生化生物技術(shù)1課件

生化生物技術(shù)王旭東.前言二十一世紀(jì)----------生命科學(xué)的時(shí)代5年內(nèi)國(guó)家對(duì)生命技術(shù)的投入將超過100億元醫(yī)學(xué)的發(fā)展.生化生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史20年代：微量分析技術(shù)導(dǎo)致了維生素、激素和輔酶等的發(fā)現(xiàn)。瑞典著名的化學(xué)家T.Svedberg奠基了“超離心技術(shù)的理論基礎(chǔ)，1924年制成了第一臺(tái)5000RCF的離心機(jī)（5000r/min-8000r/min，相對(duì)離心力“RCF”的單位可表示為“×g”)，并準(zhǔn)確測(cè)定了血紅蛋白等復(fù)雜蛋白質(zhì)的分子量，獲得了1926年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。。.離心機(jī).超速離心機(jī).30年代：

電子顯微鏡技術(shù)打開了微觀世界，使我們能夠看到細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和某些生物大分子的大致結(jié)構(gòu)。美國(guó)哈佛大學(xué)的Folin教授和中國(guó)的吳憲教授建立了不少生物化學(xué)常用的分析方法如血糖分析、蛋白質(zhì)含量分析、氨基酸測(cè)定等。英藉德裔生物化學(xué)家Krebs，在1937年發(fā)現(xiàn)了三羧酸循環(huán)，對(duì)細(xì)胞代謝及分子生物學(xué)的研究作出了重要貢獻(xiàn)，他與美藉德裔生物化學(xué)家Lipmann共獲1953年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。.電子顯微鏡..40年代：兩位英國(guó)科學(xué)家Martin和Synge發(fā)明了分配色譜（層析），他們獲得了1952年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。由此，層析技術(shù)成為分離生化物質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)。

電泳技術(shù)由瑞典的著名科學(xué)家Tisellius奠基，從而開創(chuàng)了電泳技術(shù)的新時(shí)代，他因此獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。層析技術(shù)和電泳技術(shù)用于分析生物大分子的組成和代謝的中間產(chǎn)物，示蹤技術(shù)的應(yīng)用推動(dòng)了代謝的研究。美國(guó)化學(xué)家Pauling確認(rèn)氫鍵在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中以及生物大分子間相互作用的重要性等，并因此而獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。.50年代：自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次將放射性同位素示蹤用于碳水化合物及類脂物質(zhì)的中間代謝的研究以后，射性同位素示蹤技術(shù)50年代有了大的發(fā)展，為各種生物化學(xué)代謝過程的闡明起了決定性的作用。1953年美國(guó)科學(xué)家Watson和英國(guó)科學(xué)家Crick提出DNA分子反向平行雙螺旋模型，1962年與英國(guó)科學(xué)家Wilkins分享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，Wilkins和Franklin通過對(duì)DNA分子的X-射線衍射研究為Watson和Crick的DNA模型提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，DNA雙螺旋模型的提出開創(chuàng)了生物科學(xué)的歷史新紀(jì)元。.DNA模型.Watson和Crick.在X-射線衍射技術(shù)方面，英國(guó)物理學(xué)家Perutz對(duì)血紅蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行X-射線結(jié)構(gòu)分析,Kendrew測(cè)定了肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)，成為研究生物大分子立體結(jié)構(gòu)的先驅(qū)，他們同獲1962年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。英國(guó)生物化學(xué)家Sanger還于1953年確定了牛胰島素中氨基酸的順序而獲得1958年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。Kornberg發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶Ⅰ，美藉西班牙裔科學(xué)家Uchoa發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了將基因內(nèi)的遺傳信息通過RNA中間體翻譯成蛋白質(zhì)的過程。兩人分享了1959年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。.60年代：各種儀器分析方法用于生物化學(xué)研究，取得了很大的發(fā)展，如HPLC技術(shù)、紅外、紫外、圓二色等光譜技術(shù)、NMR核磁共振技術(shù)等。自1958年Stem，Moore和Spackman設(shè)計(jì)出氨基酸自動(dòng)分析儀，大大加快了蛋白質(zhì)的分析工作。1967年Edman和Begg制成了氨基酸序列分析儀，到1973年Moore和Stein設(shè)計(jì)出氨基酸序列自動(dòng)分析儀，又大大加快了對(duì)多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，十多年間氨基酸的自動(dòng)測(cè)定工作得到了很大的發(fā)展和完善。.在60年代，層析和電泳技術(shù)又有了重大的進(jìn)展，在1968-1972年Anfinsen創(chuàng)建了親和層析技術(shù)，開辟了層析技術(shù)的新領(lǐng)域。1969年Weber應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)測(cè)定了蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，使電泳技術(shù)取得了重大進(jìn)展。美國(guó)生物化學(xué)家Nirenberg在破譯遺傳密碼方面作出了重要貢獻(xiàn)，Holly闡明了酵母丙氨酸t(yī)RNA的核苷酸排列順序，后來證明所有tRNA的結(jié)構(gòu)均相似。美藉印度裔生物化學(xué)家Khorana提出按預(yù)定的序列合成核酸分子的方法。他們3人共獲1969年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。法國(guó)生物學(xué)家Lwoff、JAcob和生物化學(xué)家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共獲1965年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。.70年代：

基因工程技術(shù)取得了突破性的進(jìn)展，Arber，Smith和Nathans三個(gè)小組發(fā)現(xiàn)并純化了限制性內(nèi)切酶，1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué)的Berg等人首次用限制性內(nèi)切酶切割了DNA分子，并實(shí)現(xiàn)了DNA分子的重組。1973年，又由美國(guó)斯坦福大學(xué)的Cohen等人第一次完成了DNA重組體的轉(zhuǎn)化技術(shù)，這一年被定為基因工程的誕生年，Cohen成為基因工程的創(chuàng)始人，從此，生物化學(xué)進(jìn)入了一個(gè)新的大發(fā)展時(shí)期。與此同時(shí)，各種儀器分析手段進(jìn)一步發(fā)展，制成了DNA序列測(cè)定儀、DNA合成儀等。

