高三生物一輪復(fù)習(xí)課件基因工程的基本操作程序

基因工程

概念圖1.概念:按照人們的意愿，把一種生物的某種

出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，

（定向/不定向）地改造生物的遺傳性狀。2.別名:

。3.原理:

。4.操作對象:

。5.操作水平:

。6.操作環(huán)境:生物

（體內(nèi)/體外）進(jìn)行7.結(jié)果：

。8.優(yōu)點(diǎn)：

（1）

。

（2）

等。基因重組DNA分子水平基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)基因體外創(chuàng)造出符合人們需要的生物類型和生物產(chǎn)品基因定向

定向改造生物性狀（目的性強(qiáng)）克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙一.基因工程原理【探究】人的胰島素基因能通過拼接并在受體細(xì)胞大腸桿菌中表達(dá)出相同蛋白質(zhì)--胰島素的理論基礎(chǔ)：（1）大腸桿菌和人的遺傳物質(zhì)都是

。（2）不同生物的DNA分子能夠拼接在一起，原因是

。

（3）同一種基因在不同生物體內(nèi)表達(dá)出來的蛋白質(zhì)相同，因?yàn)?/p>

。（4）遺傳信息的傳遞都遵循

。

(5)

為什么一種生物的基因可以在另一種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)？

。

DNA中心法則基因的組成、空間結(jié)構(gòu)和堿基互補(bǔ)配對方式相同所有生物共用一整套遺傳密碼①基因是控制生物性狀的獨(dú)立遺傳單位②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則③生物界共同一套遺傳密碼一.基因工程原理工具工具酶分子運(yùn)輸車：

。（１）

。（２）

。限制酶ＤＮＡ連接酶運(yùn)載體【易錯(cuò)警示】工具酶≠工具質(zhì)粒λ噬菌體的衍生物動(dòng)植物病毒二.基因操作基本的工具1.限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)原核生物數(shù)千特定核苷酸序列磷酸二酯鍵黏性末端二.基因操作基本的工具（1）限制酶切割DNA產(chǎn)生黏性末端的過程和黏性末端的表示方法：【例析】如EcoRI酶能識(shí)別-GAATTC-序列，并在G與A之間切割，請表示:

1.限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)二.基因操作基本的工具

一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向、對稱、重復(fù)排列的。（大部分限制酶切割結(jié)果為黏性末端）EcoRⅠ識(shí)別的序列切點(diǎn)切點(diǎn)EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’HaeⅢ識(shí)別的序列（2）下表中列出了幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)．請回答下列問題：（1）請寫出同時(shí)用EcoRⅠ切割質(zhì)粒和含目的基因的DNA的過程。（2）請寫出同時(shí)用BamH和HindⅢ切割質(zhì)粒和含目的基因的DNA的過程二.基因操作基本的工具限制酶切質(zhì)粒二.基因操作基本的工具DNA連接酶連接二.基因操作基本的工具重組質(zhì)粒二.基因操作基本的工具（3）用限制酶切割時(shí)需注意的事項(xiàng)①獲取目的基因和切割載體時(shí),通常使用同種限制酶,目的是

。但是使用該法缺點(diǎn)是容易發(fā)生

，為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是

。②獲取一個(gè)目的基因需限制酶切割

次,共產(chǎn)生

個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。為了產(chǎn)生相同的黏性末端，便于連接兩4分別使用兩種限制酶去切割目的基因和運(yùn)載體目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒反向連接1.限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)二.基因操作基本的工具③選擇限制酶切割位點(diǎn)的基本原則：A.切割目的基因時(shí)：

。B.切割質(zhì)粒時(shí)：

。能切下目的基因且不破壞目的基因至少保留一個(gè)完整的標(biāo)記基因，便于篩選1.限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)二.基因操作基本的工具磷酸二酯鍵大腸桿菌黏性末端黏性末端2.DNA連接酶二.基因操作基本的工具（1）限制酶與DNA連接酶的關(guān)系(如下圖)：（2）DNA連接酶與DNA聚合酶的關(guān)系(如下圖)：相同點(diǎn)——作用位點(diǎn)都在磷酸二酯鍵不同點(diǎn)——DNA聚合酶DNA連接酶DNA連接酶DNA聚合酶：單個(gè)核苷酸與DNA片段DNA連接酶：DNA片段與DNA片段DNA聚合酶作用需要模板，而DNA連接酶不需要2.DNA連接酶二.基因操作基本的工具項(xiàng)目種類作用底物作用部位作用結(jié)果限制酶DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶DNA解旋酶DNA分子磷酸二酯鍵形成黏性末端或平末端DNA分子片段磷酸二酯鍵連接DNA分子片段脫氧核苷酸磷酸二酯鍵形成新DNA分子DNA分子磷酸二酯鍵形成脫氧核苷酸DNA分子堿基對間的氫鍵形成單鏈DNA分子（3）五種酶的比較2.DNA連接酶二.基因操作基本的工具環(huán)狀雙鏈DNA分子噬菌體有一個(gè)至多個(gè)自我復(fù)制受體DNA標(biāo)記3.載體二.基因操作基本的工具能夠在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定保存

