毛細管電泳-課件

第20章毛細管電泳法

(CapillaryElectrophoresisCE)概述20.1CE的基本原理20.2

CE的分離模式20.3毛細管電泳儀20.4CE在醫(yī)藥中的應(yīng)用進展概述

電泳：溶液中的帶電粒子（離子、膠?；蚍肿樱┰陔妶鲋械亩ㄏ蜻w移現(xiàn)象。物理化學(xué)現(xiàn)象。毛細管電泳（又稱高效毛細管電泳）（HPCE），是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型電泳分離技術(shù)。包含電泳、色譜及其交叉內(nèi)容。電泳法（electrophoresis）以電泳為基礎(chǔ)的分離分析方法。電泳法的發(fā)展史(Phylogeny)：電泳現(xiàn)象早在18世紀就被發(fā)現(xiàn)。1909年，L.Michaelis提出“電泳(electrophoresis)”這一術(shù)語，他的實驗是用于測定蛋白質(zhì)的等電點。1937年，瑞典科學(xué)家A.Tiselius成功研制出界面電泳儀，并建立了移動界面電泳法，用于人血清蛋白的分離。Tiselius于48年獲諾貝爾化學(xué)獎。花絮1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白；發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定；第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀；1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎；1.經(jīng)典電泳技術(shù)利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。經(jīng)典電泳法自由界面電泳（無載體電泳）區(qū)帶電泳（有載體支持電泳）界面電泳：在沒有惰性支持物的液體接界面上進行的電泳。缺點：對流較嚴重，組分不能完全分離，檢測困難區(qū)帶電泳：是在溶液中加入一些惰性物質(zhì)或凝膠物質(zhì)作為支持物，泳動物質(zhì)在支持物間隙中移動的電泳方法。避免對流的干擾。紙電泳醋酸纖維素電泳淀粉凝膠電泳瓊脂糖電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳常壓電泳：電位梯度50V/cm高壓電泳：電位梯度50V/cm影響因素：電荷效應(yīng)溶液pH值離子強度和溫度電滲載體性質(zhì)和分子篩電泳速度電場強度V/L(V/m)電泳速率

傳統(tǒng)電泳的缺陷：

（1）焦耳熱效應(yīng)：電流通過電泳介質(zhì)而產(chǎn)生的熱效應(yīng)。

使電泳分離介質(zhì)溫度分布不均勻，引起溶液對流，從而導(dǎo)致區(qū)帶展寬，降低分離效率。焦耳熱效應(yīng)隨電場強度的增大而迅速加劇，限制了高電壓的使用。

（2）無法在線檢測，定量精度較差。2.高效毛細管電泳技術(shù)1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑的石英毛細管電泳分離了丹?；被幔Ц哌_40萬/m，使電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)——高效毛細管電泳。毛細管電泳：使電泳過程在散熱效率極高的毛細管內(nèi)進行，使焦耳熱效應(yīng)減小，能使用高電壓，全面改善分離質(zhì)量和提高分析速度?？傊?，與經(jīng)典電泳法比較，毛細管電泳法的特點有四個：高效、快速、微量和自動化。毛細管的使用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，可以使用很高的電壓。電壓升高，電場推動力大，又可進一步使柱內(nèi)徑變小，柱長增加，理論塔板數(shù)高達幾十萬塊/米，特殊柱子可以達到數(shù)百萬。高效毛細管電泳在技術(shù)上采取了三項重要改進：

一、采用了50m內(nèi)徑的毛細管；二、采用了高達數(shù)千伏的高電壓；

三、實現(xiàn)了高靈敏度的在線檢測。1981年，Jorgenson．和Lukacs使用75μm內(nèi)徑的熔融石英毛細管，電泳分離氨基酸和肽，成為高效毛細管電泳劃時代的里程碑。至此，出現(xiàn)了毛細管電泳技術(shù)。80年代以來，誕生了很多新的毛細管電泳方法，如毛細管凝膠電泳和毛細管等電聚焦電泳。88年商品化HPCE問世，高靈敏度柱上檢測器的發(fā)展使HPCE在世界范圍內(nèi)蓬勃開展。HPCE已成為電泳領(lǐng)域發(fā)展最快的新分支。毛細管電泳的發(fā)展高效毛細管電泳法與高效液相色譜法比較（1）分離過程：相同

