蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)

蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)第1頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)一、功能基團(tuán)的特異性修飾多位點(diǎn)取代單一的限制性取代次級(jí)取代二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾嵌合蛋白質(zhì)—非共價(jià)締合系統(tǒng)二硫鍵與嵌合蛋白質(zhì)的形成嵌合蛋白質(zhì)—通過化學(xué)激活形成肽鍵嵌合蛋白質(zhì)—通過酶連接反應(yīng)形成肽鍵通過非肽鍵形成嵌合蛋白質(zhì)第九講蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)第2頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月雖然基因重組表達(dá)技術(shù)的應(yīng)用對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的研究以及蛋白質(zhì)分子的改造提供了一條非常有效的途徑，然而用化學(xué)方法直接對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行修飾有時(shí)仍然是很有用的方法，可以彌補(bǔ)正常生物表達(dá)體系的不足。例如，利用化學(xué)法和酶法相結(jié)合，可以從豬胰島素制備人胰島素；通過區(qū)段特異性取代制備適合于腫瘤定位的抗體；對(duì)用重組方法得到的多肽進(jìn)行C末端酰化以及制備各種類型的蛋白質(zhì)嵌合體等。因此化學(xué)法和重組方法的相互補(bǔ)充，使蛋白質(zhì)工程的實(shí)施更有效。蛋白質(zhì)工程的化學(xué)方法通常是產(chǎn)生半合成的結(jié)構(gòu)，在此結(jié)構(gòu)中一個(gè)天然的多肽與一個(gè)人造（或化學(xué)修飾）的多肽相締合。產(chǎn)生這種締合的方法主要有4種：①非共價(jià)締合、②產(chǎn)生二硫鍵、③形成肽鍵以及④產(chǎn)生非天然型的共價(jià)鍵連接。

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑第3頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月在20種天然氨基酸的側(cè)鏈中，大約有一半可以在足夠溫和的條件下產(chǎn)生化學(xué)取代而不使肽鍵受損，其中氨基、巰基和羧基特別容易產(chǎn)生有用的取代。因?yàn)槿魏谓o定的氨基酸殘基在蛋白質(zhì)分子中可能出現(xiàn)不止一次，如果用化學(xué)的方法對(duì)氨基酸進(jìn)行修飾時(shí)，正常情況下所有相關(guān)的氨基酸側(cè)鏈都要被取代。對(duì)于氨基和羧基基團(tuán)，盡管處在側(cè)鏈上和末端基團(tuán)的pK值有差別，但在化學(xué)上很難將肽鏈的α-氨基或α-羧基基團(tuán)與側(cè)鏈上的氨基或羧基相區(qū)別。很多在臨床上重要的肽其C末端是被?；?。但當(dāng)用重組的方法得到這些產(chǎn)物時(shí)，其C末端是自由羧基。在自然界能進(jìn)行這種?；饔玫难趸阁w系很難實(shí)用化。尋找一種有效的方法，使C末端的谷氨酸和天冬氨酸酰胺化，而不作用于處在肽鏈中的谷氨酸和天冬氨酸仍是努力的方向。

■一、功能基團(tuán)的特異性修飾第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑第4頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月氨基可用取代基進(jìn)行修飾。常用的取代基有兩種：t-butyloxy-carbonyl(Boc)是典型的酸不穩(wěn)定取代基，而Methanesulphonylethyloxycarbonyl(Msc)是典型的堿不穩(wěn)定取代基。這兩種基團(tuán)常用于對(duì)氨基進(jìn)行臨時(shí)保護(hù)，以防止其他反應(yīng)試劑對(duì)氨基的作用。當(dāng)其他反應(yīng)完成后，可分別用無水三氟乙酸和強(qiáng)堿將Boc和Msc基團(tuán)去除，很多多肽或小分子蛋白質(zhì)在這些基團(tuán)去除后仍保持其活性?！鲆?、功能基團(tuán)的特異性修飾第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★1.多位點(diǎn)取代

※(1)常規(guī)的氨基保護(hù)

第5頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月絕大多數(shù)氨基取代反應(yīng)至今尚無可靠方法將α-氨基和ε-氨基區(qū)分，但亞氨代乙?；磻?yīng)是一特例，盡管對(duì)α-氨基和ε-氨基的區(qū)分尚不完美。當(dāng)ε-氨基幾乎完全被亞氨代乙?；〈鷷r(shí)，α-氨基在很大程度上可不被修飾。被亞氨代乙酰基取代的氨基仍可解離。完全亞氨代乙酰化的蛋白質(zhì)仍保持其在水溶液中的可溶性，其性質(zhì)與修飾前一樣或相近，因此通常在修飾后這一基團(tuán)可不必從蛋白質(zhì)分子上去除。只有在處于與蛋白質(zhì)活性相關(guān)的賴氨酸殘基的側(cè)鏈被修飾后，導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性喪失。然而，亞氨代乙?；磻?yīng)在較低pH值下可形成烷基亞胺，

N-烷基亞胺可進(jìn)一步與賴氨酸側(cè)鏈產(chǎn)生交聯(lián)，從而影響被修飾蛋白質(zhì)的活性。因此，在對(duì)ε-氨基進(jìn)行修飾時(shí)，要適當(dāng)?shù)乜刂品磻?yīng)條件，使反應(yīng)向著形成Nε-乙酰亞胺化的反應(yīng)進(jìn)行。

★1.多位點(diǎn)取代

※(2)亞氨代乙酰基

第6頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月羧基的甲基酯化一般可以在室溫下將蛋白質(zhì)加入到含有乙酰氯的無水甲醇中來完成。由于反應(yīng)產(chǎn)生鹽酸，需將反應(yīng)物及時(shí)地稀釋到冰水中，小心地用堿中和鹽酸以使多肽或小分子蛋白質(zhì)活力得以保持。半胱氨酸出現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子中的概率比其他氨基酸要小。相對(duì)于其他功能基團(tuán)而言，巰基有著十分不同類型的化學(xué)反應(yīng)，因此半胱氨酸殘基是一個(gè)很好的靶位，利用這一靶位可以將少數(shù)的取代基團(tuán)引入到蛋白質(zhì)分子的確定位置。當(dāng)一對(duì)半胱氨酸通過二硫鍵相連時(shí)，通?？杉尤攵蛱K糖醇之類的還原劑或通過磺酸氧化將其打開。用磺酸氧化的方法往往比簡單還原的方法要好，因?yàn)榛撬嵫趸纬傻陌腚装彼岬幕撬峄瘹埢鶎?duì)氧化作用很穩(wěn)定，而且可以通過巰基將其還原成自由琉基?！?.多位點(diǎn)取代

※(3)其他的側(cè)鏈取代

第7頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月用化學(xué)方法對(duì)蛋白質(zhì)分子上單一的特定功能基團(tuán)（如α-氨基）進(jìn)行修飾而不對(duì)與其相類似的基團(tuán)（如ε-氨基）產(chǎn)生作用是一件很困難的事。少數(shù)的化學(xué)試劑，如α-異硫氰酸苯酯在嚴(yán)格控制的條件下可對(duì)α-氨基進(jìn)行相當(dāng)特異性的修飾，而不作用于ε-氨基。由于酶蛋白可以將兩個(gè)極相似的基團(tuán)區(qū)分開來，所以可利用酶蛋白的這一特異性對(duì)蛋白質(zhì)分子的功能基團(tuán)進(jìn)行特異性修飾。在天然狀態(tài)下，蛋白水解酶是催化肽鍵的水解，其作用機(jī)制是酶的活性位點(diǎn)首先被一羧基酯化（此羧基來自于被切開的肽鍵），所產(chǎn)生的酰化-酶中間體隨之通過水分子的親核攻擊而分解：

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2.單一的或限制性取代

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑第8頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月按照同樣的機(jī)制，上面這個(gè)水解反應(yīng)可以逆向進(jìn)行，這樣在蛋白水解酶的存在下肽鍵可以重新形成，即一個(gè)肽的氨基（或其他非肽的親核物）攻擊?；?酶中間體，從而導(dǎo)致肽鍵的形成。這一逆反應(yīng)（肽連接）的成立無論在科學(xué)理論上還是在實(shí)際應(yīng)用上都具有重要的意義。因?yàn)樵诔Ｒ?guī)肽合成中對(duì)氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行保護(hù)的操作可以省去，以這種可逆方式進(jìn)行的酶連接反應(yīng)至少可以達(dá)到每年100kg的生產(chǎn)規(guī)模。