.80年代基因工程技術(shù)進(jìn)入輝煌發(fā)展的時(shí)期，1980年，英國(guó)劍橋大學(xué)的生物化學(xué)家Sanger和美國(guó)哈佛大學(xué)的Gilbert分別設(shè)計(jì)出兩種測(cè)定DNA核苷酸序列的方法，而與Berg共獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，從此，DNA序列分析法成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)最重要的研究手段之一。他們3人在DNA重組和RNA結(jié)構(gòu)研究方面都作出了杰出的貢獻(xiàn)。1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛細(xì)管電泳技術(shù)（HPCE），由于其高效、快速、經(jīng)濟(jì)，尤其適用于生物大分子的分析，因此受到生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)等學(xué)科的科學(xué)工作者的極大重視，發(fā)展極為迅速，是生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)和儀器分析領(lǐng)域的重大突破，意義深遠(yuǎn)。現(xiàn)今，由于HPCE技術(shù)的異軍突起，HPLC技術(shù)的發(fā)展重點(diǎn)己轉(zhuǎn)到制備和下游技術(shù)。.1984年德國(guó)科學(xué)家Kohler、美國(guó)科學(xué)家Milstein和丹麥科學(xué)家Jerne由于發(fā)展了單克隆抗體技術(shù)，完善了極微量蛋白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)而共享了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1985年美國(guó)加利福尼亞州Cetus公司的Mullis等發(fā)明了用PCR技術(shù)（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA的技術(shù)，對(duì)于生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究工作具有劃時(shí)代的意義，因而與第一個(gè)設(shè)計(jì)基因定點(diǎn)突變的Smith共享1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1988年，美國(guó)遺傳學(xué)家McClintock由于在二十世紀(jì)五十年代提出并發(fā)現(xiàn)了可移動(dòng)的遺傳因子而獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1989年，美國(guó)科學(xué)家Altman和Cech由于發(fā)現(xiàn)某些RNA具有酶的功能（稱為核酶）而共享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。.PCR技術(shù).90年代：1993年，美國(guó)科學(xué)家Roberts和Sharp由于在斷裂基因方面的工作而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1994年，美國(guó)科學(xué)家Gilman和Rodbell由于發(fā)現(xiàn)了G蛋白在細(xì)胞內(nèi)信息傳導(dǎo)中的作用而分享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1995年，美國(guó)科學(xué)家Lewis、德國(guó)科學(xué)家Nusslein-Volhard和美國(guó)科學(xué)家Wieschaus由于在20世紀(jì)40-70年代先后獨(dú)立鑒定了控制果蠅體節(jié)發(fā)育基因而共享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。進(jìn)入21世紀(jì)以來，PCR技術(shù)、生物芯片技術(shù)不斷完善，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)發(fā)展迅速。.我國(guó)生物化學(xué)界的主要成就我國(guó)生物化學(xué)界的先驅(qū)吳憲教授在20年代初由美回國(guó)后，在協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生化系與汪猷、張昌穎等人一道完成了蛋白質(zhì)變性理論、血液生化檢測(cè)和免疫化學(xué)等一系列有重大影響的研究。1965年我國(guó)化學(xué)和生物化學(xué)家用化學(xué)方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的結(jié)晶牛胰島素，1983年又通過大協(xié)作完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工合成。近年來，在酶學(xué)研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及生物膜的結(jié)構(gòu)與功能等方面都有舉世矚目的研究成果。90年代以來，我國(guó)參與了人類基因組計(jì)劃，在水稻基因組研究中處于國(guó)際領(lǐng)先水平，在功能基因組學(xué)研究中取得不少成績(jī)。.結(jié)晶牛胰島素.第一節(jié)蛋白質(zhì)純化的基本知識(shí).一、蛋白質(zhì)純化的設(shè)計(jì)（一）基本原則1.原則純化蛋白質(zhì)通常是為了獲得純蛋白質(zhì)以便深人研究蛋白質(zhì)的活性、結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。.首先，必須了解待純化樣品中目的蛋白及主要雜質(zhì)的性質(zhì)，盡可能多收集有關(guān)蛋白質(zhì)的來源、性質(zhì)（分子大小、等電點(diǎn)）和穩(wěn)定性（蛋白質(zhì)對(duì)溫度、極端pH、蛋白酶、氧和金屬離子等的耐受性）等信息，這有助于設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)純化。.比如目的蛋白是糖蛋白或脂蛋白，它們就明顯區(qū)別于大多數(shù)的雜蛋白；蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外，可溶還是不可溶等都將影響到蛋白質(zhì)提取方法和緩沖液組成，對(duì)于細(xì)胞外蛋白質(zhì)，除去細(xì)胞可以有助于純化過程，與膜結(jié)合的蛋白質(zhì)需要用有機(jī)溶劑先溶解。.其次，純化開始之前必須了解最終產(chǎn)品的用途，從而設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)純化過程，同時(shí)要綜合考慮純化產(chǎn)品的質(zhì)量、數(shù)量和經(jīng)濟(jì)性等三個(gè)方面的要求。純化后的蛋白質(zhì)純度要多高，純化過程中能允許損失多少活性以及純化過程需多少時(shí)間和成本等都受到目的蛋白用途的影響。目的蛋白純度如果要求越高，往往所需要的操作時(shí)間越長(zhǎng)，成本越高。

