

對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制；244.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象

自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。

內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；255.熒光熄滅劑熒光熄滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑(quenchingmedium)。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物均為常見的熒光熄滅劑。266、散射光小部分光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運動方向發(fā)生改變而向不同角度散射。瑞利光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，只是光子運動方向發(fā)生改變。其波長與入射光波長相同。拉曼光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量。從而發(fā)射出比入射光稍長或稍短的光。散射光對熒光測定有干擾，尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光，與熒光波長接近，對測定的干擾大，必須采取措施消除。拉曼光的干擾主要來自溶劑，當(dāng)溶劑的拉曼光與被測物質(zhì)的熒光光譜相重疊時，應(yīng)更換溶劑或改變激發(fā)光波長27 選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長可消除拉曼光的干擾a:320nm或350nm為激發(fā)光，熒光峰總是在448nm。b:將空白溶劑分別在320nm及350nm激發(fā)光照射下測定熒光，激發(fā)光波長為320nm時，拉曼光波長是360nm，360nm的拉曼光對熒光無影響；當(dāng)激發(fā)光波長為350nm時，拉曼光波長是400nm，400nm的拉曼光對熒光有干擾，因而影響測定結(jié)果。

硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光與散射光譜

28四、熒光試劑

熒光試劑是一種可以使非熒光物質(zhì)或弱熒光物質(zhì)與其反應(yīng)之后，得到強熒光性產(chǎn)物的標(biāo)記物，從而可擴大熒光分析法的使用范圍1.有機化合物的熒光分析脂肪族化合物能產(chǎn)生熒光的為數(shù)不多。芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的化合物，因存在共軛體系而容易吸收光能，在紫外光照射下很多能發(fā)射熒光。有時為了提高測定的靈敏度和選擇性，常使弱熒光性物質(zhì)與某些熒光試劑作用，以得到強熒光性產(chǎn)物(衍生化)。因此，熒光分析法在有機物測定方面的應(yīng)用很廣。29能用熒光分析法測定的有機物包括多環(huán)胺類、萘酚類、嘌啉類、吲哚類、多環(huán)芳烴類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸類及蛋白質(zhì)等；藥物中的生物堿類如麥角堿、蛇根堿、麻黃堿、嗎啡、喹啉類及異喹啉類生物堿等；甾體類如皮質(zhì)激素及雌醇等；抗生素類如青霉素、四環(huán)素等；維生素類如維生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗壞血酸、葉酸及煙酰胺等。此外，中草藥中的許多有效成分，不少是屬于芳香性結(jié)構(gòu)的大分子雜環(huán)類，都能產(chǎn)生熒光，可用熒光分析法作初步鑒別及含量測定。熒光分析法的靈敏度高，選擇性較好，取樣量少，方法快速，已成為醫(yī)藥學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域進行科學(xué)研究工作的重要手段之一。以下是幾個重要的熒光試劑：30

1．熒光胺(fluorescamine)：能與脂肪族或芳香族伯胺類形成高度熒光衍生物，典型反應(yīng)如下： 熒光胺及其水解產(chǎn)物不顯熒光。100mg熒光胺溶于100ml無水丙酮中，放置24小時后即可使用。取相當(dāng)于10mg藥物的甲醇或水溶液0.lml，加適宜pH值的磷酸緩沖溶液5ml，加熒光胺試劑0.lml，混合，放置15分鐘后測定熒光強度。熒光條件為：λex=275、390nm，λem=480nm。31

2．鄰苯二甲醛(OPA)

在2巰基乙醇存在下，pH9～10的緩沖溶液中OPA能與伯胺類、特別是除半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸外的a氨基酸生成靈敏的熒光產(chǎn)物。取OPA500mg溶于10ml乙醇中，加200ml2巰基乙醇，將此混合液加至1L3％的硼酸溶液中，再用KOH調(diào)節(jié)至pH10，即為常用試劑溶液。熒光條件為：λex=340nm，λem=455nm。32

3．1二甲氨基5氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯)能與伯胺、仲胺及酚基的生物堿類反應(yīng)生成熒光性產(chǎn)物。取50mg或100mg試劑，溶解于500ml無水丙酮中即可使用。與丹酰氯類似的一個試劑是丹酰肼(Dansyl－NHNH2)，它能與可的松的羰基縮合，產(chǎn)生強烈熒光。熒光條件為：λex=365nm，λem=500nm左右。丹酰氯試劑不穩(wěn)定，其水解產(chǎn)物DansylOH呈藍色熒光，必須暗處保存，每周重新配制。332.生物與有機化合物的分析34無機離子一般不顯熒光，與有機試劑形成有熒光的配合物后，可測量約60種元素及離子鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土——采用熒光分析法氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳——采用熒光熄滅法測定銅、鐵、鈷、鋨及過氧化氫——采用催化熒光法測定鉻、鈮、鈾、碲——采用低溫?zé)晒夥y定鈰、銪、銻、釩、鈾——采用固體熒光法測定2.無機化合物的分析35第二節(jié)熒光定量分析方法一、熒光強度與物質(zhì)濃度的關(guān)系當(dāng)一束強度為I0的紫外/可見光照射一濃度為c、液層厚度為d的液槽時，可在溶液的各個方向觀察到熒光，其由于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)占被分析物的數(shù)量相當(dāng)有限，且就這少量的熒光物質(zhì)幾乎在同一波長段產(chǎn)生光致發(fā)光，所以熒光法很少用來定性分析

吸收光強度為Ia透過光強度為It熒光強度為FI0It

IaF垂直方向36（=I0-It）熒光強度正比于被熒光物質(zhì)吸收的光強度IaF=K’(I0–It)K’：取決于熒光效率f根據(jù)BeerLaw=10-clItI0F=K’(I0-

I010-cl)=K’I0(1-

10-cl)=K’I0(1-

e–2.303cl)由于ex=1+x+x2/