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★

2.單一的或限制性取代

第9頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月特異性的C末端取代是另一類反應(yīng)：

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑通常在水溶液中，由蛋白水解酶所催化的反應(yīng)以壓倒的優(yōu)勢(shì)向水解方向進(jìn)行。因?yàn)棰僭诜磻?yīng)基質(zhì)中水分子具有高活性；②在相當(dāng)寬的pH值范圍內(nèi)，新釋放出的氨基和羧基具有解離傾向。如果要使式(3-3)或式(3-4)的反應(yīng)逆向進(jìn)行，通常要耗費(fèi)大量的能量去抑制這些荷電的傾向。如果所生成的產(chǎn)物沉淀，根據(jù)質(zhì)量作用的原則將推動(dòng)此反應(yīng)向著合成方向進(jìn)行。但當(dāng)產(chǎn)物是大分子時(shí)，產(chǎn)物與底物之間在溶解度上的差異很小，利用某些巧妙的生物學(xué)上特異親和過程來捕捉回收產(chǎn)物的研究甚少。

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2.單一的或限制性取代

第10頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月圍繞能量問題人們提出了一個(gè)很有吸引力的方法，即向反應(yīng)混合物中加入未荷電且易與其融和的溶劑(共溶劑，cosolvent)。共溶劑不但減少了水的有效濃度，而且若加入量足夠，還可使介電常數(shù)降得很低，結(jié)果使α-氨基和羧基解離過程的pK值變得很接近，最終導(dǎo)致解離能對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的妨害大大降低，使反應(yīng)向著合成方向進(jìn)行。常用的共溶劑有丁烷-1,4-二醇、甘油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜等。這些溶劑的變性傾向大致上依序增加。因?yàn)樵诩尤肴軇┑耐瑫r(shí)要保持水解酶的活力，所以在實(shí)踐中要找到水的最適含量。在可控的條件下，利用蛋白水解酶催化肽鍵的形成有著很高的應(yīng)用價(jià)值。第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★

2.單一的或限制性取代

第11頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑需要指出的是：第一，對(duì)于成功的連接取代反應(yīng)，原來肽鍵的斷開和隨后的偶聯(lián)不必作為一個(gè)單一的濃縮過程。如果在肽鍵已經(jīng)切開的情況下，合成反應(yīng)要快很多倍，因而在正常水解條件下使肽鍵斷開是最簡單和最好的辦法。然后在同一個(gè)反應(yīng)管中，通過下列操作校正反應(yīng)條件，使反應(yīng)向著有利于肽鍵合成的方向進(jìn)行。這些校正過程包括：①對(duì)連接反應(yīng)來說加入大大過量的氨基成分(式(3-5))；②對(duì)于C末端取代來說加入大大過量的其他親核化合物以及共溶劑，將pH值改變到所要的新pK值的中點(diǎn)，通常加入足夠額外的酶去補(bǔ)償由于pH值的變化和共溶劑的存在而導(dǎo)致的催化反應(yīng)變慢。第二，此方法并不需要肽底物沒有其他的側(cè)鏈，而這些側(cè)鏈通常在水解反應(yīng)中來滿足蛋白水解酶特異性的需要。

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2.單一的或限制性取代

第12頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑相對(duì)于ε-氨基而言，α-異硫氰酸苯酯對(duì)α-氨基的修飾并非絕對(duì)特異，但當(dāng)試劑限制在低濃度，特別是pH值保持在足夠低而使α-氨基和ε-氨基解離的程度出現(xiàn)最大差異時(shí)，此反應(yīng)對(duì)α-氨基而言有相當(dāng)?shù)奶禺愋浴?yán)格地說，這個(gè)反應(yīng)并不對(duì)α-氨基形成一個(gè)可逆的保護(hù)，但經(jīng)酸處理時(shí)能將α-異硫氰酸苯酯和與其反應(yīng)的N末端氨基酸殘基去除。α-異硫氰酸苯酯與α-氨基反應(yīng)如下

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2.單一的或限制性取代

※(l)α-異硫氰酸苯酯對(duì)α-氨基的選擇性第13頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★

2.單一的或限制性取代

※(2)C末端取代——蛋白質(zhì)活性親核成分的產(chǎn)生

將式(3-5)的R-NH2換成H2N-NH-CO-NH-NH2(1,1’-羰基二酰肼)。這個(gè)化合物有若干方便之處：①作為酰肼，其一NH2基的pK值比通常的α-氨基要低幾個(gè)單位，這樣，-COOH和-NH2成分的pK值已很接近羰基酰肼，使得共溶劑不再必需；②這種化合物分子對(duì)稱，意味著-NH-NH2基團(tuán)的有效濃度兩倍于按mg/ml的計(jì)算值；第14頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★

2.單一的或限制性取代

※(2)C末端取代——蛋白質(zhì)活性親核成分的產(chǎn)生

③與蛋白質(zhì)分子的羧基相互作用形成的產(chǎn)物是具有區(qū)域特異性的酰肼基團(tuán)，這個(gè)強(qiáng)的親核物的化學(xué)反應(yīng)性與蛋白質(zhì)分子中的任何天然功能基團(tuán)很不像。這種反應(yīng)性使得其可在溫和的水溶液條件下與各種試劑進(jìn)行特異性反應(yīng)，而這些試劑通常不能與蛋白質(zhì)分子上的功能基團(tuán)相反應(yīng)。這樣，可用酰肼對(duì)胰島素、抗體片段、完整抗體等的C末端進(jìn)行特異性修飾。

第15頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★

2.單一的或限制性取代

※(3)C末端取代——蛋白醛的產(chǎn)生

醛基是另一種符合下列兩個(gè)條件的反應(yīng)基團(tuán)：①其反應(yīng)性與蛋白質(zhì)天然功能基團(tuán)不同；②可在溫和的水溶液條件下進(jìn)行反應(yīng)。在上述反應(yīng)中，H2NCH2-CHOH-CH2NH2作為親核化合物，高碘酸作為氧化劑。由于H2NCH2-CHOH-CH2NH2結(jié)構(gòu)對(duì)稱，因此其有效工作濃度加倍。但這種化合物與羰酰肼不同，它是一類初級(jí)胺，其具有通常的pK值并且與蛋白質(zhì)C末端進(jìn)行反應(yīng)需要共溶劑存在。通過這些反應(yīng)所形成的蛋白醛可與其他試劑進(jìn)行特異性反應(yīng)。

第16頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑如果將式(3-5)中的R-NH2改成NH3，就可以得到一個(gè)特異性C末端被酰胺化的產(chǎn)物。雖然此反應(yīng)的產(chǎn)率不是很高，但仍可用。如果R-NH2是一個(gè)氨基酸酰胺，則可得到特異性地酰胺化的產(chǎn)物，且產(chǎn)率非常高。這一方法很有希望代替天然酰胺化系統(tǒng)而用于大規(guī)模生產(chǎn)中。

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2.單一的或限制性取代

※(4)通過蛋白質(zhì)水解的逆反應(yīng)產(chǎn)生蛋白和肽的α-酰胺第17頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑此方法只適用于糖蛋白，所發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)更似在高碘酸和鄰位二醇之間的反應(yīng)。如果糖蛋白是研究主體，在蛋白質(zhì)分子上最好是只有單一的糖基元或少數(shù)幾個(gè)位點(diǎn)被糖基化。太多的糖基化區(qū)會(huì)使氧化反應(yīng)產(chǎn)生太多的醛基位點(diǎn)。所生成的蛋白醛可以進(jìn)一步同其他分子產(chǎn)生特異性的反應(yīng)。絕大多數(shù)糖二醇并沒有像1-氨、2-羥基化合物那樣對(duì)高碘酸的反應(yīng)性，因此要用較高濃度的高碘酸，又不可能用二醇作為原位清除劑，所以在這樣條件下，蛋白質(zhì)分子中的一些敏感殘基如半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸可能遭到某種程度的氧化。

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2.單一的或限制性取代

※(5)蛋白醛——由糖的化學(xué)氧化產(chǎn)生

第18頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★

3.次級(jí)取代

※(1)與蛋白醛偶聯(lián)——親核取代物

上面所說的方法是位點(diǎn)或區(qū)域特異性地產(chǎn)生蛋白質(zhì)活性親核物和蛋白醛，在正常反應(yīng)條件下這些衍生物可以保持其活性。因此，可以利用這些在自然界不存在的化學(xué)反應(yīng)性與具有適當(dāng)互補(bǔ)反應(yīng)性的分子進(jìn)一步反應(yīng)，從而形成非常有用的接合體。氨基-氧化合物(羥胺衍生物)很容易同蛋白醛形成肟鍵：肟鍵在生理?xiàng)l件或近生理?xiàng)l件下相當(dāng)穩(wěn)定，因而很少需要通過還原來穩(wěn)定和蛋白之間形成的連接。另一方面腙健隨著時(shí)間慢慢地被破壞，因而與蛋白質(zhì)分子之間所形成的腙鍵在臨床上常用于需要將所連接的分子慢慢釋放的情況。為了使通過腙鍵連接的分子完全穩(wěn)定，腙鍵可通過用氫硼化腈的還原來穩(wěn)定：第19頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★