HPCE與HPLC都是一種液相分離分析技術(shù)。都是差速遷移過程，可用相同的理論來描述,如保留值、塔板理論和速率理論等。（2）分離原理：不同（驅(qū)動力不同）

HPCE：帶電粒子在電場中發(fā)生定向移動，依據(jù)粒子所帶電荷數(shù)、形狀、離解度等不同所產(chǎn)生的差速遷移而分離。

HPLC：不同組分在兩相中的分配系數(shù)不同而分離。（4）應(yīng)用：二者相互補充

HPCE在生物大分子分離方面，在分析速度和效率、樣品和試劑用量方面有優(yōu)勢，但在樣品制備和定性、定量重復(fù)性等方面不及HPLC。（3）儀器流程：基本相同

都包括進樣裝置、分離柱、檢測器和數(shù)據(jù)記錄處理等部分。1.分離模式多：2.分析速度快、分離效率高

在3.1min內(nèi)分離36種無機及有機陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子；

分離柱效：105～107/m理論塔板數(shù)；3.操作方便、消耗少

進樣量極少（納升），水介質(zhì)中進行；4.儀器簡單、易自動化

電源、毛細管、檢測器、溶液瓶5.應(yīng)用范圍極廣

有機物、無機物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護、材料等；

小結(jié)：高效毛細管電泳法的特點

（多、快、好、省）20.1毛細管電泳的基本原理一、電泳和電泳淌度二、電滲和電滲率三、表觀淌度四、分離效率和譜帶展寬五、分離度－介質(zhì)的介電常數(shù)－介質(zhì)的粘度i－粒子的Zeta電勢,近似正比于Z/M2/3Z為凈電荷，M為摩爾質(zhì)量。電泳的速度uep可表示為：ep—電泳淌度，單位電場下的電泳速度。空心毛細管柱中一個粒子的淌度近似表示為：一、電泳和電泳淌度與介質(zhì)性質(zhì)有關(guān)與粒子性質(zhì)有關(guān)：表面電荷和粒子質(zhì)量的大小有效淌度：在實際溶液中，考慮離子活度系數(shù)、溶質(zhì)分子的離解程度均對粒子的淌度有影響，這時的淌度稱為有效淌度。i

—樣品分子的第i級電離度i

—活度系數(shù)或其它平衡離解度總之，粒子的遷移速度除與電場強度和介質(zhì)的特性有關(guān)外，還與粒子的離解度、電荷數(shù)及其大小和形狀有關(guān)。不同的帶電粒子電泳速度不同，可以實現(xiàn)分離二、電滲和電滲率電滲（electroosmotic）

：在電場作用下，液體相對帶電的固體支持介質(zhì)移動的現(xiàn)象，又稱電滲（流）EOF。石英毛細管表面含有許多硅醇基（Si—OH），在一定的條件下可離解使表面帶有負電荷。毛細管中的電滲流的形成雙電層抗衡離子機理：當(dāng)在毛細管兩端加有電場時，雙電層內(nèi)靠近管壁的稠密層中可遷移陽離子向陰極移動。由于離子是被水化的，因此，帶動管中的液體也隨遷移著一起勻速向陰極移動，形成電滲流?？傊?，毛細管中的電滲流是毛細管內(nèi)壁表面電荷所引起的管內(nèi)液體的整體流動。電滲流的特點：具有一定流型，其電滲驅(qū)動力沿毛細管均勻分布，所以電滲速度的徑向分布幾乎是均勻的。eo—電滲率，單位電場下的電滲流的線速度－介質(zhì)的介電常數(shù)－介質(zhì)的粘度－管壁的Zeta電勢，即雙電層到管壁很近的地方之間的電位差。總之，Zeta電勢越大，介電常數(shù)越大，粘度越小，電滲流越大。在電場作用下，電泳和電滲同時存在，電滲流速度是電泳的57倍。電滲的速度可以表示為：硅醇基陰離子石英毛細管柱內(nèi)壁的雙電層結(jié)構(gòu)圖雙電層電勢表面電勢0Stern電勢d電動電勢雙電層模型電滲流的控制：電滲流是毛細管電泳的基本操作要素，為了優(yōu)化分離，有必要對它進行控制。電滲流的控制要求對毛細管表面及緩沖液的粘度進行調(diào)節(jié)。（1）電場強度（2）緩沖溶液的pH（影響管壁帶電情況）（3）緩沖溶液的濃度和離子強度（影響Zeta電勢）三、表觀淌度在毛細管電泳中同時存在電泳流和電滲流，所以帶電粒子在電場中的遷移速度由兩者同時決定，可表示為：uap—表觀遷移速度ap—表觀淌度注：一般情況下，uos>uef中性分子陽離子陰離子電滲流四、分離效率和譜帶展寬1.柱效參數(shù)－理論塔板數(shù)和塔板高度理論塔板數(shù)：塔板高度：Ld——進樣口到檢測器之間的距離tm