對受體細(xì)胞無害λ噬菌體的衍生物(1)在進(jìn)行基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的(2)λ噬菌體的衍生物或某些動(dòng)植物病毒作為運(yùn)載體利用的原理是

.病毒對宿主細(xì)胞的侵染具有一定的

性。利用病毒對宿主細(xì)胞的侵染性物種（組織）特異例5.若用家蠶作為某基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用

作為載體，其原因是

。噬菌體噬菌體的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，而不是家蠶3.載體二.基因操作基本的工具(4)【分子運(yùn)輸車--質(zhì)粒】①來源：來源于許多

等生物，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的

（化學(xué)本質(zhì)），故質(zhì)粒有

個(gè)游離的磷酸基團(tuán)②氨芐青霉素抗性基因在質(zhì)粒DNA上稱為

，還有如：

等；其作用是

。③復(fù)制原點(diǎn)：

。細(xì)菌和酵母菌雙鏈環(huán)狀DNA分子0標(biāo)記基因用于鑒別和篩選含有目的基因的受體細(xì)胞DNA分子復(fù)制的起點(diǎn)卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因3.載體二.基因操作基本的工具(1)質(zhì)粒與擬核中的DNA有哪些相同點(diǎn)：（至少寫出兩點(diǎn)）

①

。

②

。

③

。(2)質(zhì)粒

（是/不是）一種細(xì)胞器。(3)細(xì)胞膜上的載體蛋白與基因工程中的載體的區(qū)別

①化學(xué)本質(zhì)不同：細(xì)胞膜上的載體：

?；蚬こ讨械妮d體可能是物質(zhì)，如

；也可是生物，如

；也可是λ噬菌體的衍生物。

②功能不同：細(xì)胞膜上的載體功能是

;基因工程中的載體是一種“分子運(yùn)輸車”,把

?；瘜W(xué)本質(zhì)和結(jié)構(gòu)相同能夠自我復(fù)制具有遺傳效應(yīng)或都能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成等不是蛋白質(zhì)質(zhì)粒動(dòng)植物病毒協(xié)助細(xì)胞膜控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞總結(jié)：易錯(cuò)點(diǎn)撥3.載體二.基因操作基本的工具例6.在基因工程中，已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。根據(jù)下圖示判斷下列操作錯(cuò)誤的是()A.質(zhì)粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割B.用限制酶切割獲得目的基因時(shí)，有四個(gè)磷酸二酯鍵被水解C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后獲得的黏性末端相同D.質(zhì)粒中標(biāo)記基因便于篩選出目的基因已經(jīng)表達(dá)的細(xì)胞E.用酶I和酶II形成相同的黏性末端，且用DNA連接酶連接的重組DNA還能用上面兩種酶切割DE二.基因操作基本的工具例7.某線性DNA分子含有3000個(gè)堿基對(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的產(chǎn)物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如圖所示。下列有關(guān)說法正確的是()a酶切割產(chǎn)物(bp)b酶再次切割產(chǎn)物(bp)1600；1100；300800；300A.在該DNA分子中，a酶與b酶的識(shí)別序列分別有3個(gè)和2個(gè)B.a酶與b酶切出的黏性末端不能相互連接C.a酶與b酶切斷的化學(xué)鍵不相同D.用這兩種酶和DNA連接酶對該DNA分子進(jìn)行反復(fù)切割、連接操作，若干循環(huán)后，D－TCTAGG－－AGATCC－序列會(huì)明顯增多二.基因操作基本的工具科研人員嘗試構(gòu)建IL-2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表達(dá)載體應(yīng)選擇限制酶___________

來切割質(zhì)粒A，然后直接將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒A混合，同時(shí)加入DNA連接酶，使得目的基因與質(zhì)粒A相連。若目的基因與質(zhì)粒A正向連接，用BamHI和SacI同時(shí)切割重組質(zhì)粒，完全酶切后的產(chǎn)物的長度約為_____________bp。