3.次級(jí)取代

※(2)與蛋白質(zhì)活性親核物偶聯(lián)―醛取代物具有自由α-氨基的絲氨酰和蘇氨?；衔锟蓸O快地被高碘酸氧化，所產(chǎn)生的化合物易與蛋白質(zhì)親核物偶聯(lián)。這種反應(yīng)不但可用于產(chǎn)生小的，非蛋白分子的絲氨?；蛱K氨酰衍生物，也可以用于整個(gè)蛋白質(zhì)或蛋白片段，其前提條件是絲氨?；蛱K氨酰殘基必須處于蛋白質(zhì)或蛋白片段的N末端，因?yàn)閷?duì)鏈內(nèi)的絲氨酰或蘇氨酰殘基不能產(chǎn)生作用。另外預(yù)先存在的氨-氧化合物能被轉(zhuǎn)化成醛基化合物。這是一個(gè)非常有用的方法，因?yàn)橹灰４孀銐虻陌?氧化合物，就可以隨時(shí)將其轉(zhuǎn)變成醛的形式。

第20頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月一個(gè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)在最大程度上依賴于側(cè)鏈間的非共價(jià)相互作用。在多肽鏈中如果出現(xiàn)一個(gè)切口并不必然使多肽鏈的兩部分分開（在少數(shù)情況下，在多肽鏈中出現(xiàn)多于一個(gè)切口，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)仍可維待），而且經(jīng)常甚至能保持其生物活性。如果在某些變性系統(tǒng)中，這種非共價(jià)的相互作用被破壞，可導(dǎo)致兩個(gè)多肽鏈分開。如果將兩個(gè)片段再混合到一起，在非變性的基質(zhì)中仍可形成原來的構(gòu)型，活力也可以隨之恢復(fù)。這一現(xiàn)象可用來產(chǎn)生半合成的類似物。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)充分利用非共價(jià)締合的方法研究蛋白質(zhì)功能構(gòu)象的形成和功能表達(dá)的關(guān)系，將是非常有意義的。

■二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★1.嵌合蛋白質(zhì)―非共價(jià)締合系統(tǒng)

通過非共價(jià)鍵相互作用、二硫鍵、常規(guī)肽鍵（通過化學(xué)法或酶法產(chǎn)生）或其他非肽共價(jià)鍵，可以將較小的肽段連在一起，這就是通過半合成對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行工程操作的原則。

第21頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月彼此分開的多肽鏈片段可以通過二硫鍵連接起來，這是產(chǎn)生半合成類似物的另一種方法。如果這些鍵橋用還原劑（如DTT二硫蘇糖醇）處理被打開，則多肽片段彼此分開。這些片段中的一個(gè)片段可以與適當(dāng)?shù)谋恍揎椀幕蚝铣傻牧硪浑亩蜗嗷旌?，通過重新形成二硫鍵而形成新的嵌合分子。通過這種方法使人們對(duì)胰島素和抗體的結(jié)構(gòu)功能有了很清楚的了解。

■二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★2.二硫鍵與嵌合蛋白質(zhì)的形成

第22頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月很多方法可以形成肽鍵，這可以在有關(guān)肽合成的有關(guān)文獻(xiàn)中查到。在此只介紹利用活性酯的方法將單一氨基酸殘基加到一個(gè)肽鏈的N末端的方法。其主要方式是利用活性酯實(shí)現(xiàn)化學(xué)偶聯(lián)，反應(yīng)過程如式(3-12)。在這個(gè)反應(yīng)中，對(duì)除了α-氨基以外的所有氨基首先要進(jìn)行保護(hù)，當(dāng)然這種保護(hù)是可逆的。人們?cè)眠@一方法成功地產(chǎn)生細(xì)胞色素C的類似物。

■二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★3.嵌合蛋白質(zhì)―通過化學(xué)激活形成肽鍵

第23頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★4.嵌合蛋白質(zhì)―通過酶連接反應(yīng)形成肽健

蛋白水解酶有能力進(jìn)行與水解可逆的反應(yīng)。在此我們更加關(guān)注一些非自然界的氨基酸或肽的新的親核物?！?1)從豬胰島素生產(chǎn)人胰島素

豬胰島素與人胰島素分子在一級(jí)結(jié)構(gòu)上的惟一差異是在B鏈的C末端氨基酸殘基，豬胰島素的B30是Ala殘基，而人的是Thr殘基。豬胰島素來源豐富，如能將豬胰島素改造成人胰島素，在臨床應(yīng)用上將是非常有意義的。Thr(But)-OBut是蘇氨酸的側(cè)鏈-OH和α-COOH用叔丁基保護(hù)，與豬胰島素混合，在胰蛋白酶的催化下，使Thr(But)-OBut取代豬胰島素B30位的丙氨酸(Ala)，在Lys和Thr之間形成肽鍵，叔丁基隨后用三氟乙酸處理去除，這樣就使豬胰島素轉(zhuǎn)變成人胰島素。目前用與此相似的方法可以每年從豬胰島素生產(chǎn)100kg水平的人胰島素用于人類糖尿病的治療。

第24頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★4.嵌合蛋白質(zhì)―通過酶連接反應(yīng)形成肽健

※(2)片段的縮合

新的親核物不必須像單個(gè)氨基酸衍生物那樣小，較大的肽也可以作為親核物與半合成的肽縮合形成嵌合蛋白質(zhì)。然而隨著肽親核物分子量的增加，其縮合效率就受很大影響。產(chǎn)生這種縮合效率下降的原因中，反應(yīng)物的濃度限制比空間障礙還要大。※(3)通過酶法與活性酯偶聯(lián)

活性酯偶聯(lián)所用的親核物是活性酯，其α-氨基不需要保護(hù)。以二氯苯酯為例，其反應(yīng)是：

羥基琥珀酰亞胺酯也可以作為活性酯通過酶進(jìn)行偶聯(lián)。第25頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾

第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑★5.通過非肽鍵形成嵌合蛋白質(zhì)

利用雙功能試劑可以將不同的蛋白質(zhì)分子連到一起。常用的方法是將雙功能的接頭與兩個(gè)蛋白質(zhì)分子中的賴氨酸殘基側(cè)鏈相連接。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)分子間的連接可以更可控和具位點(diǎn)特異性，如可以用主鏈肟鍵產(chǎn)生尾-尾相連二聚體。這類二聚體可用于進(jìn)行多方面的研究，比如，若單體是適于活化的抗體的Fab片段的話，就可以利用這種方法制備具不同功能的F(ab)2

類似物。同樣，通過將一個(gè)C末端活化的蛋白質(zhì)親核物與一個(gè)特異性N末端醛衍生物之間相連，也可以產(chǎn)生頭尾相連的蛋白質(zhì)嵌合體。第26頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變編碼基因的專一性位點(diǎn)突變區(qū)域性定向突變二、基因融合與基因剪接利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由基因融合的策略產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接第九講蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)三、tRNA介導(dǎo)定點(diǎn)攙入非天然氨基酸第27頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月基因突變技術(shù)是通過在基因水平上對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造，在其表達(dá)后用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的一種方法。這一技術(shù)的出現(xiàn)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的研究產(chǎn)生了革命性的變化，可以使人們隨心所欲地研究特定氨基酸殘基、特定結(jié)構(gòu)元件在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)形成和功能表達(dá)中的作用。根據(jù)其特點(diǎn)，可將基因突變分為兩大類：位點(diǎn)特異性突變和隨機(jī)突變。位點(diǎn)特異性突變又可大體分為三種類型：一類是通過寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變；第二類是盒式突變或片段取代突變；第三類是利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以雙鏈DNA為模板進(jìn)行的基因突變。無論哪種方法都可以在為蛋白質(zhì)編碼的基因序列上產(chǎn)生插入、缺失、取代等突變。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第28頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點(diǎn)突變專一性位點(diǎn)突變又稱特異性位點(diǎn)突變。這類突變都是在含有突變序列的寡核苷酸引物介導(dǎo)下進(jìn)行的，因此又稱為寡核苷酸介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性突變。這種突變的方法從問世至今不斷更新，特別是PCR技術(shù)出現(xiàn)后變得更高效。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

第29頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點(diǎn)突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

①關(guān)于DNA模板的制備：根據(jù)所用的方法，用于進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變的DNA模板可以是單鏈DNA或雙鏈DNA。對(duì)于雙鏈DNA而言，一般制備質(zhì)粒DNA的方法都可以滿足其需要；而對(duì)于單鏈DNA而言，可以直接從M13噬菌體載體或通過噬菌粒來制備單鏈DNA，用于突變的單鏈DNA模板要足夠純凈，即使有小的RNA分子（來源于裂解細(xì)胞）污染，也可能造成隨機(jī)延伸起始。第30頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點(diǎn)突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