—遷移時間，W1/2

—時間半峰寬影響柱效的因素：（1）n與E成正比，E越大，柱效越高。（2）n與溶質(zhì)的擴散系數(shù)（D）

成反比，D越小的分子柱效越高。毛細管電泳的速率方程：理論塔板數(shù)：溶質(zhì)的擴散系數(shù)只有縱向擴散項2.引起帶展寬的因素電滲的流型：呈塞狀扁平流型扁平流型是毛細管電泳獲得高分離度的重要原因之一，是理想狀態(tài)。（1）擴散擴散系數(shù)由溶質(zhì)本身的性質(zhì)決定，隨分子量的增加而降低。分子越大，D越小。因此，毛細管電泳特別適合分離生物大分子。另外，凡是能影響溶質(zhì)擴散的因素都會影響譜帶寬度。（2）自熱（焦耳熱）焦耳熱通過毛細管壁向周圍環(huán)境散逸時，在毛細管內(nèi)形成徑向溫度梯度（管壁溫度管軸心溫度）表：毛細管壁溫度和中心到壁的溫差

徑向溫度梯度導(dǎo)致緩沖溶液的徑向粘度梯度，引起電泳淌度改變，導(dǎo)致離子遷移速度的徑向不均勻分布，破壞了區(qū)帶的扁平流輪廓，導(dǎo)致區(qū)帶展寬，柱效降低。焦耳熱和溫度梯度的控制焦耳熱的大小與毛細管尺寸、緩沖液電導(dǎo)及電場強度有關(guān)。操作電壓：電壓越高，焦耳熱越嚴重。柱內(nèi)徑：是影響焦耳熱的一個重要因素。內(nèi)徑越小，焦耳熱的影響越小。通常毛細管電泳采用盡可能小的柱內(nèi)徑。緩沖溶液的濃度：濃度增加，焦耳熱增加。目前常采用內(nèi)徑為25～75m的毛細管柱采用外管壁涂層技術(shù)。Knox方程：Edc1/3＜1500E—電場強度，d—管內(nèi)徑，c—介質(zhì)濃度滿足上式方程，自熱影響較小。當(dāng)E=50kV/m,c=0.01mol/L時，d＜140μm即能滿足上述方程。(3)吸附毛細管電泳中的吸附作用主要指毛細管管壁對被分離物質(zhì)粒子的作用。主要原因：陽離子溶質(zhì)和帶負電的管壁離子相互作用；疏水作用。吸附作用與毛細管表面積與體積之比有關(guān)。內(nèi)徑越細，吸附越嚴重。五、分離度分離度：將淌度相近的組分分開的能力。n

—理論塔板數(shù)

Δu/u

—兩組分的相對遷移速度差定義式：根據(jù)Gidding方程，分辨率R定義為：對上面的公式處理，可得：由公式可見：R并非隨操作電壓線性增加，而是與操作電壓的平方根成正比。

操作電壓的增加受到焦耳熱的限制。20.2毛細管電泳的分離模式一、毛細管電泳的分類二、毛細管區(qū)帶電泳法三、膠束電動毛細管色譜四、凝膠毛細管電泳法五、毛細管電色譜法一、毛細管電泳的分類按分離模式可分為三大類電泳型毛細管區(qū)帶電泳毛細管凝膠電泳毛細管等電聚焦電泳色譜型毛細管電色譜膠束電動毛細管色譜微乳液電動毛細管色譜電泳/色譜型√√二、毛細管區(qū)帶電泳法

（CapillaryZoneElectrophorsis,CZE）毛細管區(qū)帶電泳（又稱毛細管自由溶液區(qū)帶電泳法）是毛細管電泳中最簡單、最基本、使用最廣泛的一種技術(shù)。CZE的理論是其它CE方法的理論模板。中性分子陽離子陰離子1.分離機理