.最后，充分了解各分離純化技術(shù)操作單元的大量信息也很重要，比如在細(xì)胞破碎時(shí)，需要了解包括流速、攪拌器類型、操作壓力、細(xì)胞濃度和種類、產(chǎn)品釋放的碎片和大小等；設(shè)計(jì)分析吸附色譜時(shí)，要了解包括色譜柱特征、凝膠或其他吸附劑的性能（結(jié)合能力、解離常數(shù)、流速等）。.2蛋白質(zhì)的純度對(duì)目的蛋白純度的要求取決于純蛋白質(zhì)的用途，如果是工業(yè)化應(yīng)用（在食品工業(yè)或日用化學(xué)工業(yè)），則需要大量的產(chǎn)品，此時(shí)純度是次要的。如果純蛋白質(zhì)被用于研究，所需數(shù)量比較少，在酶學(xué)研究中，80％～90％的純度就足夠了，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中，純度要在95％以上，而用于醫(yī)療的蛋白質(zhì)，必須考慮到所有的雜質(zhì)，對(duì)最終產(chǎn)物必須分析污染蛋白質(zhì)、DNA和在純化過程中的添加物。.可以采取一些特別的步驟除去這些雜質(zhì)，但是額外的純化步驟雖然可以提高純度，卻由于除掉最終的百分之幾雜質(zhì)比最初的純化要困難得多，會(huì)導(dǎo)致收率下降，增加成本，延長(zhǎng)了操作時(shí)間。為應(yīng)用于研究而純化蛋白質(zhì)，規(guī)模小，額外的純化步驟所需要的花費(fèi)并不重要，但工業(yè)化純化蛋白質(zhì)則需要綜合考慮純化的經(jīng)濟(jì)性..3蛋白質(zhì)活性的保持在大多數(shù)情況下，純化后蛋白質(zhì)應(yīng)盡可能保持活性，要采取盡可能少的純化步驟以減少蛋白質(zhì)變性和蛋白質(zhì)水解。盡量避免比較粗放的條件（如極端pH、有機(jī)溶劑等），選用合適的緩沖液，在純化的整個(gè)過程中，需要控制pH，以減少蛋白質(zhì)變性，通常采用20～50mmol／L的緩沖液濃度。.蛋白質(zhì)樣品的貯存溫度宜在4℃或更低，如果貯存時(shí)間長(zhǎng)或蛋白質(zhì)易水解，可采用冷凍方法，用液氮、干冰或甲醇進(jìn)行快速冷凍比較好，但是冷凍法對(duì)有些酶也不適用。在低溫（4℃）操作，加快純化過程而縮短操作時(shí)間，或加人蛋白酶抑制劑，都可以降低蛋白質(zhì)水解程度。.溶酶體是蛋白酶主要來源，盡量避免其受到破壞而釋放出蛋白酶，在酶提取液中加人蔗糖或麥芽糖可降低破壞程度。然而，即使是微量蛋白酶，也能水解大量蛋白質(zhì)，因此在純化后期也要仔細(xì)操作。由于許多蛋白酶分子量在20000～30000之間，凝膠過濾可用于蛋白質(zhì)初步純化，以分離大多數(shù)蛋白酶污染物。選擇簡(jiǎn)單、快速、高專一性的酶分析方法，可以縮短樣品在純化各步驟間的貯存時(shí)間，也可降低蛋白質(zhì)水解程度。.4蛋白質(zhì)的數(shù)量純蛋白質(zhì)的數(shù)量不僅僅受原材料數(shù)量的影響，還受到蛋白質(zhì)純化收率的影響。在有不同原料可供選擇時(shí)，一般選用目的蛋白最穩(wěn)定、含量最豐富的，同時(shí)也考慮獲得原料是否容易，數(shù)量是否足夠多，成本是否比較低。在純化過程，每一步驟中都會(huì)損失蛋白質(zhì)，所以純化步驟應(yīng)盡量少，以得到高蛋白質(zhì)收率，但是純化步驟的減少會(huì)降低目的蛋白的最終純度，需要恰當(dāng)選擇各種純化方法以提高蛋白質(zhì)收率。.（二）過程優(yōu)化蛋白質(zhì)純化的過程優(yōu)化就是使蛋白質(zhì)純化后收率、純度最高，成本最低。在有純化方案可供實(shí)施時(shí)，需要對(duì)純化過程進(jìn)行優(yōu)化，此時(shí)已經(jīng)了解了純化過程條件和目的蛋白產(chǎn)品的特性。過程優(yōu)化必須解決兩類問題：一是在可替換的操作中作出選擇（如離心或超濾等）；二是設(shè)計(jì)理想的色譜順序，以最少的步驟（—、二或三步）獲得最大的產(chǎn)量。.每一分離純化方法都要諷估其處理樣品能力、蛋白質(zhì)收率和純化成本。在純化初期階段，高處理量和低成本十分重要，而在后期高分辨率很重要。純化分離初期要求減小樣品體積，常常使用高處理量的沉淀技術(shù)，色譜中吸附法處理量最大，一般不采用凝膠過濾作為純化初期操作步驟，因?yàn)樗幚砹啃　?使用高分辨率技術(shù)可以減少純化步驟，也使蛋白質(zhì)更純。沉淀步驟分辨率低，而色譜法高，親和色譜有很高分辨率。各純化技術(shù)都有一個(gè)平均收率范圍，硫酸鐵沉淀法和雙水相提取法的收率通常大于80％。親和色譜法收率較低（在60％以下），且成本高，因此一般用在純化的后期。通常先用低成本技術(shù)以除去大部分雜質(zhì)，避免損壞價(jià)格高的色譜柱。.純化技術(shù)頗序的選擇上，一般先使用沉淀技術(shù)，然后依次是離子交換、親和色譜，最后是凝膠過濾，這樣，每一種技術(shù)利用了蛋白質(zhì)的不同性質(zhì)，沉淀技術(shù)能處理大量的高濃度蛋白質(zhì)溶液，離子交換除去大部分雜蛋白以便進(jìn)人價(jià)格高的親和色譜柱，凝膠過濾用于最后純化環(huán)節(jié)，這時(shí)處理量已不是問題。總之，純化方案的確定，除考慮利用蛋白質(zhì)不同的特性外，步驟應(yīng)盡可能少，盡量使分離產(chǎn)物不需進(jìn)一步處理就可以直接進(jìn)行下一步操作。.對(duì)所有蛋白質(zhì)適用的純化方案是不存在的，因?yàn)樵蟻碓春透鞣N蛋白質(zhì)純化的要求不同?？梢酝ㄟ^試用多種方法先找出大致途徑，或使用專家系統(tǒng)，以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的專家系統(tǒng)在人工智能領(lǐng)域已經(jīng)成了非常重要的工具，現(xiàn)有的人工智能可以通過相互作用的邏輯推理來找出蛋白質(zhì)純化的最理想方案。對(duì)100種純化過程進(jìn)行分析，平均分離純化步驟是四步，總收率28％，平均每一步純化倍數(shù)為8。.（三）經(jīng)濟(jì)性.（四）規(guī)?；鞍踪|(zhì)純化商業(yè)化的多肽和蛋白質(zhì)生產(chǎn)至今還僅僅限于一些由微生物產(chǎn)生的或是從動(dòng)植物組織中提取出的酶。重組DNA和組織培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)展使得規(guī)?；a(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽成為可能，其中不少產(chǎn)品都是和人類健康有關(guān)的，比如干擾素、抗生素和疫苗等。