②關(guān)于寡核苷酸突變引物的設(shè)計(jì)和選擇：用于突變的引物必須具備如下特性：(a)它們必須與在模板鏈上的目標(biāo)DNA序列有必要的互補(bǔ)區(qū)；(b)它們必須足夠長，以便特異地與目標(biāo)DNA序列退火；(c)突變引物應(yīng)盡可能避免形成穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的回文序列、重復(fù)序列或自身互補(bǔ)序列；第31頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點(diǎn)突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

②關(guān)于寡核苷酸突變引物的設(shè)計(jì)和選擇：(d)所選用的突變引物不能同目標(biāo)基因其他區(qū)域和載體DNA形成穩(wěn)定的雜交體。這可以用計(jì)算機(jī)軟件同源性分析程序來確定。如果它們之間的序列有連續(xù)8個(gè)以上的堿基完全配對(duì)，就需對(duì)寡核苷酸突變引物同模板DNA的雜交特異性進(jìn)行分析，以確定突變引物的可用性。

第32頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點(diǎn)突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

突變寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)取決于所要產(chǎn)生的突變類型：(a)對(duì)用于取代、插入、缺失單個(gè)核苷酸的寡核苷酸突變引物，一般的長度為17-19個(gè)核苷酸，其突變位點(diǎn)距其5端為8-10個(gè)核苷酸，距其3端為7-9個(gè)核昔酸。這種設(shè)計(jì)可保證寡核苷酸引物的5端和3端同模板形成完全穩(wěn)定的雜交體，使突變效率提高。第33頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點(diǎn)突變突變寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)取決于所要產(chǎn)生的突變類型：(b)對(duì)用于產(chǎn)生多處缺失、插入或取代兩個(gè)以上毗鄰核苷酸突變引物，一般長度為25個(gè)核苷酸以上，其突變區(qū)的兩側(cè)至少要有12-15個(gè)同模板DNA完全配對(duì)的核苷酸，以確保在引物延伸的溫度下，突變寡核苷酸引物的兩邊都能穩(wěn)定地與模板DNA退火，進(jìn)行堿基配對(duì)，可根據(jù)公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)，推算引物兩側(cè)冀區(qū)之一的熱穩(wěn)定性。當(dāng)錯(cuò)配堿基側(cè)冀或待刪除的環(huán)圈序列側(cè)翼的雙鏈區(qū)的Tm值大約為35-40℃時(shí)，引物介導(dǎo)的突變將卓有成效。為了得到正確的突變體，在突變工作完成后，要對(duì)目標(biāo)DNA的全長進(jìn)行序列分析，以排除引物延伸過程中在其他位點(diǎn)出現(xiàn)錯(cuò)誤攙入，而使目的基因產(chǎn)生不必要的新突變位點(diǎn)。第34頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點(diǎn)突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

③關(guān)于寡核苷酸突變引物與模板DNA的退火和引物延伸條件：(a)對(duì)于突變引物與模板DNA的比率。在標(biāo)準(zhǔn)的雙引物方法中，兩個(gè)寡核苷酸引物與模板DNA的摩爾比為10-50。引物同模板DNA之間的退火通常將二者的混合物加熱到推算的Tm值以上20℃，以使二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)變性，然后慢慢冷卻到室溫，當(dāng)反應(yīng)混合物的溫度降低到相應(yīng)Tm值以下時(shí)，即可形成突變引物與DNA模板的雜交體。(b)引物延伸。退火完成后，再加入4種脫氧核苷三磷酸、三磷酸腺苷、DNA聚合酶、DNA連接酶等，在適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行2-15h的延伸反應(yīng)。

第35頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點(diǎn)突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

④關(guān)于DNA聚合酶的選擇：目前一般選擇T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶。Klenow酶由于其在較低溫度下(5-10℃)表現(xiàn)出較高的聚合酶活性，有利于引物和模板DNA的退火，但Klenow酶在單引物的延伸反應(yīng)中，容易引起突變引物置換，特別是當(dāng)突變引物的5端富含A/T時(shí)產(chǎn)生引物置換的可能性更大，所以在用單突變引物的延伸反應(yīng)中要用T4或T7的DNA聚合酶。

第36頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點(diǎn)突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

⑤關(guān)于存在于dNTP(脫氧核苷三磷酸)中的dUTP(脫氧尿苷三磷酸)對(duì)離體DNA合成反應(yīng)的影響：dCTP氧化脫氨可以產(chǎn)生微量的dUTP，當(dāng)其在DNA合成時(shí)攙入進(jìn)新生DNA鏈的脫氧胸苷酸的位置。在多核苷酸鏈中攙入U(xiǎn)MP時(shí)，受體菌中的尿嘧啶-N-糖基化酶可在U的位置切斷DNA鏈，而細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶可以產(chǎn)生切口平移，從而降低突變體的產(chǎn)率。利用經(jīng)HPLC純化的高質(zhì)量的dNTP，可以減輕U堿基的錯(cuò)誤攙入，提高突變體產(chǎn)生的比率。

第37頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點(diǎn)突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(l)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素

⑥受體細(xì)胞對(duì)突變體產(chǎn)率的影響：異源雙鏈DNA被轉(zhuǎn)入大腸桿菌受體細(xì)胞后，幾個(gè)因素可以影響到突變體的產(chǎn)率。(a)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)存在著幾個(gè)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)，其中之一是被GATC位點(diǎn)甲基化所指導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)。當(dāng)含有突變的異源雙鏈DNA轉(zhuǎn)染大腸桿菌后dam甲基化酶將指導(dǎo)錯(cuò)配修復(fù)反應(yīng)，使產(chǎn)生的突變被去除。(b)當(dāng)用M13作為克隆載體時(shí)，由于M13DNA可能出現(xiàn)不對(duì)稱復(fù)制，如果突變鏈復(fù)制的效率較低，則最終影響突變體的產(chǎn)率。為了提高突變體的回收率，利用在點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)缺失的菌株作為受體菌可使突變產(chǎn)率提高近10倍。

第38頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變★1.編碼基因的專一性位點(diǎn)突變第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

①Kunkel突變法

②基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法

③基于去除特定限制酶切位點(diǎn)的突變

④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點(diǎn)突變

第39頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月(a)原理當(dāng)大腸桿菌發(fā)生dUTP酶缺陷突變時(shí)(dut-)，不能把dUTP轉(zhuǎn)變?yōu)閐UMP，細(xì)胞內(nèi)的dUTP庫大為增加，其中一些dUTP可攙入DNA正常情況下由胸腺嘧啶占據(jù)的位置。在正常的情況下，大腸桿菌可以合成一種尿嘧啶-N-糖基化酶，它可以去除攙入到DNA中去的尿嘧啶殘基。然而在尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷型的菌中(ung-)，此酶失活，故尿嘧啶不能從DNA鏈中剔除，使細(xì)菌DNA中一小部分胸腺嘧啶殘基被尿嘧啶所取代。在dut-

ing-F菌株中，這一比例有所提高，以致生長于這一菌株的M13噬菌體，其DNA中將含有20-30個(gè)尿嘧啶殘基。用這些噬菌體轉(zhuǎn)染ung+菌株，尿嘧啶將被迅速除去，并產(chǎn)生一些可阻斷DNA合成且對(duì)特定核酸酶敏感的位點(diǎn)。病毒(+)鏈DNA的破壞，導(dǎo)致其感染力下降約5個(gè)數(shù)量級(jí)。※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

①Kunkel突變法

第40頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月Kunkel定點(diǎn)突變法正是利用上述機(jī)制，首先在dut-ung-的大腸桿菌菌株中培養(yǎng)適當(dāng)?shù)闹亟MM13噬菌體，制備出帶U的單鏈DNA模板；然后以含U模板的DNA為模板與突變引物退火、引物延伸，然后將延伸反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)染ung+受體菌，結(jié)果模板鏈因有U位點(diǎn)的存在而被破壞，野生型噬菌體的產(chǎn)生受到抑制。因此，大部分(≥80%)的后代噬菌體是由所轉(zhuǎn)染的不帶U的負(fù)鏈復(fù)制而來的。由于該鏈?zhǔn)怯赏蛔円镅由於鴣淼模虼撕蟠删w多帶有突變的目標(biāo)基因。這樣，用Kunkel法所產(chǎn)生的突變體不必利用標(biāo)記的寡核苷酸探針來篩選陽性噬菌斑，可直接通過序列分析來確定突變體。

※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

①Kunkel突變法

第41頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月(b)利用Kunkel法以M13噬菌體DNA為載體進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性突變?！?2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