在只填充緩沖溶液的毛細管中，不同質(zhì)荷比大小的組分在電場的作用下因淌度不同而進行分離。

在毛細管中，由于電滲流的存在，所有溶質(zhì)都隨電滲流一起向負極遷移。

在CZE中可以實現(xiàn)正負離子（或粒子）的同時分離,中性粒子隨電滲流一起流出毛細管,不能分離（圖譜上是一個峰）

。

組分的檢出順序為：

陽離子（粒子）＞中性粒子＞負離子（粒子）CZE溶質(zhì)的遷移規(guī)律小結(jié)：2.影響CZE遷移速率的因素（操作條件的選擇）

（1）操作電壓操作電壓與毛細管的內(nèi)徑和長度及緩沖溶液濃度（離子強度）有關(guān)。柱長一定時，在一定電壓范圍內(nèi)，操作電壓與粒子的遷移速度呈線性關(guān)系。當(dāng)電壓過高時，線性關(guān)系偏移，主要是由高電壓引起的焦耳熱造成的。電壓的極值范圍隨系統(tǒng)和組成而異。一般為小于30KV。電壓對柱效的影響也是相同的。（2）緩沖溶液的選擇：重要的分離因素CZE緩沖溶液必須符合以下條件：在規(guī)定的pH值范圍內(nèi)應(yīng)有較強的緩沖能量，并維持恒定的pH值。盡可能使用分子體積大、電荷少、淌度低的緩沖鹽。在檢測波長處有較低的吸收度盡可能采用酸性緩沖溶液。吸附和電滲都小。

緩沖溶液的pH：是影響組分離子淌度的最主要因素。

影響管壁電荷多少，影響電滲流的大小和遷移速率

Zeta電位，當(dāng)pH值在47時，對EOF影響最大

影響被分離物質(zhì)的電荷，影響遷移速度和方向。

電離程度：如蛋白質(zhì)，多肽等，荷電狀況：

當(dāng)pHpI,溶質(zhì)帶正凈電，朝陰極泳動，和電滲方向相同，粒子遷移總速度比電滲快；當(dāng)pHpI，溶質(zhì)帶負凈電，移向負極，和電滲方向相反，粒子遷移總速度比電滲慢。

必須比pI高或低一個pH單位。pI±1pH=pI，在等電點pI時,正負解離相等，凈電荷為0；粒子遷移速度和電滲速度相同。復(fù)習(xí)：蛋白質(zhì)的等電點多肽編號計算的電荷計算的等電點pH=2.5pH=4.0pH=11.012.412.02-0.4710.521.411.02-0.7110.131.370.46-0.716.740.410.02-0.956.050.37-0.54-1.953.260.33-1.09-2.953.0表：6個合成小肽的計算電荷和等電點影響進樣過程，特別是采用電動進樣方法。緩沖溶液的種類：

影響離子的遷移和分離緩沖液B4O72-cit3-Ac-PO43-HCO3-電流/AEOF/(10-5cm2/V?s)137.441.2246.547.774.549.0162.049.769.051.8表：不同陰離子鈉鹽緩沖溶液測得的電流和電滲遷移率cit3-－檸檬酸盡可能使用分子體積大、電荷少、淌度低的緩沖鹽。緩沖溶液的濃度

濃度增加，會引起溶液粘度、溶質(zhì)、擴散系數(shù)及Zeta電位等的變化，緩沖溶液濃度的增加對柱效的影響比較復(fù)雜。

在恒定pH值下，濃度增加，（擴散層變薄），電滲率降低，溶質(zhì)的遷移速率下降，遷移時間延長。分離效率提高。濃度的增加，導(dǎo)電的離子數(shù)增加，在相同的電場下毛細管的電流值增加，焦耳熱增加?？傊涸谝欢舛确秶鷥?nèi)，增加緩沖溶液的濃度可以提高柱效和分離度，并可以抑制管壁的吸附作用。常用濃度：10~200mmol/LCZE特點：操作簡單、快速、分離效率高。應(yīng)用廣泛，適用于具有不同淌度的帶電粒子的分離。分子量范圍：從十幾的小分子到幾十萬的生物大分子。