.規(guī)?；兓鞍踪|(zhì)，目的是盡可能提高產(chǎn)量，并降低成本，同時(shí)也盡可能避免人為因素干擾，純化過程還應(yīng)盡可能精簡(jiǎn)。進(jìn)行規(guī)模化純化蛋白質(zhì)時(shí)，已經(jīng)基本了解目的蛋白、原料、生產(chǎn)方法、產(chǎn)品純度要求和最終數(shù)量等，但是純化過程中很多方面可能要重新評(píng)估并作出適當(dāng)?shù)母淖儭膶?shí)驗(yàn)室規(guī)模純化蛋白質(zhì)向工業(yè)化規(guī)模純化生產(chǎn)蛋白質(zhì)的擴(kuò)大，屬于工程學(xué)的范疇。工廠規(guī)模是一次性的，它必須成功。.二、生物分離純化的一般工藝過程.主要操作過程（一）細(xì)胞分離分離微生物細(xì)胞的主要措施為離心、傳統(tǒng)過濾和膜過濾。傳統(tǒng)過濾用于生物懸浮物的分離是困難的，選擇離心或膜過濾，需要綜合考慮資金、操作維修費(fèi)用、回收率和過程時(shí)間等因素。影響分離過程經(jīng)濟(jì)效益的一個(gè)主要因素是被分離顆粒的大小。.工業(yè)用離心機(jī)通常設(shè)計(jì)成連續(xù)進(jìn)料。細(xì)胞在離心機(jī)中沉淀越快，在轉(zhuǎn)子中的保留時(shí)間就越短，相應(yīng)地，離心處理量越大。決定離心機(jī)容量的一個(gè)主要因素是相關(guān)粒子的大小。通過離心操作回收酵母已有很多年，而動(dòng)物細(xì)胞的處理更加復(fù)雜，因?yàn)樗鼈兒苋菀灼屏?，?dāng)通過離心系統(tǒng)時(shí)，可能會(huì)分解產(chǎn)生微小的碎片。大規(guī)模分離細(xì)菌和細(xì)胞碎片最常用的離心機(jī)是多層轉(zhuǎn)盤離心機(jī)。在低流速（300～500L／h）時(shí)，可以將零。0.5um以上的顆粒分離，而在高流速（3000～5000L／h）時(shí)，可以將整個(gè)細(xì)胞分離出來。但是，離心操作費(fèi)用高，也難于無菌操作，產(chǎn)生熱量，形成噪聲。.過濾技術(shù)（深層過濾，微孔過濾，超濾）常用于固液分離。旋轉(zhuǎn)式真空過濾機(jī)是比較常見的一種，已應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)酶制劑過程，從發(fā)酵液中除去細(xì)菌菌體或絲狀微生物。膜過濾系統(tǒng)越來越多應(yīng)用于規(guī)?；瘡陌l(fā)酵液中分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，在無菌分離的效果方面遠(yuǎn)好于價(jià)格昂貴的離心機(jī)。然而，膜過濾的主要缺點(diǎn)是不能處理高濃度細(xì)胞，高濃度細(xì)胞會(huì)明顯降低過濾速度。微濾能夠截留溶液中非蛋白質(zhì)的微小物質(zhì)，而超濾能夠截留溶液中的蛋白質(zhì)。.（二）細(xì)胞破碎和碎片分離對(duì)于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分離，需要先有效破碎細(xì)胞。通常先收集細(xì)胞，然后進(jìn)行洗滌以除去殘留的培養(yǎng)基，對(duì)于僅僅由細(xì)胞膜包圍著的細(xì)胞，比如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，破碎比較容易，如果存在聚合細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)（比如微生物細(xì)胞），破碎時(shí)就會(huì)困難些。.實(shí)驗(yàn)室中常用的超聲波法由于較難以將足夠能量輸送到大量體積的細(xì)胞懸浮液中，不適于大規(guī)模破碎。適用于規(guī)?；僮鞯募?xì)胞破碎方法主要有均質(zhì)法和高速玻璃珠研磨法，需要注意的是，應(yīng)盡量縮短操作時(shí)間。均質(zhì)法是當(dāng)前最廣泛使用的破碎技術(shù)，產(chǎn)量可達(dá)6000L／h，但它不太適用于高等真菌。裝置如果沒有制冷，由于釋放大量的機(jī)械能，溫度上升比較高，有些蛋白質(zhì)會(huì)因此而變性，所以樣品溶液在進(jìn)入設(shè)備前及離開設(shè)備后都要盡量冷卻。..研磨法采用無鉛玻璃珠（0。4～1。5mm），細(xì)胞懸浮液在有小玻璃珠的情況下高速攪拌，最大處理量可以達(dá)到2000L／h。最佳玻璃珠尺寸的選擇取決于破碎對(duì)象的大小和所釋放產(chǎn)物所處的位置，小的玻璃珠對(duì)破碎細(xì)菌非常有效，而大的玻璃珠對(duì)酵母細(xì)胞很有效。該法的破碎效率受破碎對(duì)象、細(xì)胞濃度、攪拌速度、玻璃珠大小、溫度和進(jìn)料速度等因素的影響，細(xì)胞破碎效率隨攪拌速度增加而達(dá)到一最高值，然后隨速度增加而下降。.相對(duì)于均質(zhì)法，在攪拌速度不高時(shí)，細(xì)胞濃度會(huì)影響到研磨法的破碎效率。最合適的細(xì)胞濃度隨微生物種類不同而變化，一般為細(xì)胞濕重的30％～60％。操作溫度通常限制在很窄的范圍內(nèi)，通常在5～15℃，以免造成蛋白質(zhì)熱變性，一般需要采用夾套方式進(jìn)行冷卻。.由于細(xì)胞要徹底破碎以獲得較高的收率，細(xì)胞內(nèi)所有物質(zhì)都被釋放，因此，必須從復(fù)雜混合物（包括蛋白質(zhì)、核酸及細(xì)胞壁碎片）中分離出目的產(chǎn)物，目的蛋白可能會(huì)受到釋放出的蛋白酶的降解。另外，核酸不僅難以分離，而且大大提高了懸浮液的黏度。除去核酸的技術(shù)包括使用核酸酶和沉淀。核酸污染雖然含量很低，但是對(duì)于醫(yī)藥級(jí)蛋白質(zhì)還是有影響。.酶解法條件溫和，對(duì)降解細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有特異性，是比較理想的方法。但是不同細(xì)胞組織需要不同的酶，而且因所處的不同生理狀態(tài)，細(xì)胞對(duì)酶解的敏感程度會(huì)有明顯變化，因而酶解法還沒有被廣泛用于規(guī)?；扑槲⑸锛?xì)胞，但對(duì)于價(jià)值較高、采用機(jī)械法會(huì)造成損失的產(chǎn)品，酶解法已經(jīng)顯示出了良好的應(yīng)用前景。.細(xì)胞破碎過程中產(chǎn)生的細(xì)胞碎片，必須除去，以免污染或者堵塞純化蛋白質(zhì)所用的色譜柱，可以先進(jìn)行絮凝，再通過離心法將其碎片分離出來，但對(duì)直徑小于0.5um顆粒的處理效果不太理想。雙水相提取法也常用于分離碎細(xì)胞和細(xì)胞碎片。.（三）濃縮早期純化階段需要將蛋白質(zhì)溶液濃縮10～50倍，以減小過程體積并使隨后的操作更容易處理，這在規(guī)模化純化蛋白質(zhì)時(shí)是個(gè)重要的必不可少的步驟，超濾是比較合適的技術(shù)，一般采用錯(cuò)流系統(tǒng)。

.沉淀法在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中并不可取，因?yàn)檫@種方法處理量很??；引入的外來試劑必須在隨后去除或者回收；對(duì)于很稀濃度蛋白質(zhì)溶液，該方法處理效率不高，且收率很低；使用有機(jī)溶劑會(huì)造成維持設(shè)備的成本，生產(chǎn)區(qū)域的防火、防火花的成本較高。雙水相萃取技術(shù)可以用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)?；蛑性囈?guī)模，但工業(yè)化規(guī)模還不多見。.（四）色譜分離采用色譜技術(shù)從粗產(chǎn)品中分離純化蛋白質(zhì)，在生產(chǎn)中始終都要慎重操作。經(jīng)過濃縮后，得到了蛋白質(zhì)、其他成分（比如類脂物、細(xì)胞壁或其他多糖類）、鹽和水的混合液，隨后一般經(jīng)2～4步色譜純化才能達(dá)到所要求的蛋白質(zhì)純度?？梢詮牟煌纳V方法中進(jìn)行選擇，實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)結(jié)果有參考作用，專家系統(tǒng)也有助于優(yōu)化蛋白質(zhì)純化的順序。.首先采用典型操作（如吸附、雙水相萃取或鹽析沉淀等）來提高收率，減少純化步驟，然后采用高效液相離子交換色譜或親和色譜純化蛋白質(zhì)，得到99％（通常情況下95％～98％）純度的產(chǎn)品。經(jīng)過上述步驟之后，如果有需要，可進(jìn)一步采取其他方法以獲得超高純度。.新發(fā)展起來的適用于規(guī)?；氖强焖俚鞍踪|(zhì)液相色譜（fastproteinliquidchromatograph，F(xiàn)PLC）。FPLC在中等壓力條件下工作，比傳統(tǒng)色譜分離速度更快，分離效果更好。FPLC在實(shí)驗(yàn)室中被廣泛接受，在中試和大規(guī)模蛋白質(zhì)純化中也顯示出了強(qiáng)大的潛力。相比于高壓系統(tǒng)（如HPLC），它的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是其設(shè)備用塑料而非不銹鋼制成，可耐任何緩沖液，因而適于分離純化蛋白質(zhì)。.第二節(jié)生物大分子的提取蛋白質(zhì)（包括酶），核酸，脂類，糖類等生物大分子的制備分四個(gè)階段：一.選擇材料和預(yù)處理二.細(xì)胞的破碎及細(xì)胞組分的分離三.提取和純化四.濃縮，干燥和保存

.一.選擇材料及預(yù)處理動(dòng)物，植物，微生物都可作為制備生物大分子的原材料，所選用的材料主要依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。

有效成份是指欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)。而有效成分以外的其它物質(zhì)則統(tǒng)稱雜質(zhì)。在動(dòng)、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般較少。如胰臟中胰島素的含量小于其鮮重的百萬(wàn)分之一；穩(wěn)定性較差，大多數(shù)對(duì)酸、堿、高溫和高濃度有機(jī)溶劑等因子較敏感；易被微生物分解變質(zhì)。

材料的采集會(huì)大大影響實(shí)驗(yàn)的成敗,選用的材料不同，有效成分的含量就不同；同一材料的部位或生長(zhǎng)期不同，有效成分的含量也不盡相同?？偟膩碚f，材料選擇應(yīng)遵循的原則是，有效成分含量多、穩(wěn)定性好；來源豐富、保持新鮮；提取工藝簡(jiǎn)單、有綜合利用價(jià)值等。

.1.動(dòng)物組織：選材：必須選擇有效成分含量豐富且易分離的臟器組織為原材料。如磷酸單酯酶，從含量看，雖然在胰臟、肝臟和脾臟中較豐富，但是因其與磷酸二酯酶共存，進(jìn)行提純時(shí)，這兩種酶很難分開。所以實(shí)踐中常選用含磷酸單酯酶少，但幾乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。

脫脂：臟器中含量較高的脂肪，容易氧化酸敗，導(dǎo)致原料變質(zhì)影響純度操作和制品的率。常用的脫脂方法有：人工剝?nèi)ヅK器外的脂肪組織；浸泡在脂溶性的有機(jī)溶劑（丙酮，乙醚）中脫脂；采用快速加熱（50℃左右），快速冷卻的方法，使溶化的油滴冷卻后凝聚成油塊而被除去。

.