①Kunkel突變法

第42頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月以Promega公司AlteredSifeinvitro突變體系為例，利用pALTER-1噬菌粒為突變載體，它有如下特點(diǎn)：(a)多克隆位點(diǎn)，用以對(duì)目標(biāo)基因的克隆。(b)含有四環(huán)素(Tetr)和氨芐青霉素(Amps)的抗性基因，在突變反應(yīng)中，用氨芐青霉素抗性修復(fù)寡核苷酸使Amps→Ampr，用于對(duì)陽性克隆的篩選。(c)利用輔助噬菌體超感染(Helperphage)，制備含目標(biāo)基因的單鏈DNA作為突變模板DNA。突變的過程如圖3-2所示。通過這樣的操作，突變引物完成了位點(diǎn)特異性突變，而氨芐抗性修復(fù)寡核苷酸引物使氨芐抗性得以回復(fù)?！?2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

②基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法第43頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月利用含四環(huán)素和氨芐青霉素培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行篩選，大約85%-90%以上的菌落含有突變的目的基因，這樣可以對(duì)陽性克隆所含的噬菌粒直接測(cè)序而最后確證是否得到突變的目標(biāo)基因?！?2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

②基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法第44頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月此方法的原理是在突變載體DNA上除了有克隆外源基因的克隆位點(diǎn)外，還有一個(gè)獨(dú)特的限制酶切位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)也不存在于目標(biāo)基因上。在進(jìn)行突變反應(yīng)時(shí)用兩個(gè)引物，一是突變引物，二是使那個(gè)獨(dú)特限制酶位點(diǎn)去除的選擇性引物。兩個(gè)引物通過與模板DNA退火、延伸后，首先用與獨(dú)特的限制酶位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的酶對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行酶解，使野生型的質(zhì)粒線性化，然后轉(zhuǎn)入如E.colimutS的受體菌。從轉(zhuǎn)化菌中制備質(zhì)粒，再用相同限制酶酶解，以使殘存的野生型質(zhì)粒線性化，然后再轉(zhuǎn)化入受體菌。具體操作見圖3-3※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

③基于去除特定限制酶切位點(diǎn)的突變第45頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月由于線性化質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率僅為環(huán)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的1%，所以經(jīng)過兩次酶切、轉(zhuǎn)化后所得到的質(zhì)粒DNA70％-90％以上是突變質(zhì)粒。從兩次轉(zhuǎn)化菌中提取質(zhì)粒DNA，用于測(cè)序確定正確突變體。此方法的優(yōu)點(diǎn)是不需制備單鏈DNA；不需輔助噬菌體超感染；不需進(jìn)行亞克隆?！?2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

③基于去除特定限制酶切位點(diǎn)的突變第46頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR為基因序列的突變和重組提供了一個(gè)非常有用的方法，其優(yōu)點(diǎn)是快捷、不受限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的限制。(a)利用PCR方法在基因的5末端區(qū)或3末端區(qū)產(chǎn)生突變。此方法是利用在PCR反應(yīng)中，寡核苷酸引物序列被攙入到所產(chǎn)生的DNA分子的末端，這些引物的5端可以含有任何所想要的核苷酸序列，只要引物的3端核苷酸序列能足夠好地與模板序列相匹配去引發(fā)PCR反應(yīng)即可。所以可以通過改變引物5端的核苷酸(或堿基)組成，就可使基因的5末端區(qū)或3末端區(qū)通過PCR產(chǎn)生所要的突變?！?2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點(diǎn)突變

第47頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月然而對(duì)于基因的中心區(qū)段，不能用簡單地改變PCR引物有關(guān)序列的方法直接產(chǎn)生各種突變，因?yàn)槿绻@樣，需要用非常長的引物才能達(dá)到基因中心區(qū)。重疊延伸(overlapextension)的方法為在目標(biāo)基因的中心區(qū)段產(chǎn)生突變提供了有力的手段。(b)重疊延伸和基因突變。重疊延伸的概念使得人們可以利用PCR技術(shù)在目標(biāo)基因的中心區(qū)段引入位點(diǎn)特異性突變和產(chǎn)生重組DNA分子。當(dāng)將重疊延伸方法用于將不同的基因進(jìn)行剪接和組合在一起時(shí)，人們就將這一過程稱為“geneSOEing”，即通過重疊延伸進(jìn)行剪接(splicingbyoverlapextension)※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點(diǎn)突變

第48頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月重疊延伸過程的依據(jù)是：加到PCR引物5端的核苷酸序列攙入到PCR產(chǎn)物的末端。通過加上適當(dāng)?shù)男蛄?，一個(gè)PCR的擴(kuò)增片段可與另一個(gè)PCR擴(kuò)增片段上的序列相重疊。這樣，在其后的反應(yīng)中，這段重疊序列可以作為引物被DNA聚合酶所延伸，由此而產(chǎn)生一個(gè)新的重組分子，其過程如圖3-4所示。

※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點(diǎn)突變

第49頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月利用上述原理，可以通過重疊延伸PCR技術(shù)對(duì)基因的中心區(qū)段進(jìn)行取代、插入、缺失的突變。※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點(diǎn)突變

取代突變。如圖3-5所示，為在基因中部區(qū)段產(chǎn)生取代突變，可利用所謂雙側(cè)重疊延伸法，需要a,b,c,d四個(gè)引物，其中b,c引物序列相重疊并含有突變堿基。首先分別用a,b和c,d為一對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)生AB和CD擴(kuò)增片段。然后，將制備出的AB、CD片段混合、變性、退火、通過二者之間的同源序列相重疊產(chǎn)生重疊延伸結(jié)構(gòu)E，再經(jīng)PCR進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)生突變基因。

第50頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月插入突變。如圖3-6所示，引物b和c的5端含有要插入的序列和重疊序列(插入序列可以等于重疊序列或大于重疊序列)?！?2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點(diǎn)突變

分別用a,b和c,d為一對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)生了包括插入的核苷酸序列在內(nèi)的兩組DNA片段AB和CD，最后通過AB和CD片段之間的重疊序列進(jìn)行PCR延伸、擴(kuò)增，得到具有插入序列的產(chǎn)物AD。

第51頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月缺失突變。利用雙側(cè)重疊延伸PCR同樣可以進(jìn)行缺失突變。圖3-7給出了產(chǎn)生缺失突變的過程。對(duì)用于重疊延伸進(jìn)行基因剪接的寡核苷酸片段，其不同部位在反應(yīng)中執(zhí)行不同的功能。

※(2)幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法

④利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點(diǎn)突變

寡核苷酸的3端必須含有使它在其模板上作為引物的序列，這通常被稱為引導(dǎo)區(qū)(primingregion)；在寡核昔酸的5端應(yīng)含有將兩個(gè)基因片段結(jié)合到一起的重疊序列，稱為重疊區(qū)(overlapregion)(如圖3-7所示)。在重疊區(qū)和引導(dǎo)區(qū)之間，可包括用作插入突變的插入?yún)^(qū)

第52頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變★2.區(qū)域性定向突變

基因工程技術(shù)不但可使基因產(chǎn)生特異性位點(diǎn)突變，也可以產(chǎn)生區(qū)域性的突變。常用的方法如盒式突變法(cassettemutagenesis)，又稱片段取代法(DNAfragmentreplacement)。這一方法的要點(diǎn)是利用目標(biāo)基因中所具有的適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，用具有任何長度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段來置換或取代目標(biāo)基因上的一段DNA序列。這樣，人們不僅可以通過改變幾個(gè)氨基酸序列來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能之間的關(guān)系，也可以通過盒式突變法產(chǎn)生嵌合蛋白質(zhì)。在這個(gè)嵌合蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)分子中的整個(gè)結(jié)構(gòu)域都可以用完全不同的氨基酸序列來置換。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第53頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變★2.區(qū)域性定向突變

盒式突變最有用武之地是產(chǎn)生各種特異性的突變或突變家族，在這些突變體中各種不同的序列被集中在目標(biāo)基因的一個(gè)特定區(qū)域，從而為研究蛋白質(zhì)特定結(jié)構(gòu)區(qū)段或特定結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能提供了一個(gè)切實(shí)可行的方法。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑要進(jìn)行盒式突變，需要解決兩個(gè)關(guān)鍵問題。一個(gè)是在目標(biāo)基因序列中，要有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，使得用以取代天然DNA序列的盒式突變序列可以有效地插入到目標(biāo)基因中。可以利用遺傳密碼的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，通過改變某些核苷酸的序列，產(chǎn)生合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。PCR方法以及寡核苷酸的化學(xué)合成方法都可以有效地解決這一問題。第54頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變★2.區(qū)域性定向突變