不足：不能分離中性分子！添加劑：改善管壁或溶質(zhì)的理化性質(zhì)，優(yōu)化分離條件。表面活性劑：如SDS、季銨鹽等；有機溶劑，如甲醇、乙腈等；兩性離子，如三甲銨基甲內(nèi)鹽等；金屬鹽，如K2SO4、LiCl等手性試劑，如環(huán)糊精、冠醚、膽汁酸鹽等應(yīng)用實例例1毛細管區(qū)帶電泳分離五種堿性蛋白。例2三種手性藥物的對映體拆分小結(jié)：三、膠束電動（毛細管）色譜

（Micellarelectrokineticchromatography,MEKC

(Micellarelectrokineticcapillarychromatography,MECC）膠束電動色譜：是以膠束為假固定相的一種電動色譜法，是電泳技術(shù)與色譜技術(shù)的結(jié)合，因在毛細管中進行，又稱為膠束電動毛細管色譜。1.膠束的形成和特性表面活性劑：由親水基和疏水基組成。疏水部分為直鏈或支鏈烷烴；親水部分由陽離子、陰離子、兩性離子基團組成。臨界膠束濃度（CMC）：表面活性劑開始聚集形成膠束時的濃度。不同的表面活性劑CMC不同，形成的膠束的形態(tài)也不相同。膠束具有團狀結(jié)構(gòu)，疏水性的鏈端向里，帶電荷的親水端朝向緩沖溶液。具有增溶作用。表：常用的表面活性劑表面活性劑CMC/(mmol/L)聚集數(shù)/n陰離子型十二烷基磺酸鈉（SDS）8.262陽離子型十二烷基三甲基溴化銨（DTAB）十六烷基三甲基溴化銨（C.TAB）141.35078非離子型辛基葡萄糖苷n-十二烷基－－麥芽糖苷Triton-X-100－0.160.24－－140兩性離子型3-[(3-膽甾酰胺丙基)]－二甲基銨-1-丙磺酸內(nèi)鹽810膽酸鹽膽酸去氧膽酸（）牛黃酸膽酸（）14510－152－44－104聚集數(shù)n：形成一個膠束離子所需的分子數(shù)。聚集數(shù)一般在40-140個之間。MECC的分離原理示意圖

膠束準固定相液相載體陽極陰極2.分離機理

把離子型表面活性劑加到緩沖溶液中，使形成離子膠束。膠束在毛細管中起準固定相的作用，使中性溶質(zhì)在流動相（水相）和準固定相（膠束相）中進行分配，由于溶質(zhì)在膠束中有不同的保留能力而產(chǎn)生差速遷移，從而實現(xiàn)分離。說明：（1）

離子型膠束表面帶電荷。在電場作用下也要發(fā)生電泳而移向陽極或陰極，如SDS表面帶負電荷，朝陽極方向泳動，和電滲方向相反。但在大多數(shù)情況下，電滲速度大于膠束的電泳速度，所以膠束實際的移動方向朝向陰極。（2）對于中性分子來說，分離僅受溶質(zhì)進入和離開膠束這一行為的影響。例如：陰離子膠束遷移方向與電滲流相反，溶質(zhì)與膠束的作用力越強，遷移時間越長。溶質(zhì)的疏水性越強，與膠束間的作用力越強，遷移時間越長。

用于MEKC的膠束的基本要求：(1)生成的膠束穩(wěn)定性要好，與溶質(zhì)的締合速度快，減小峰擴散。(2)形成的膠束必須是均勻、透明的溶液，能透過紫外光；紫外檢測(3)膠束的粘度要??；不影響電滲流和分離度(4)表面活性劑的CMC要小，不增大電流在MEKC中控制選擇性的方法（1）使用不同的表面活性劑

SDS可用于大多數(shù)中性溶質(zhì)的分離；強疏水性溶質(zhì)可選用極性強的膠束體系如膽酸鹽；對易被管壁吸附的大分子溶質(zhì)，可選用陽離子膠束；分離離子性溶質(zhì)時，要選擇與溶質(zhì)電荷相反的膠束，才能相互作用進入膠束。（2）緩沖溶液的選擇

緩沖溶液體系的改變可以改變?nèi)苜|(zhì)在兩相間的分配系數(shù)，從而對容量因子和遷移產(chǎn)生影響。流動相的改變包括緩沖溶液種類、成分、pH值和離子強度。pH值不能改變SDS的荷電情況，因此不影響膠束的泳動速度。（3）使用添加劑