保存：對(duì)預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存。a.冰凍：剝?nèi)ブ竞徒钇さ冉Y(jié)締組織，短期保存：－10℃的冰箱內(nèi)；長(zhǎng)期保存：－70℃低溫冰箱內(nèi)。b.干燥：對(duì)于像腦垂體一類小組織，可置丙酮液中脫水，干燥后磨粉儲(chǔ)存?zhèn)溆茫粚?duì)于含耐高溫有效成分（如：肝素）的腸粘膜，可在沸水蒸煮處理，烘干后能長(zhǎng)期保存。

冰箱的除霜循環(huán)，可能對(duì)細(xì)胞造成傷害，要特別小心。解凍時(shí)要越快越好，但避免局部過熱。.2.植物材料：選材：注意植物品種和生長(zhǎng)發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。種子須泡脹或粉碎才可使用。含油脂較多的也要進(jìn)行脫脂處理。

a.提取核DNA：選用黃化苗（生長(zhǎng)7－10天小麥，水稻），防止葉綠體DNA的干擾b.提取RNA：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用生長(zhǎng)幼嫩組織為好。

保存：冷凍采樣后盡快放于－4℃――20℃冰箱內(nèi)。DNA,RNA采樣后，N2速凍，至－70℃冰箱。對(duì)RNA樣，如不立即使用，冷凍保存尤為重要。.3.微生物：選材：應(yīng)注意它的生長(zhǎng)期，在微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時(shí)有兩種情況：

a.利用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等。一般用離心法收集上清液，上清液只能在低溫下短期保存

b.利用菌體含有的生化物質(zhì)，如：蛋白質(zhì)，核酸和胞內(nèi)酶等。需破碎菌體細(xì)胞分離，濕菌體可低溫短期保存，凍干粉可在4℃保存數(shù)月。3..二.確定測(cè)定方法在效成分在原材料中含量較低，純化是使其純度增高的過程，因此，提取和分離的每個(gè)步驟均要測(cè)定有效成分的含量。測(cè)定方法要專一、準(zhǔn)確、靈敏和簡(jiǎn)便。使用較多的測(cè)定方法有分光光度法、熒光分析法、生物活性(如酶活力、激素活性)測(cè)定、電泳分析等，有時(shí)可用電化學(xué)法和免疫分析法。.三.細(xì)胞的破碎1.機(jī)械破碎：(1)研磨法：剪碎的動(dòng)物組織如鼠肝、兔肝等置研缽中，用研磨棒研碎。為了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。用勻漿器處理，也能破碎動(dòng)物細(xì)胞。此法較溫和，適宜實(shí)驗(yàn)室使用。但加石英砂時(shí)，要注意其對(duì)有效成分的吸附作用。如系大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用電動(dòng)研磨法。細(xì)菌和植物組織的細(xì)胞破碎均可用此法。.(2)組織搗碎器法：用搗碎器(轉(zhuǎn)速8000-10000r/m)處理30-45s可將植物和動(dòng)物細(xì)胞完全破碎。如用其破碎酵母菌和細(xì)菌的細(xì)胞時(shí)，須加入石英砂才有效。但是在搗碎期間必須保持低溫，搗碎的時(shí)間不易太長(zhǎng)，以防溫度升高引起有效成分變性?，F(xiàn)在多用細(xì)胞破碎儀。(3)超聲波法：借助聲波的震動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器的有效方法。多用于微生物細(xì)胞的破碎，一般輸出功率100-200W，破碎時(shí)間3—15min。如果在細(xì)胞懸浮液中加石英砂則可縮短時(shí)間。為了防止電器長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)轉(zhuǎn)產(chǎn)生過多的熱量，常采用間歇處理和降低溫度的方法進(jìn)行。.(4)壓榨法：是一種溫和、徹底破碎細(xì)胞的方法。用30MPa左右的壓力迫使幾十毫升細(xì)胞懸液通過一個(gè)小孔(＜細(xì)胞直徑的孔)，致使其被擠破、壓碎。(5)凍融法：將細(xì)胞置低溫下冰凍一定時(shí)間，然后取出置室溫下(或40℃左右)迅速融化。如此反復(fù)凍融多次，細(xì)胞可在形成冰粒和增高剩余胞液鹽濃度的同時(shí)，發(fā)生溶脹、破碎。.2.溶漲和自溶：

溶漲：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液如低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，引起細(xì)胞膜發(fā)生脹破的現(xiàn)象稱溶脹。例如紅血球置清水中會(huì)迅速溶脹破裂并釋放出血紅素。自溶：細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身所具有的各種水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，發(fā)生溶解的現(xiàn)象稱自溶。應(yīng)用此法時(shí)要特別小心操作，因?yàn)樗饷覆粌H可使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破壞，同時(shí)也可將某些有效成分在自溶時(shí)分解。.

3.化學(xué)處理：

用脂溶性的溶劑(如丙酮、氯仿、甲苯)或表面活性劑(如十二烷基磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉)處理細(xì)胞時(shí)，可將細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)部分溶解，進(jìn)而使細(xì)胞釋放出各種酶類或DNA等物質(zhì)，并導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞破碎。

.4.生物酶降解：生物酶(如溶菌酶)有降解細(xì)菌細(xì)胞壁的功能。在用此法處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，先是細(xì)胞壁消解，隨之而來的是因滲透壓差引起的細(xì)胞膜破裂，最后導(dǎo)致細(xì)胞完全破碎。例如從某些細(xì)菌細(xì)胞提取質(zhì)粒DNA時(shí)，不少方法都采用了加溶菌酶(來自蛋清)破壞細(xì)胞壁的步驟。當(dāng)有些細(xì)菌對(duì)溶菌酶不敏感時(shí)，可加巰基乙醇（ME）或者8mol/L的尿素，以促進(jìn)細(xì)胞壁的消化。另外，也可加入蛋白酶K來提高破壁效果。而在破壞酵母菌的細(xì)胞時(shí)，可采用蝸牛酶進(jìn)行。一般對(duì)數(shù)期的酵母細(xì)胞對(duì)該酶較敏感。將酵母細(xì)胞懸于0.1mol/L檸檬酸/磷酸氫二鈉緩沖液(pH5.4)中，加入1%蝸牛酶，在30℃處理30分鐘，即可使大部分細(xì)胞壁破裂，如同時(shí)加入0.2%巰基乙醇效果更好。.四.抽提1.抽提的含義：