5480bp、1061EcoRV（717bp）1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測與鑒定獲取目的基因的常用方法：1.從基因文庫中獲取目的基因2.人工合成目的基因基因表達(dá)載體的組成：啟動(dòng)子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因植物細(xì)胞：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(常用）、基因槍法、花粉管通道法動(dòng)物細(xì)胞（受精卵）：顯微注射法微生物細(xì)胞：感受態(tài)細(xì)胞法檢測方法：1.分子水平：DNA分子雜交法、分子雜交法、抗原－抗體雜交法2.個(gè)體水平：抗蟲鑒定抗病鑒定、活性鑒定等三.基因工程的基本操作程序

獲取目的基因的常用方法：獲取方法①從基因文庫中獲得②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增③人工合成法A.逆轉(zhuǎn)錄法B.化學(xué)合成法三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的獲取(2)人工合成法：

逆轉(zhuǎn)錄法：即以

作為模板，在

酶的作用下合成

，若要運(yùn)用該方法獲得人的胰島素基因，則只能從人的

細(xì)胞中提取到胰島素的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲取胰島素基因；原因是

。上述方法獲得的胰島素基因（cDNA）在基因結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)是

。

mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA胰島B胰島素基因只會(huì)在胰島B細(xì)胞中表達(dá)，其他細(xì)胞中不表達(dá)基因只包括了編碼區(qū)中的外顯子序列，而沒有非編碼區(qū)和內(nèi)含子序列三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的獲取(3)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外DNA雙鏈復(fù)制已知目的基因的核苷酸序列引物DNA或RNA單鏈引物的5′端與模板鏈3′端互補(bǔ)配對【思考】合成引物時(shí)是否需要知道目的基因的所有的堿基序列？三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的獲?、扪由鞎r(shí)需要加入兩種引物，原因是

。⑦兩種引物的要求：

。⑧PCR反應(yīng)的基本步驟：

、

、

。DNA是反向平行的雙鏈，DNA聚合酶只能從引物3′端延伸DNA鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增引物自身不能環(huán)化兩種引物之間不能互補(bǔ)配對引物長度不宜過短，防止引物隨機(jī)結(jié)合變性復(fù)性延伸(3)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的獲?、嵫h(huán)過程變性模板DNA加熱至900C以上時(shí)，模板DNA雙鏈解聚為單鏈。復(fù)性溫度下降到50℃左右，兩種引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合。延伸溫度上升到72℃，在Taq酶的作用下，以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對的原則，合成一條新的DNA鏈(3)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的獲取PCR擴(kuò)增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律⑨循環(huán)過程(3)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的獲取A.上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板B.有最初母鏈的兩個(gè)DNA分子只含一個(gè)引物，其它子代DNA分子都為兩個(gè)引物分子C.處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長⑩PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸預(yù)變性

94°C,5min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min(3)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因三.基因工程的基本操作程序1.目的基因的獲取(1)在PCR過程中實(shí)際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成

的原料，又可為DNA的合成提供

。(2)引物既可以是DNA單鏈，也可以為

。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，也需要

，一般為RNA片段。(3)真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要

激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加

。DNA子鏈能量RNA單鏈引物Mg2＋Mg2＋總結(jié)：PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較三.基因工程的基本操作程序(1)在PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)

（需要/不需要）解旋酶，原因是

。(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因前，需根據(jù)目的基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)

種引物，進(jìn)行PCR時(shí)需加熱至90∽95度然后冷卻至55∽60度，此操作的目的是

。例1.如圖為PCR技術(shù)擴(kuò)增圖解，請回答下列問題不需要PCR過程中是通過高溫使DNA雙鏈解聚為單鏈的，而不是用解旋酶兩①90∽95度高溫使DNA解聚為單鏈，②然后冷卻至55∽60度使兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合三.基因工程的基本操作程序（3）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，需要加入兩種引物，原因是

，在DNA聚合酶的作用下，兩條子鏈的延伸方向都是

。DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于

之間的DNA序列，若這個(gè)過程中消耗了引物62個(gè),則進(jìn)行了

輪的DNA復(fù)制。(4)目的基因能被準(zhǔn)確擴(kuò)增的原因是

。DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增兩個(gè)引物從子鏈的5′端向3′端延伸5目的基因獨(dú)特的雙螺旋結(jié)構(gòu)提供了精確的復(fù)制模板；堿基互補(bǔ)配對原則保證復(fù)制準(zhǔn)確的進(jìn)行

(2n+1-2)=62三.基因工程的基本操作程序(5)PCR技術(shù)的必需條件，除了模板、原料、酶之外，至少還有三個(gè)條件，即液體環(huán)境、適宜的__________和_________，前者由________

