除了加入4種正常的脫氧核苷三磷酸dNTP外教學(xué)課件

第五章核酸的序列測(cè)定易發(fā)平基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室DNA的測(cè)序是分子生物學(xué)研究中非常重要和關(guān)鍵的內(nèi)容。對(duì)DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究,有助于探索基因結(jié)構(gòu)與功能、基因與疾病關(guān)系,進(jìn)而推動(dòng)生命科學(xué)研究獲得質(zhì)的飛躍。測(cè)定基因組的全部核苷酸序列、閱讀和分析全部遺傳信息,正是人類(lèi)基因組計(jì)劃(humangenomeproject,HGP)的最主要目標(biāo)之將DNA片段用熒光等分析儀,測(cè)出DNA序列堿基排列順序。DNA序列測(cè)定方法:冷1.Sanger的雙脫氧法:ATGC四個(gè)反應(yīng)÷2.化學(xué)降解法:G反應(yīng);G+T反應(yīng);T+C反應(yīng)和C反應(yīng)3.自動(dòng)測(cè)序法。DNA測(cè)序的主要方法有兩種,即雙脫氧鏈終止法(Sanger法、酶促法)和化學(xué)裂解法(Maxam-Gelbert法)。二者均依賴(lài)于高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。不管是酶促法還是化學(xué)法,都是分為4個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行測(cè)序反應(yīng),寡核苷酸鏈分別終止于不同位置的A、T、G或C堿基。4種反應(yīng)體系的寡核苷酸鏈產(chǎn)物,進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,放射自顯影后,讀出待測(cè)DNA的連續(xù)序列。70年代末WalterGilbert發(fā)明化學(xué)法FrederickSanger發(fā)明雙脫氧終止法手動(dòng)測(cè)序,同位素標(biāo)記80年代中期出現(xiàn)自動(dòng)測(cè)序儀熒光代替同位素,計(jì)算機(jī)圖象識(shí)別90年代中期測(cè)序儀重大改進(jìn)集束化的毛細(xì)管電泳代替凝膠電泳、Sanger雙脫氧鏈終止法(一)原理(單鏈)DNA鏈中的核苷酸是以3,5-磷酸二酯鍵相連接,合成DNA所用的底物是2-脫氧核苷三磷酸(dNTP),在Sanger雙脫氧鏈終止法中被摻入了2,3-雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP),當(dāng)dNTP位于鏈延伸末端時(shí),由于它沒(méi)有3-OH,不能再與其它的脫氧核苷酸形成3’,5′-磷酸二酯鍵,DNA合成便在此處終止,如果此處摻入的是一個(gè)ddaTP,則新生鏈的末端就是A,依次類(lèi)推可以通過(guò)摻入ddTtp、ddcTP、ddGTP,則新生鏈的末端為T(mén)、C或G,根據(jù)這個(gè)原理,Sanger與1977年建立了雙脫氧鏈終止測(cè)序法。他本人也因此而獲得了諾貝爾獎(jiǎng)Sanger003200、雙脫氧核苷三磷酸HHddNTPdAtPdGTP互補(bǔ)鏈合成過(guò)程5PIPI(PI(PLOHOH引物鏈ACGGCTAC模板鏈?zhǔn)归g回以單鏈或雙鏈DNA為模板,采用DNA引物引導(dǎo)新生DNA的合成,因此又稱(chēng)為引物合成法,或酶促引物合成法。主要是基于DNA聚合酶的催化特性:①以DNA為模板,根據(jù)堿基配對(duì)的原則逐個(gè)將dNTP加到與模板結(jié)合的寡核苷酸引物的3OH末端,形成正確的模板D