抽提通常是指用適當(dāng)?shù)娜軇┖头椒◤脑牧现邪延行С煞址蛛x出來的過程。經(jīng)過處理的原材料中的有效成分可用緩沖液、稀酸、稀堿、或有機(jī)溶劑（如丙酮、乙醇）等抽提，有時(shí)還可用蒸餾水抽提。一般理想的抽提液應(yīng)具備下述條件：對(duì)有效成分溶解度大，破壞作用小；對(duì)雜質(zhì)不溶解或溶解度很??；來源廣泛、價(jià)格低廉、操作安全等。.2.抽提的影響因子在抽提階段，pH值、金屬離子、溶劑的濃度和極性等因子，可明顯影響有效成分的性質(zhì)和數(shù)量。因此選擇抽提液必須考慮這些因素。（1）pH值：改變?nèi)苜|(zhì)解離狀態(tài)。對(duì)蛋白質(zhì)或酶等具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)物質(zhì)，一般選擇抽提液的pH值應(yīng)在偏離等電點(diǎn)的穩(wěn)定范圍內(nèi)。通常堿性蛋白質(zhì)選用低pH值的溶液抽提，酸性蛋白質(zhì)選用高pH值的溶液抽提，或者用調(diào)至一定pH值的有機(jī)溶劑抽提。注意：當(dāng)用酸，堿控制溶液pH值時(shí)，要邊加邊攪，防止局部出現(xiàn)過高的酸，堿濃度造成蛋白變性。

.(2)溶劑的極性和離子強(qiáng)度：有些生物大分子在極性大、離子強(qiáng)度高的溶液中穩(wěn)定；有些則在極性小、離子強(qiáng)度低的溶液中穩(wěn)定。例如提取刀豆球蛋白A時(shí)，用0.15mol/L甚至更高濃度的NaCl溶液，都可使其從刀豆粉中溶解出來，穩(wěn)定存在。而抽提脾磷酸二酯酶時(shí)，則需用0.2mol/L蔗糖水溶液。一種物質(zhì)溶解度大小與溶劑性質(zhì)密切相關(guān)（相似相溶原理）；離子強(qiáng)度通過影響溶質(zhì)的帶電性也影響溶質(zhì)的溶解度。降低極性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亞砜，二甲基甲酰氨。.提高離子強(qiáng)度：在水溶液中加中性鹽（KCl,NaCl,NH4Cl,(NH4)2SO4）一般離子強(qiáng)度較低的中性鹽溶液可促進(jìn)蛋白溶解（鹽溶），高離子強(qiáng)度的中性鹽可引起蛋白質(zhì)沉淀，析出（鹽析）。高離子強(qiáng)度使DNA溶解度增加；低離子強(qiáng)度使RNA溶解度增加（核酸分離依據(jù)）。常用的鹽溶液是NaCl溶液，濃度以0.15mol/L為宜。但是在提取核蛋白或細(xì)胞器中的蛋白質(zhì)時(shí)，為促使蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與細(xì)胞器分離，則宜用高濃度(0.5-2.0mol/L)的鹽溶液。.(3)水解酶：細(xì)胞破裂后，許多水解酶釋放出來。水解酶與欲抽提的蛋白質(zhì)或核酸接觸時(shí)，一旦條件適宜，就會(huì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸分解，而使實(shí)驗(yàn)失敗。為此，必須采用加入抑制劑，調(diào)節(jié)抽提液的pH、離子濃度或極性等方法，使這些酶喪失活性。如：提取，純化胰島素時(shí)，為阻止胰蛋白酶活化，采用68％的乙醇溶液（pH2.5-3.0,用草酸調(diào)節(jié)），在13－15℃抽提3h，可得到較高的回收率。因?yàn)?8％乙醇可使胰蛋白酶暫時(shí)失活，草酸可除去蛋白酶的激活劑Ca2+，酸性環(huán)境也抑制酶蛋白活性。RNA提取需防止RNase的水解作用，RNase活性很高，很容易使RNA降解，所以每一步都嚴(yán)格控制RNase，可采用DEPC（焦碳酸二乙脂）處理，帶手套操作，提取液中加強(qiáng)的變性劑異硫氰酸胍等措施。

.(4)溫度：一般認(rèn)為蛋白質(zhì)或酶制品在低溫(如0℃左右)時(shí)最穩(wěn)定。例如：在生產(chǎn)人絨毛膜促性腺激素(HCG，糖蛋白)制品時(shí)，一定要在低溫下進(jìn)行。當(dāng)溫度低于8℃時(shí)，從200公斤孕婦尿中可提取約100克HCG粗品(活力為160u/mg)；當(dāng)溫度高于20℃時(shí)，從400公斤孕婦尿中都提取不到100克粗品，而且活力很低。此外，高溫下制備的HCG粗品很難進(jìn)一步純化至3500u/mg，原因是高溫會(huì)使HCG受到微生物和/或糖苷酶的破壞。一般提高溫度，溶解度增加，但易使大分子物質(zhì)變性失活。小分子物質(zhì)：50－70℃；生物大分子：0－10℃，最好控制在0－4℃.（5）攪拌：攪拌能促使欲抽提物與抽提液的接觸，并能增加溶解度。但是，一般宜采用溫和的攪拌方法，速度太快時(shí)容易產(chǎn)生泡沫，導(dǎo)致某些酶類變性失活。（6）氧化：一般蛋白質(zhì)都含相當(dāng)數(shù)量的巰基，該基團(tuán)常常是酶和蛋白質(zhì)的必須基團(tuán)，若抽提液中存在氧化劑或氧分子時(shí)，會(huì)使巰基形成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶(或蛋白質(zhì))失活(或變性)。在提取液中加入巰基乙醇，半胱氨酸。還原性谷胱甘肽等還原劑，可防止巰基發(fā)生氧化，使蛋白，酶失活。.（7）金屬離子：蛋白質(zhì)的巰基除易受氧化劑作用外，還能和金屬離子如鉛、鐵或銅作用，產(chǎn)生沉淀復(fù)合物。這些金屬離子主要來源于制備緩沖液的試劑中。解決的辦法：①用無離子水或重蒸水配制試劑；②在配制的試劑中加入1-3mmol/L的EDTA(金屬離子絡(luò)合劑)。（8）抽提液與抽提物的比例：在抽提時(shí)，抽提液與抽提物的比例要適當(dāng)，一般以5∶1為宜。如抽提液過多，則有利于有效成分的提取，但不利于純化工序的進(jìn)行。.第三節(jié)離心分離技術(shù)離心技術(shù)在生物科學(xué)，特別是在生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，已得到十分廣泛的應(yīng)用，每個(gè)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都要裝備多種形式的離心機(jī)。離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。.一.基本原理：⒈離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）：

當(dāng)一個(gè)粒子（生物大分子或細(xì)胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到的離心作用力“Fc”由下式定義：

Fc=m·a=m·ω2r

a：粒子旋轉(zhuǎn)的加速度，m：沉降粒子的有效質(zhì)量，ω：粒子旋轉(zhuǎn)的角速度，r：粒子的旋轉(zhuǎn)半徑(cm)。

.⒉相對(duì)離心力（relativecentrifugalforce，RCF）:

由于在轉(zhuǎn)速相同的情況下，離心力會(huì)隨離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離變化，因此在文獻(xiàn)中常用“相對(duì)離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，RCF就是實(shí)際離心場(chǎng)轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。

X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（revolutionsperminute,簡(jiǎn)寫成r/min,或rpm）。