另一個(gè)是，如何得到各種合適的、用以取代目標(biāo)基因中特定DNA片段的突變DNA片段。利用PCR技術(shù)產(chǎn)生具有特定限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的、具有各種突變位點(diǎn)的盒式突變DNA片段的技術(shù)已經(jīng)成熟。此外，利用DNA的化學(xué)合成、引物介導(dǎo)的DNA合成技術(shù)等都可以得到用于盒式突變的DNA片段。值得指出的是，為確保盒式突變序列能按正確的方向插入，突變序列的兩端必須分別具有與目標(biāo)基因上相匹配的、但彼此之間不相容的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。實(shí)際上對(duì)于目標(biāo)基因進(jìn)行區(qū)域性的定向突變，除了上述的盒式突變技術(shù)外，也完全可以通過PCR方法對(duì)給定基因序列進(jìn)行融合和剪接，這樣基因內(nèi)、基因間或人工修飾基因片段之間的重組、改造就不受特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的存在與否的限制。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第55頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基因融合和基因剪接

★1.利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由

重組DNA技術(shù)允許在體外產(chǎn)生不同基因或基因片段之間的融合，并通過融合基因產(chǎn)生融合蛋白。用基因融合表達(dá)外源蛋白有以下緣由——①外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解，有時(shí)可以通過產(chǎn)生融合蛋白避免目標(biāo)基因產(chǎn)物被快速降解，從而穩(wěn)定表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)率。特別是表達(dá)一些小肽基因時(shí)，這是一個(gè)好的策略。

②通過與一特異性蛋白質(zhì)或其特異的結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白，可使表達(dá)產(chǎn)物得到快速、有效的回收、純化。如將外源蛋白基因同金葡蛋白A的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白，可利用免疫親和層析的方法，對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第56頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基因融合和基因剪接

★1.利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由

③通過與特定的肽段進(jìn)行融合表達(dá)，可以將表達(dá)的外源蛋白質(zhì)定向地定位在宿主細(xì)胞的不同區(qū)位。如通過與分泌信號(hào)肽的融合，使外源蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中。④通過同特定蛋白先形成融合蛋白，然后再通過體外切割去除融合部分，是獲得天然蛋白的可靠和可重復(fù)性的方法。如在大腸桿菌中表達(dá)的真核蛋白，其N末端往往帶有甲硫氨酸殘基，如果與特定蛋白序列通過某種特定的連接形成融合蛋白，表達(dá)后通過特異性切割，可以獲得具有完全天然序列的外源蛋白質(zhì)分子。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第57頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基因融合和基因剪接

★1.利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由

⑤通過與特定的蛋白質(zhì)形成融合蛋白，如與硫氧化還原蛋白形成融合蛋白，可使外源蛋白改變?cè)诩?xì)胞內(nèi)的溶解性，防止包涵體的產(chǎn)生。⑥基因融合也是對(duì)基因進(jìn)行改造的手段，廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的研究。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第58頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基因融合和基因剪接

★2.基因融合的策略

基因融合可以采取以下幾種方式：①最簡單的融合方式是將重組基因直接剪接于適當(dāng)?shù)男盘?hào)肽之后。這種設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)在于，如果在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中信號(hào)肽被正確地加工，那么產(chǎn)生的重組蛋白就可具有天然的N末端。如用大腸桿菌生產(chǎn)人生長激素和人表皮生長因子時(shí)，就是將外源基因接到phoA信號(hào)肽的后面進(jìn)行分泌表達(dá)的。應(yīng)該指出，并非任何外源基因加上信號(hào)肽都可以分泌表達(dá)。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第59頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基因融合和基因剪接

★2.基因融合的策略

②將外源基因本身按閱讀框架自我融合。這種方式對(duì)一些小肽的穩(wěn)定表達(dá)尤其重要。如將由DSDGK五肽組成的抗IgE形成的活性肽基因，首尾相連成28聚體，再同二氫葉酸還原酶基因融合，可以得到高效表達(dá)的五肽產(chǎn)物。③目標(biāo)蛋白在與其融合的蛋白伙伴序列的C端或N端融合。C端融合的優(yōu)點(diǎn)是，啟動(dòng)子和翻譯起始信號(hào)都處于基因的5端，因此在3端所進(jìn)行的不同基因片段的融合并不改變?cè)瓉韱?dòng)子和翻譯起始信號(hào)的原設(shè)計(jì)，因而目標(biāo)基因的表達(dá)水平相對(duì)來說可預(yù)測(cè)。N端融合的缺點(diǎn)是，目標(biāo)基因產(chǎn)物特異性的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始元件必須在目標(biāo)基因的5端設(shè)計(jì)好。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第60頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基因融合和基因剪接

★2.基因融合的策略

④分泌親和融合。此種設(shè)計(jì)是將分泌和親和純化的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，即N端為信號(hào)肽，然后是融合蛋白伙伴(用于親和分離)，再接目標(biāo)基因。

⑤雙親和融合法。即將目標(biāo)基因X，同兩個(gè)分別對(duì)兩個(gè)不同配基有特異性親和的異源結(jié)構(gòu)域A、B，以A-X-B的形式進(jìn)行融合。顯而易見，這種設(shè)計(jì)為以后的親和純化提供方便。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第61頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基因融合和基因剪接

★2.基因融合的策略

⑥分泌-插入融合法。此方法是將目標(biāo)基因插入到信號(hào)肽序列和一插入序列之間，此插入序列是一種可插入到細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的蛋白編碼。這種設(shè)計(jì)的目的是用以將受體或抗原定位于細(xì)胞的外表面或裝配成融合蛋白進(jìn)入類病毒顆粒。這樣的系統(tǒng)對(duì)于開發(fā)疫苗，或產(chǎn)生具免疫原的復(fù)合物是有意義的。

上述這些基因融合策略，主要是有利于外源基因的表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化以及細(xì)胞定位。作為蛋白質(zhì)分子改造可以借用這些策略對(duì)蛋白質(zhì)分子中的特定序列、結(jié)構(gòu)元件乃至結(jié)構(gòu)域通過基因剪接來進(jìn)行操作。

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第62頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基因融合和基因剪接

★3.產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法

將不同來源的蛋白質(zhì)分子、蛋白質(zhì)分子中的不同結(jié)構(gòu)域進(jìn)行剪接，是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的一種方法?；蛉诤虾图艚拥募夹g(shù)為實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的融合和剪接提供了有效的手段。

①如果兩個(gè)蛋白質(zhì)基因序列間有合適的、相容的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，那就通過將不同的編碼序列經(jīng)酶切后再用連接酶相連，形成一個(gè)首尾閱讀框正確的重組蛋白質(zhì)基因，然后通過基因工程手段進(jìn)行表達(dá)。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第63頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基因融合和基因剪接

★3.產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法

②如果相連的蛋白質(zhì)分子編碼序列間存在額外的堿基序列，可以通過產(chǎn)生缺失突變的方法去除。

③利用前面所述的PCR雙側(cè)重疊延伸法，可以在不需要分子間具有相容的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的情況下，將兩個(gè)編碼不同蛋白的DNA分子重組到一起，形成DNA分子嵌合體。其原理如圖3-8所示。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第64頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基因融合和基因剪接

★3.產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法

根據(jù)相同的原理，可以利用單側(cè)重疊延伸法，將兩個(gè)DNA分子拼接到一起：首先按圖3-8中的PCR反應(yīng)I以第一個(gè)基因?yàn)槟０瀹a(chǎn)生AB產(chǎn)物，這產(chǎn)物中其中一條鏈的5端含有第一個(gè)基因的序列，而其3端含有與第二基因匹配的序列。這樣，此序列就形成了一個(gè)所謂的巨大引物。然后以此為引物，以第二個(gè)基因?yàn)槟０暹M(jìn)行延伸反應(yīng)，形成含有這兩個(gè)基因的一條鏈；最后，以一對(duì)分別與第一基因和第二基因特定序列匹配的一對(duì)旁側(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即得到一個(gè)包含有兩個(gè)基因特定序列的嵌合分子。利用單側(cè)重疊法，可以節(jié)約一個(gè)引物。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第65頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基因融合和基因剪接

★3.產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第66頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基因融合和基因剪接

★3.產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法

需要指出的是，在利用重疊延伸方法產(chǎn)生突變體或重組分子時(shí)，PCRI和PCRII的產(chǎn)物要分別用瓊脂糖凝膠電泳分離后，經(jīng)電泳洗脫或凍壓法進(jìn)行制備，然后將兩種產(chǎn)物混合、變性、退火，利用PCR進(jìn)行延伸、擴(kuò)增，這樣，可以提高特異性DNA片段的產(chǎn)率，減少非特異性DNA片段的生成。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第67頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基因融合和基因剪接