自動(dòng)調(diào)控，后者則靠___________來維持。（6）從理論上講，在PCR技術(shù)中，循環(huán)4次產(chǎn)生的DNA分子中，第四次循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為

。（7）假設(shè)DNA片段有150個(gè)脫氧核苷酸對，若DNA分子中胞嘧啶脫氧核苷酸有70個(gè)，則5次循環(huán)，需要胸腺嘧啶脫氧核苷酸

個(gè)（不考慮引物所對應(yīng)的片段）（8）假設(shè)DNA片段有200個(gè)脫氧核苷酸對，經(jīng)3次擴(kuò)增后，從理論上計(jì)算，除需要引物14個(gè)外（注：每個(gè)引物中含有20個(gè)脫氧核苷酸），還需要游離的脫氧核苷酸

個(gè)。溫度PH值PCR擴(kuò)增儀

緩沖液15/1624802520(2n-1)T(2n-1)400-20×14(2n+1-2)=14三.基因工程的基本操作程序（9）用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)了引物Ⅰ、Ⅱ，其連接部位如下圖所示，X為某限制酶識(shí)別序列。擴(kuò)增得到的絕大部分DNA片段是圖A-D中的（）D

三.基因工程的基本操作程序（1）構(gòu)建目的：

；

。（2）構(gòu)建過程：2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建—基因工程的核心：

同種限制酶如果使用兩種限制酶同時(shí)切割目的基因和質(zhì)粒，有何優(yōu)點(diǎn)?

。若只考慮兩兩連接，質(zhì)粒和目的基因至少可以連接

種；即

?？煞乐鼓康幕蚝唾|(zhì)粒自身環(huán)化以及目的基因與運(yùn)載體的反向連接3目的基因-目的基因、質(zhì)粒-質(zhì)粒、目的基因-質(zhì)粒①使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代。②使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用三.基因工程的基本操作程序目的基因載體限制酶同種限制酶DNA連接酶載體-載體目的基因-目的基因目的基因與運(yùn)載體結(jié)合載體-目的基因三.基因工程的基本操作程序（3）基因表達(dá)載體的組成及作用：①目的基因：能控制表達(dá)所需要的特殊性狀。②啟動(dòng)子作用：

。③終止子：使

終止的特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段。④標(biāo)記基因：種類：

。作用：

。⑤復(fù)制原點(diǎn)：

。轉(zhuǎn)錄四環(huán)素抗性基因，卡那霉素抗性基因，氨芐青霉素抗性基因等抗生素抗性基因用于鑒別和篩選含有目的基因的受體細(xì)胞DNA分子復(fù)制的起點(diǎn)啟動(dòng)子具有物種和組織特異性。即只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)。如：構(gòu)建在水稻胚乳細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的表達(dá)載體需要選擇的啟動(dòng)子是

。水稻胚乳細(xì)胞啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建—基因工程的核心：三.基因工程的基本操作程序目的基因啟動(dòng)子終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建—基因工程的核心：三.基因工程的基本操作程序（3）基因表達(dá)載體的組成及作用：A.生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；B.通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；C.目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；D.為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。理由是：三.基因工程的基本操作程序思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？E.如何篩選出插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落？在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生一些菌落，然后將這些菌落按照原來的位置轉(zhuǎn)移到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，一段時(shí)間后，某些菌落將會(huì)出現(xiàn)停止增殖的現(xiàn)象，這些菌落的位置在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中對應(yīng)的位置的菌落即為插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落。（將目的基因插入抗四環(huán)素基因內(nèi)部）2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建—基因工程的核心：三.基因工程的基本操作程序（3）基因表達(dá)載體的組成及作用：例2.（2020，高三，衡水）目前基因工程所用的質(zhì)粒載體主要是以天然細(xì)菌質(zhì)粒的各種元件為基礎(chǔ)重新組建的人工質(zhì)粒，pBR322質(zhì)粒是較早構(gòu)建的質(zhì)粒載體，其主要結(jié)構(gòu)如圖一所示：(1)構(gòu)建人工質(zhì)粒時(shí)要有抗性基因，以便于______________________________。觀察上圖，如果A為質(zhì)粒，則C表示

。供重組DNA的鑒定和選擇重組質(zhì)粒三.基因工程的基本操作程序(2)pBR322分子中有單個(gè)EcoRⅠ限制酶作用位點(diǎn)，EcoRⅠ只能識(shí)別序列—GAATTC—，并只能在G與A之間切割。若在某目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)EcoRⅠ的切點(diǎn)，請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。