22.一般在低速離心時(shí)（轉(zhuǎn)速小于5000r/min），離心力的大小常用r/min來表示，而超速離心時(shí)則用g或×g來表示。由于離心管中從管口到旋轉(zhuǎn)中心的距離是不同的，所以在同樣轉(zhuǎn)速時(shí)，管口和管底所受到的離心力也有差別。例如：在某個(gè)角度轉(zhuǎn)頭中，離心管口到旋轉(zhuǎn)中心的距離為4.8cm，而離心管底到旋轉(zhuǎn)中心的距離是8.0cm，當(dāng)轉(zhuǎn)速為12000r/min是，離心管口和離心管底所受到的相對(duì)離心力RCF分別是：RCF（管口）=1.118×10-5×(12000)2×4.8=7734gRCF（管底）=1.118×10-5×(12000)2×8.0=12891g科技文獻(xiàn)中離心力的數(shù)據(jù)通常是指其平均值（RCFav），即離心管中點(diǎn)的離心力。旋轉(zhuǎn)軸340rminravrmax.為便于進(jìn)行轉(zhuǎn)速和相對(duì)離心力之間的換算，Dole和Cotzias利用RCF的計(jì)算公式，制作了轉(zhuǎn)速“rpm”、相對(duì)離心力“RCF”和旋轉(zhuǎn)半徑“r”三者關(guān)系的列線圖，圖式法比公式計(jì)算法方便。換算時(shí)，先在r標(biāo)尺上取已知的半徑和在rpm標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線，與圖中RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)即為相應(yīng)的相對(duì)離心力數(shù)值。.⒊沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient，s）：根據(jù)1924年Svedberg對(duì)沉降系數(shù)下的定義為顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。若ω用2πn/60表示，則X1：離心前粒子到旋轉(zhuǎn)軸的距離。X2：離心后粒子到旋轉(zhuǎn)軸的距離。S：一般在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個(gè)Svedberg單位，簡(jiǎn)寫S，量綱為秒。例如，動(dòng)物細(xì)胞的核糖體沉降系數(shù)等于80S，它的含義就是：80×10-13s。細(xì)胞及細(xì)胞的各組分的沉降系數(shù)有很大的差異，所以可以利用生物樣品沉降系數(shù)的差異采用離心技術(shù)將他們彼此分開。

.5.沉降系數(shù)與物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量:由沉降系數(shù)根據(jù)Svedberg公式可以計(jì)算出物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量：

Mr=RTS20,w/[D20,w(1-γρ)]Mr：相對(duì)分子質(zhì)量；D20,w：以20℃的水為介質(zhì)時(shí)顆粒的擴(kuò)散系數(shù)；R:氣體常數(shù)；T：絕對(duì)溫度；S20,w：以20℃的水為介質(zhì)時(shí)顆粒的沉降系數(shù)；γ：偏比容，等于溶質(zhì)粒子密度的倒數(shù)；ρ：溶劑密度。

.6.沉降時(shí)間（sedimentationtime，Ts）:在實(shí)際工作中，常常需要在已有的離心機(jī)上把某一種溶質(zhì)從溶液中全部沉降分離出來，這就必須首先知道用多大轉(zhuǎn)速與多長(zhǎng)時(shí)間可達(dá)到目的。如果轉(zhuǎn)速已知，則需確定分離某粒子所需的時(shí)間。根據(jù)沉降系數(shù)（S）式可得積分得X2:離心轉(zhuǎn)軸至離心管底內(nèi)壁的距離；X1:離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液面之間的距離，將（t2－t1）用Ts表示：其中的(lnXmax?lnXmin)/ω2為一常數(shù)，稱k常數(shù)或k值。.二.離心機(jī)的主要構(gòu)造和類型：離心機(jī)可分為工業(yè)用離心機(jī)和實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)。實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)又分為制備性離心機(jī)和分析性離心機(jī)，制備性離心機(jī)主要用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大，分析性離心機(jī)一般都帶有光學(xué)系統(tǒng)，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)，依據(jù)待測(cè)物質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為（用離心機(jī)中的光學(xué)系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測(cè)），能推斷物質(zhì)的純度、形狀和相對(duì)分子質(zhì)量等。分析性離心機(jī)都是超速離心機(jī)。.1.制備性離心機(jī)可分為三類:

低速離心機(jī):最大轉(zhuǎn)速6000rpm左右，最大相對(duì)離心力近6000×g，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是固液沉降分離?？捎盟睫D(zhuǎn)頭，角度轉(zhuǎn)頭，其轉(zhuǎn)速不能嚴(yán)格控制，通常不帶冷凍系統(tǒng)，于室溫下操作，用于收集易沉降的大顆粒物質(zhì)，如紅血球、酵母細(xì)胞等。這種離心機(jī)多用交流整流子電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)，電機(jī)的碳刷易磨損，轉(zhuǎn)速是用電壓調(diào)壓器調(diào)節(jié)，起動(dòng)電流大，速度升降不均勻，一般轉(zhuǎn)頭是置于一個(gè)硬質(zhì)鋼軸上，因此精確地平衡離心管及內(nèi)容物就極為重要，否則會(huì)損壞離心機(jī)。.

高速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為20000-25000rpm（r/min），最大相對(duì)離心力為89000×g，最大容量可達(dá)3升，分離形式也是固液沉降分離，通常配有各種角式轉(zhuǎn)頭、蕩平式轉(zhuǎn)頭、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭、垂直轉(zhuǎn)頭和大容量連續(xù)流動(dòng)式轉(zhuǎn)頭、一般都有制冷系統(tǒng)，以消除高速旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭與空氣之間摩擦而產(chǎn)生的熱量，離心室的溫度可以調(diào)節(jié)和維持在0-40oC，轉(zhuǎn)速、溫度和時(shí)間都可以嚴(yán)格準(zhǔn)確地控制，并有指針或數(shù)字顯示。通常用于微生物菌體、細(xì)胞碎片、大細(xì)胞器、蛋白質(zhì)的硫酸銨沉淀物和免疫沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細(xì)胞器(如核蛋白體)或單個(gè)分子。..

超速離心機(jī)：大于30×103r/min，最大離心力600,000g，有驅(qū)動(dòng)和速度控制系統(tǒng)，溫度控制系統(tǒng)，真空系統(tǒng)（減少摩擦）。新式的有微處理機(jī)（按編定程序運(yùn)轉(zhuǎn)，自動(dòng)計(jì)算速度和時(shí)間）。有40多種不同容量和性能的轉(zhuǎn)頭給用戶選擇。離心容量由幾十毫升至2升，分離的形式是差速沉降分離和密度梯度區(qū)帶分離，離心管平衡允許的誤差要小于0.1克。超速離心機(jī)的出現(xiàn)，使生物科學(xué)的研究領(lǐng)域有了新的擴(kuò)展，它能使過去僅僅在電子顯微鏡觀察到的亞細(xì)胞器得到分級(jí)分離，還可以分離病毒、核酸、蛋白質(zhì)和多糖等。.