★4.蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接

蛋白質(zhì)的剪接(proteinsplicing)現(xiàn)象自1990年發(fā)現(xiàn)以來，以蛋白內(nèi)含子(intein)為基礎(chǔ)組建的基因工程表達(dá)載體在目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)純化、特定結(jié)構(gòu)域的同位素選擇性標(biāo)記、蛋白質(zhì)或多肽的環(huán)化等方面發(fā)揮著越來越大的作用。蛋白內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接已發(fā)展成為蛋白質(zhì)工程研究中的一個(gè)通用方法，利用這一方法可以將兩個(gè)目標(biāo)肽段在生理?xiàng)l件下相連接，形成功能蛋白分子。這個(gè)方法的原理如圖3-10所示。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第68頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月第69頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■二、基因融合和基因剪接

★4.蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接

目標(biāo)蛋白質(zhì)或蛋白片段用pCYB(BioLabs)作為表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果產(chǎn)生目標(biāo)蛋白―蛋白內(nèi)含子-甲殼素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。此融合蛋白經(jīng)與甲殼素親和層析純化，然后，將結(jié)合在親和介質(zhì)上的融合蛋白與苯硫酚及合成的肽一起保溫。由于琉基化合物的存在，使目標(biāo)蛋白從蛋白內(nèi)含子上切割下來，并在其C端形成具有高度反應(yīng)性的巰酯基團(tuán)，這個(gè)基團(tuán)與合成肽的N端半胱氨酸殘基相作用，在兩個(gè)多肽分子之間形成天然肽鍵。由此可見利用上述原理可以在蛋白質(zhì)水平上對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行剪接。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第70頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■三、tRNA介導(dǎo)定點(diǎn)攙入非天然氨基酸

通過引入非天然氨基酸到蛋白質(zhì)分子中，不但使我們對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能有更深的了解，也為生物醫(yī)學(xué)的研究提供新的手段。圖3-11給出將非天然氨基酸引入蛋白質(zhì)分子的特定位點(diǎn)的基本過程：①首先將目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因重組入可用于體外轉(zhuǎn)錄的載體中；②利用寡核苷酸介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性突變，將為特定氨基酸編碼的密碼子(如圖中的AGC)突變成無義密碼(TAG)；③利用runoff轉(zhuǎn)錄或化學(xué)/酶法反密碼子環(huán)取代法合成相應(yīng)的校正tRNA,并用T4RNA連接酶通過PdCpA-非天然氨基酸，將非天然氨基酸連到校正tRNA上；④通過體外轉(zhuǎn)錄體系，產(chǎn)生在特定位點(diǎn)突變成UAG的mRNA；⑤通過體外翻譯體系，借助攜帶有非天然氨基酸的校正tRNA上的反密碼子，通讀mRNA上的UAG無義密碼子，將非天然氨基酸攙入到蛋白質(zhì)分子中的特定位點(diǎn)。第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第71頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■三、tRNA介導(dǎo)定點(diǎn)攙入非天然氨基酸

第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第72頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑第二節(jié)蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)表達(dá)載體的一般特點(diǎn)與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素改善表達(dá)水平及溶解性的方法二、目標(biāo)蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中的表達(dá)有關(guān)酵母表達(dá)載體的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄元件外源mRNA在酵母細(xì)胞中的翻譯外源蛋白質(zhì)在酵母中的分泌表達(dá)翻譯后修飾第九講蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)三、重組蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)兩個(gè)主要的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)四、噬菌體顯示關(guān)于表達(dá)載體噬菌體顯示技術(shù)的操作噬菌體顯示技術(shù)的應(yīng)用第73頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)大腸桿菌(E.coli)表達(dá)體系是目前應(yīng)用最廣的一個(gè)外源基因表達(dá)體系。應(yīng)該說這是外源基因表達(dá)的首選體系，只有在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物由于不能正確折疊或缺少轉(zhuǎn)譯后修飾而沒有生物活性，或當(dāng)天然蛋白質(zhì)的回收率太低時(shí)，才考慮選擇其他表達(dá)體系。利用大腸桿菌作為表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)：①遺傳學(xué)和生理學(xué)背景清楚；②容易培養(yǎng)，特別是高密度發(fā)酵；③外源基因經(jīng)?？梢赃_(dá)到高效表達(dá)。第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)第74頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)大腸桿菌系統(tǒng)的不足之處：①不能進(jìn)行典型真核細(xì)胞所具有的復(fù)雜的翻譯后修飾，如糖基化、烷基化、磷酸化、特異性的蛋白水解加工等；而廣泛二硫鍵的形成以及外源蛋白質(zhì)組裝成多亞基復(fù)合體的能力也受到限制。②外源基因產(chǎn)物在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)易形成不溶性的包涵體；而當(dāng)真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，作為起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白質(zhì)的N末端。③由于真核mRNA的結(jié)構(gòu)特性以及密碼子使用頻率與大腸桿菌本身的差異，當(dāng)用真核mRNA的序列直接在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，有時(shí)不能得到足夠的產(chǎn)物。然而，當(dāng)外源蛋白質(zhì)分子量較小，不存在半胱氨酸或分子內(nèi)的二硫鍵少于3-4個(gè)，以及不需要翻譯后修飾而能保持其生物活性的蛋白質(zhì)，大多可以利用大腸桿菌系統(tǒng)得到滿意的結(jié)果。第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)第75頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)用于大腸桿菌細(xì)胞的表達(dá)載體有很多種，為了使外源基因能高效表達(dá)，一個(gè)典型的表達(dá)載體至少應(yīng)該包括如下的成分：第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)★1.表達(dá)載體的一般特點(diǎn)※(l)復(fù)制起始點(diǎn)絕大多數(shù)載體利用pBR322或pUC質(zhì)粒來源的復(fù)制起始點(diǎn)。復(fù)制起始點(diǎn)決定了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的拷貝數(shù)，也就決定了每個(gè)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)基因的數(shù)目。對(duì)于pBR322和pUC來源的復(fù)制起始點(diǎn)，可分別保持每個(gè)細(xì)胞中20-50個(gè)拷貝和150-200個(gè)拷貝。二者復(fù)制起始點(diǎn)都來源于ColE1(即大腸桿菌素E1)質(zhì)粒。pUC具有較高拷貝數(shù)的原因是由于rop基因的失活所致。rop基因編碼一小分子量蛋白，而這一蛋白又是作為ColE1來源的DNA復(fù)制的負(fù)調(diào)控因子，因此rop基因的失活可導(dǎo)致質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加。適度的質(zhì)?？截悢?shù)可使外源基因得到高表達(dá)，但太高的拷貝數(shù)可造成質(zhì)粒在受體細(xì)胞中的不穩(wěn)定性，對(duì)于外源基因的表達(dá)并無特別好處，目前已很少用。值得指出的是利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定共存于一個(gè)受體細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱之為質(zhì)粒不相容性。

第76頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)★1.表達(dá)載體的一般特點(diǎn)※(2)選擇性基因載體上要含有至少一個(gè)選擇性基因。選擇性基因的作用一方面用于對(duì)轉(zhuǎn)化體的確定，而另一方面在培養(yǎng)過程中使受體細(xì)胞保持質(zhì)粒不丟失。多拷貝的質(zhì)粒表現(xiàn)出分離性不穩(wěn)定，即在細(xì)胞分裂的過程中，有一定數(shù)量的細(xì)胞不能從親代細(xì)胞遺傳下任何質(zhì)粒拷貝。高水平地表達(dá)質(zhì)粒編碼的基因，特別是蛋白產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性的基因更加重了這種不穩(wěn)定性。pUC來源的表達(dá)載體比pBR322來源的表達(dá)載體不穩(wěn)定，其最可能的原因是由于其更高的拷貝數(shù)引起較高的表達(dá)水平所致。為了解決質(zhì)粒分離性不穩(wěn)定間題，人們采取利用選擇性基因，在抗生素選擇壓力下，使宿主細(xì)胞保持足夠數(shù)目的質(zhì)粒還可以通過克隆穩(wěn)定分離基因，保持質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性。選擇性基因往往是抗生素抗性基因，如氨芐青霉素以及四環(huán)素、卡那霉素抗性基因。值得指出的是，氨芐抗性基因在防止質(zhì)粒丟失方面并不特別有效，因?yàn)檫@個(gè)基因編碼的-內(nèi)酰胺酶可很快使抗生素降解，使氨芐青霉素的選擇壓力在細(xì)菌生長數(shù)代后喪失。而四環(huán)素抗性基因則能更有效地防止質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。