。三.基因工程的基本操作程序(3)pBR322分子中另有單個(gè)的BamHⅠ限制酶作用位點(diǎn)，現(xiàn)將經(jīng)BamHⅠ處理后的質(zhì)粒與用另一種限制酶BglⅡ處理得到的目的基因，通過____________作用恢復(fù)________________________鍵，成功地獲得了重組質(zhì)粒。能形成重組質(zhì)粒的原因是______________________________________________。DNA連接酶磷酸二酯鍵兩種限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同三.基因工程的基本操作程序

ampR和tetR（或氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因）能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素pBR322質(zhì)粒三.基因工程的基本操作程序(1)轉(zhuǎn)化：指

。(2)常用的受體細(xì)胞：①原核生物：

。②真核生物：

。(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：

。

(4)常用的方法：植物細(xì)胞：

。動(dòng)物細(xì)胞：

。微生物細(xì)胞：

。酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑大腸桿菌枯草桿菌土壤農(nóng)桿菌等農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞法目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：三.基因工程的基本操作程序③農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀導(dǎo)入農(nóng)桿菌A.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：三.基因工程的基本操作程序提純含目的基因表達(dá)載體取卵顯微注射受精卵發(fā)育受精卵移植到子宮新性狀動(dòng)物早期胚胎B.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：三.基因工程的基本操作程序C.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①常用法:

.②常用菌：

。③微生物作為受體細(xì)胞的原因是

。④過程：Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNACa2+處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)大腸桿菌繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少⑤受體細(xì)胞用Ca2+處理的目的是

。⑥用Ca2+處理受體細(xì)胞是通過改變

的通透性來完成使其變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞，容易吸收周圍環(huán)境中的DNA分子細(xì)胞壁3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：三.基因工程的基本操作程序(1)DNA分子探針：

。(2)檢測和鑒定

①

，它是目的基因能否在個(gè)體內(nèi)穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵，采用的技術(shù)是

。

②

是檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步，該過程采用的技術(shù)是

。

③檢測目的基因是否成功翻譯出蛋白質(zhì)A.分子水平檢測：

。

放射性同位素標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段DNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)抗原--抗體雜交檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因檢測目的基因是否成功轉(zhuǎn)錄出mRNA三.基因工程的基本操作程序4.目的基因的檢測與鑒定：提取蘇云金桿菌Bt毒蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒蛋白的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)探針:32P轉(zhuǎn)基因生物的mRNA:雜交帶三.基因工程的基本操作程序b.活性比較實(shí)驗(yàn):將基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較，以確定功能活性是否相同。B.個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定a.檢測生物是否具有該蛋白質(zhì)賦予的某種特性以及具有該特性的程度。如：抗蟲：做抗蟲接種實(shí)驗(yàn)，觀察（害蟲/生物）的生存狀況抗病：做病原體接種實(shí)驗(yàn)，觀察（病原體/生物）的生存狀況抗鹽：將轉(zhuǎn)基因植物移栽到?？购簩⑥D(zhuǎn)基因植物移栽到

環(huán)境中，觀察其生長狀況鹽堿地害蟲生物低溫（寒冷）三.基因工程的基本操作程序4.目的基因的檢測與鑒定：【思維探究】(1)已知真核生物基因中通常有內(nèi)含子，而原核生物基因中沒有，原核生物沒有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列的機(jī)制。某同學(xué)從人的基因組文庫中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細(xì)胞卻未得到蛋白A，其原因是

。(2)人體合成的初始胰島素，需要經(jīng)過膜系統(tǒng)加工形成特定的空間結(jié)構(gòu)才有生物活性，把胰島素基因?qū)氪竽c桿菌時(shí)形成的胰島素沒有生物活性，原因是

。(3)為了避免抗蟲基因通過花粉傳播給其他植物，應(yīng)將該目的基因?qū)?/p>

（細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)）中理由是

?；駻有內(nèi)含子，在大腸桿菌中，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列不能被切除，無法表達(dá)出蛋白A大腸桿菌是原核生物，沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體，無法對形成的胰島素進(jìn)行加工細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)基因具有母系遺傳的特點(diǎn)三.基因工程的基本操作程序(4)假如用得到的二倍體轉(zhuǎn)基因耐旱植株自交，①子代中耐旱與不耐旱植株的數(shù)量比為3∶1時(shí)，②若子代全部耐旱。嘗試推測該耐旱基因分別整合到了什么位置上？（答“同源染色體的一條上”或“同源染色體兩條上”_________________，