角式轉(zhuǎn)頭是指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)頭。它是由一塊完整的金屬制成的，其上有4-12個(gè)裝離心管用的機(jī)制孔穴，即離心管腔，孔穴的中心軸與旋轉(zhuǎn)軸之間的角度在20-40度之間，角度越大分離效果越好。優(yōu)點(diǎn)是具有較大的容量，且重心低，運(yùn)轉(zhuǎn)平衡，壽命較長(zhǎng)，顆粒在沉降時(shí)先沿離心力方向撞向離心管壁，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)就會(huì)出現(xiàn)顆粒沉積，此現(xiàn)象稱為“壁效應(yīng)”。壁效應(yīng)容易使沉降顆粒受突然變速所產(chǎn)生的對(duì)流擾亂，影響分離效果。.⑵蕩平式轉(zhuǎn)頭：這種轉(zhuǎn)頭有4或6個(gè)自由活動(dòng)的吊桶（離心套管），當(dāng)轉(zhuǎn)頭靜止時(shí)，吊桶垂直懸掛，當(dāng)轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速達(dá)到每分鐘200到800轉(zhuǎn)時(shí)，吊桶蕩至水平位置，這種轉(zhuǎn)頭最適合做密度梯度區(qū)帶離心優(yōu)點(diǎn)是梯度物質(zhì)可放在保持垂直的離心管中，離心時(shí)被分離的樣品帶垂直于離心管縱軸，而不像角式轉(zhuǎn)頭中樣品沉淀物的界面與離心管成一定角度，因而有利于離心結(jié)束后由管內(nèi)分層取出已分離的各樣品帶。其缺點(diǎn)是顆粒沉降距離長(zhǎng)，離心所需時(shí)間也長(zhǎng)。..⑶區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個(gè)轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成，轉(zhuǎn)子桶中裝有十字型隔板裝置，把桶內(nèi)分隔成四個(gè)或多個(gè)扇形小室，隔板內(nèi)有導(dǎo)管，梯度液或樣品液從轉(zhuǎn)頭中央的進(jìn)液管泵入，通過這些導(dǎo)管分布到轉(zhuǎn)子四周，轉(zhuǎn)頭內(nèi)的隔板可保持樣品帶和梯度介質(zhì)的穩(wěn)定。.沉降的樣品顆粒在區(qū)帶轉(zhuǎn)頭中的沉降情況不同于角式和外擺式轉(zhuǎn)頭，在徑向的散射離心力作用下，顆粒的沉降距離不變，因此區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的“壁效應(yīng)”極小，可以避免區(qū)帶和沉降顆粒的紊亂，分離效果好，而且還有轉(zhuǎn)速高，容量大，回收梯度容易和不影響分辨率的優(yōu)點(diǎn)，使超離心用于制備和工業(yè)生產(chǎn)成為可能。區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的缺點(diǎn)是樣品和介質(zhì)直接接觸轉(zhuǎn)頭，耐腐蝕要求高，操作復(fù)雜。.⑷垂直轉(zhuǎn)頭：其離心管垂直放置，樣品顆粒的沉降距離短，離心所需時(shí)間也短，適用于密度梯度區(qū)帶離心，離心開始時(shí)和結(jié)束時(shí)液面和樣品區(qū)帶要作九十度轉(zhuǎn)向，因而降速要慢。.⑸連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)頭：可用于大量培養(yǎng)液或提取液的濃縮與分離，轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成，離心時(shí)樣品液由入口連續(xù)流入轉(zhuǎn)頭，在離心力作用下，懸浮顆粒沉降于轉(zhuǎn)子桶壁，上清液由出口流出。

.3.離心管離心管主要用塑料和不銹鋼制成：塑料離心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點(diǎn)是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點(diǎn)是易變形，抗有機(jī)溶劑腐蝕性差，使用壽命短。不銹鋼管強(qiáng)度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學(xué)腐蝕。但用時(shí)也應(yīng)避免接觸強(qiáng)腐蝕性的化學(xué)藥品，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。塑料離心管都有管蓋，離心前管蓋必須蓋嚴(yán)，倒置不漏液。管蓋有三種作用：①防止樣品外泄。用于有放射性或強(qiáng)腐蝕性的樣品時(shí)，這點(diǎn)尤其重要。②防止樣品揮發(fā)。③支持離心管，防止離心管變形。.4.分析性離心機(jī)分析性離心機(jī)使用了特殊設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)頭和光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場(chǎng)中的沉降過程。從而確定其物理性質(zhì)。利用特殊配置的數(shù)據(jù)處理機(jī)自動(dòng)計(jì)算s(沉降系數(shù))和Mr。主要用于生物大分子的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定，估價(jià)樣品純度和檢測(cè)生物大分子構(gòu)象的變化等。主要產(chǎn)品有美國(guó)Beckman公司的ModelE及日本日立公司的282型。..分析性超速離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭是橢圓形的，以避免應(yīng)力集中于孔處。轉(zhuǎn)頭通過一個(gè)有柔性的軸聯(lián)接到高速的驅(qū)動(dòng)裝置上，轉(zhuǎn)頭在低溫和真空的腔室中旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)頭上有2-6個(gè)裝離心杯的小室，離心杯是扇形石英的，可以上下透光，離心機(jī)中裝有光學(xué)系統(tǒng)，在整個(gè)離心期間都能通過紫外吸收或折射率的變化監(jiān)測(cè)離心杯中沉降著的物質(zhì)，在預(yù)定的期間可以拍攝沉降物質(zhì)的照片，在分析離心杯中物質(zhì)沉降情況時(shí)，在重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個(gè)折射的透鏡，結(jié)果在檢測(cè)系統(tǒng)的照像底板上產(chǎn)生了一個(gè)“峰”，隨著沉降的不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，因此峰也移動(dòng)，從峰移動(dòng)的速度可以計(jì)算出樣品顆粒的沉降速度。分析性超速離心機(jī)的主要特點(diǎn)就是能在短時(shí)間內(nèi)，用少量樣品就可以得到一些重要信息，能夠確定生物大分子是否存在，其大致的含量，計(jì)算生物大分子的沉降系數(shù)，結(jié)合界面擴(kuò)散，估計(jì)分子的大小，檢測(cè)分子的不均一性及混合物中各組份的比例，測(cè)定生物大分子的分子量，還可以檢測(cè)生物大分子的構(gòu)象變化等。.三.離心分離方法的選擇1.差速離心法：

這是最普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時(shí)間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時(shí)間。當(dāng)以一定的離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)行離心時(shí)，在離心管底部就會(huì)得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進(jìn)行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它成分，需經(jīng)過2-3次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。..

此法主要由于組織勻漿液中分離細(xì)胞器和病毒，其優(yōu)點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點(diǎn)是：須多次離心，沉淀中有夾帶，分離效果差，不能一次得到純顆粒，沉淀于管底的顆粒受擠壓，容易變性失活。.2.密度梯度離心：又稱速率區(qū)帶離心法。是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。離心后在近旋轉(zhuǎn)軸處（X1）的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠(yuǎn)處（X2）介質(zhì)的密度最大，但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。這種方法是根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的目的。梯度液在離心過程中以及離心完畢后，取樣時(shí)起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免因機(jī)械振動(dòng)而引起已分層的粒子再混合。此法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒（20%的沉降系數(shù)差或更大）或相對(duì)分子質(zhì)量相差3倍的蛋白質(zhì)。大小相同，密度不同的顆粒（如線粒體，溶酶體等）不能用此法分離。.離心管先裝在密度梯度介質(zhì)溶液，樣品液加在梯度介質(zhì)的液面上，離心時(shí)，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時(shí)間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶會(huì)越靠近離心管底。.由ρP＞ρm可知S＞0，因此該離心法的離心時(shí)間要嚴(yán)格控制，既有足夠的時(shí)間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶，又要控制在任一粒子達(dá)到離心管底之前。如果離心時(shí)間過長(zhǎng)，所有的樣品可全部到達(dá)離心管底部；離心時(shí)間不足，樣品還沒有分離。離心必須在沉降最快的大顆粒到達(dá)管底前結(jié)束，樣品顆粒的密度要大于梯度介質(zhì)的密度。梯度介質(zhì)通常用蔗糖溶液，其最大密度和濃度可達(dá)1.28kg/cm3和60％。此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是用于分離大小相異而密度相似的物質(zhì)。.3.等密度離心：

密度梯度液包含了被