第77頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)★1.表達(dá)載體的一般特點(diǎn)※(3)強(qiáng)的、可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子原核細(xì)胞的啟動(dòng)子作為RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，使得RNA的轉(zhuǎn)錄有效的起始。啟動(dòng)子序列由-10區(qū)(TATAAT)和-35區(qū)(TTGACA)兩部分組成。-10區(qū)是RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn)，-35區(qū)是RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)，這兩個(gè)序列是決定啟動(dòng)子強(qiáng)度的重要因素。-10區(qū)和-35區(qū)之間的堿基組成并不重要，然而這兩個(gè)序列間的距離卻十分重要。實(shí)驗(yàn)表明，兩個(gè)序列之間為17堿基對(duì)時(shí)轉(zhuǎn)錄效率最高。作為外源基因的表達(dá)載體之所以選擇可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，是因?yàn)榭烧T導(dǎo)啟動(dòng)子是一類嚴(yán)格調(diào)控的啟動(dòng)子，能防止在培養(yǎng)過程中由于組成性高水平表達(dá)所造成的對(duì)細(xì)胞的毒性。當(dāng)然，足夠強(qiáng)的啟動(dòng)子可使表達(dá)產(chǎn)物積累達(dá)到總細(xì)胞蛋白的一半；在選擇啟動(dòng)子時(shí)除了考慮到其強(qiáng)度外，關(guān)鍵的是要考慮蛋白質(zhì)的合成是如何被誘導(dǎo)的，以及在沒有誘導(dǎo)物存在的條件下，蛋白質(zhì)的合成將被完全地關(guān)閉。再者選擇的啟動(dòng)子應(yīng)該是在各種生理?xiàng)l件及宿主細(xì)胞遺傳背景下都很容易實(shí)施誘導(dǎo)的。第78頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)★1.表達(dá)載體的一般特點(diǎn)常用的啟動(dòng)子有LacUV5、trp、tac、trc、噬菌體PL和PR以及T7啟動(dòng)子等，這些啟動(dòng)子都可以全部或最大限度地符合上述有關(guān)啟動(dòng)子的標(biāo)準(zhǔn)。LacUV5、tac、trc啟動(dòng)子可被乳糖阻遏蛋白阻遏。由這些啟動(dòng)子構(gòu)建的載體通常需要在載體上或宿主細(xì)胞中存在LacI或LacIq基因的高表達(dá)。對(duì)于這類啟動(dòng)子的化學(xué)誘導(dǎo)劑是異丙基--D-硫代半乳糖苷(IPTG)，但由于IPTG價(jià)格昂貴且影響細(xì)胞的生理狀態(tài)，不適于工業(yè)生產(chǎn)；乳糖可代替IPTG，且便宜，不足之處是乳糖是一種較弱的誘導(dǎo)物。

第79頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)★1.表達(dá)載體的一般特點(diǎn)※(4)強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列為使目標(biāo)基因被有效地轉(zhuǎn)錄，需要轉(zhuǎn)錄終止序列或抗-終止序列?？?終止調(diào)控序列保證目標(biāo)基因完全被轉(zhuǎn)錄；而轉(zhuǎn)錄終止序列是減少不必需的轉(zhuǎn)錄通過復(fù)制起始點(diǎn)，其作用可能是幫助穩(wěn)定mRNA，從而增加mRNA的半壽期。轉(zhuǎn)錄終止序列元件的存在可提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

第80頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)★1.表達(dá)載體的一般特點(diǎn)※(5)核糖體結(jié)合位點(diǎn)在啟動(dòng)子下游區(qū)和翻譯起始密碼ATG上游區(qū)要有核糖體結(jié)合位點(diǎn)(SD序列),SD序列的存在對(duì)原核細(xì)胞mRNA翻譯起始至關(guān)重要。近來確證了一個(gè)可有效促進(jìn)大腸桿菌翻譯起始復(fù)合體形成的序列元件，它處于起始密碼子的下游，稱為“下游盒”(DB,downstreambox）。

※(6)合適的多克隆位點(diǎn)用于將目標(biāo)基因插入到表達(dá)載體；也可以為載體的改造提供可選擇的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，當(dāng)然，用于此種目的的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)可存在于多克隆位點(diǎn)之外。第81頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)★2.與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素※(l)有效的轉(zhuǎn)錄起始與基因的高效表達(dá)有效的轉(zhuǎn)錄起始是外源基因能否在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)的關(guān)鍵步驟之一，也可以說，轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的主要的限速步驟。因此，選擇強(qiáng)的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子及相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個(gè)高效表達(dá)載體首先要考慮的問題?！?2)有效的翻譯與基因的高效表達(dá)蛋白質(zhì)的有效合成依賴于mRNA的穩(wěn)定性、翻譯起始的頻率、肽鏈延伸和終止的速率以及翻譯的忠實(shí)性等。第82頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)★2.與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素①mRNA的穩(wěn)定性：細(xì)胞內(nèi)mRNA的濃度是由mRNA轉(zhuǎn)錄的速率和mRNA降解之差來決定的。在細(xì)茵中mRNA的壽命很短，其半壽期在1~3min。通常用非常強(qiáng)的啟動(dòng)子可以彌補(bǔ)非常不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄物，使得蛋白質(zhì)合成達(dá)到一個(gè)可接受的水平?！?2)有效的翻譯與基因的高效表達(dá)

第83頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)★2.與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素①mRNA的穩(wěn)定性：保證有足夠的mRNA作為蛋白質(zhì)合成模板的另一種辦法是增加mRNA的半壽期，從而改善特定基因的表達(dá)。例如克隆具有高度傾向形成穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，能防止轉(zhuǎn)錄物從3端到5端的降解，從而增加了mRNA的半壽期，提高了蛋白質(zhì)的有效合成。細(xì)胞的生長速率、肽鏈起始速率和延伸速率以及所用宿主菌的品系也影響mRNA的穩(wěn)定性。然而，提高mRNA的穩(wěn)定性并不必然提高蛋白質(zhì)的合成?！?2)有效的翻譯與基因的高效表達(dá)

第84頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)★2.與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素②翻譯的起始：無效的翻譯起始多半是蛋白質(zhì)低表達(dá)的最常見的原因。翻譯的起始與下列因素有關(guān)：核糖體結(jié)合位點(diǎn)(SD序列)、SD序列與起始密碼之間的距離、緊靠近起始密碼上游區(qū)的堿基序列以及圍繞著SD序列和可翻譯序列5端形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的潛在能力?！?2)有效的翻譯與基因的高效表達(dá)

第85頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)★2.與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素②翻譯的起始：研究表明，如果符合下列條件可以得到最適的翻譯起始：(a)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列為UAAGGAGG;(b)在SD序列和起始密碼之間的堿基數(shù)是6~11個(gè)堿基，且堿基組成富含A-U；(c)AUG作為起始密碼子。上述這些條件并不完全刻板，有些mRNA盡管SD序列與上述典型序列差得很遠(yuǎn)，或含有局部的二級(jí)結(jié)構(gòu)，仍可進(jìn)行有效的翻譯。

※(2)有效的翻譯與基因的高效表達(dá)

第86頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)★2.與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素③翻譯的延伸(遺傳密碼的使用)：一個(gè)氨基酸可有多于一個(gè)密碼子為其編碼。61個(gè)密碼子使用的頻率因基因不同而有差別，有機(jī)體之間也有差別。在細(xì)胞中識(shí)別使用頻率高的密碼的tRNA含量要高。這樣，正在翻譯的核糖體遇到一串罕用密碼時(shí)，它可能停下來等待能識(shí)別此罕用密碼的氨酰tRNA出現(xiàn)。核糖體的暫停能引起翻譯提前成熟終止和目標(biāo)蛋白的低產(chǎn)率。最適密碼子在決定外源基因表達(dá)水平上的重要程度仍是一個(gè)在爭論的問題，因?yàn)橛脙?yōu)先使用的密碼子取代罕用密碼不僅影響膚鏈延伸的速率，而且也影響mRNA的穩(wěn)定性和起始頻率，而這兩者對(duì)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率都有很大的影響。也有的研究指出，罕用密碼的使用可使翻譯的效率減低約85％。然而也有實(shí)驗(yàn)指出完全用優(yōu)先使用的密碼合成的基因，其蛋白的表達(dá)也沒有明顯的增加。即使蛋白表達(dá)增加，其原因更像是由于mRNA的穩(wěn)定性提高和有效的翻譯起始造成的。然而，確實(shí)有報(bào)道指出，在基因編碼序列的5端使用優(yōu)先使用的密碼可以提高蛋白質(zhì)的表達(dá)效率，因此，有關(guān)在肽鏈延伸過程中，密碼使用的問題依然需要更多的實(shí)踐來驗(yàn)證。

※(2)有效的翻譯與基因的高效表達(dá)

第87頁，課件共136頁，創(chuàng)作于2023年2月■一、目標(biāo)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)★2.與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素④氨基酸的錯(cuò)誤攙入：在藥用多肽或蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中，翻譯產(chǎn)物的正確性至關(guān)重要。肽鏈中含有錯(cuò)誤攙入的氨基酸很難從產(chǎn)物中去除。通常翻譯過程非常精確，錯(cuò)誤攙入的概率為萬分之一。但在高效表達(dá)的重組蛋白質(zhì)