（1）手性選擇劑（2）尿素、金屬離子和硼酸鹽（3）有機溶劑，如甲醇、乙腈等，控制溶質(zhì)－膠束之間的相互作用。MECC的特點（與HPLC比較）

（1）能同時分離不帶電的中性分子和荷電粒子，并可用于強疏水性溶質(zhì)的分離。是HPCE應(yīng)用較多和較廣的操作方式。（2）分離效率高，HPLC的柱效為5，00025，000理論塔板數(shù)；MECK的柱效為50，000500，000理論塔板數(shù)。與毛細管GC接近，使分離復(fù)雜混合物成為可能。四、凝膠毛細管電泳法

（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）用凝膠物質(zhì)作為支持物進行電泳的方式，稱為凝膠電泳。平板凝膠電泳毛細管凝膠電泳：在毛細管內(nèi)充有凝膠或其它篩分介質(zhì)（凝膠柱），流經(jīng)凝膠的物質(zhì)，原則上按分子的大小分離。凝膠介質(zhì)：是一種固態(tài)膠體分散體系，由網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和共聚其中的溶劑所組成。凝膠物質(zhì)具有多孔性，有一種類似分子篩的作用。通過它的物質(zhì)會按分子的大小逐一被分離開。凝膠無機凝膠：多孔硅膠、多孔玻璃有機凝膠：葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）纖維素衍生物特點：柱效高凝膠粘度大，抗對流，可減小溶質(zhì)擴散；可采用短柱分離溶質(zhì)與凝膠（或添加劑）可生成絡(luò)合物，使分離度增加，防止溶質(zhì)在管壁的吸附并減小電滲流。和常規(guī)的SDS相同，毛細管SDS可提供豐富的分子量信息，具有更好的定性分析性能。樣品用量少，可以實現(xiàn)自動化，可用于大分子物質(zhì)的微制備和餾分收集。缺點：柱制備較困難，壽命偏短。應(yīng)用：CGE在分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)上有十分廣泛的應(yīng)用。在分子生物學(xué)上實現(xiàn)了包括寡聚核苷酸純化、反應(yīng)基因治療、DNA測序和PCR產(chǎn)物的分析。在蛋白質(zhì)化學(xué)方面用于多肽和蛋白質(zhì)的分子測量，原蛋白和SDS結(jié)合蛋白的分離等。用于其它帶電物質(zhì)的分離，并可通過加入添加劑改變分離的選擇性。如手性添加劑、離子對試劑、絡(luò)合試劑改變

CEC是毛細管電泳法技術(shù)和HPLC理論基礎(chǔ)結(jié)合的產(chǎn)物，是最新的HPLC方法。1981年出現(xiàn)，90年代才開始發(fā)展。它快速、經(jīng)濟、應(yīng)用廣，是最有前途的分析方法。五、毛細管電色譜法（CapillaryElectrochromatography,CEC）分離機理:CEC是在空管CZE中填充或涂布色譜固定相，依靠色譜和電場兩種作用力，依據(jù)樣品組分的分配系數(shù)和電泳速度的差別而分離。柱效可達106片/米。CEC介質(zhì)的選擇首先是固定相的選擇，其次是流動相或緩沖溶液的選擇反相CEC：

固定相：C18或C8，

流動相：乙腈－水或甲醇－水改變流動相的組成比例，導(dǎo)電大小、pH、散熱能力、吸收背景等來改善分離。

關(guān)鍵技術(shù)：毛細管柱的填充。等電聚焦毛細管電泳法

（capillaryiso-electricfocusing，CIEF）1.分離機理類似蛋白質(zhì)的分子，其荷電狀況使介質(zhì)的pH而定，在其等電點（pI）時，蛋白質(zhì)分子表現(xiàn)為零電荷。不同的蛋白質(zhì)有不同的pI值。當(dāng)處于pH＝pI的介質(zhì)中時，其遷移就停止。如果介質(zhì)的pH值是位置函數(shù)（pH值的位置梯度），就可以使具有不同pI的分子聚焦在不同的位置上不做遷移而被分離。這就是等電聚焦的分離過程。CIEF是在毛細管中進行的等電聚焦。特點：具有極高的分辨率，可以分離

pI0.01pH單位的兩種蛋白質(zhì)。pH值的位置梯度由兩性電解質(zhì)混合物作為載體電解質(zhì)。運行三步：進樣、聚焦、遷移關(guān)鍵：減小電滲流找到使分離區(qū)帶遷移的辦法。高效毛細管電泳儀的主要組成：高壓電源；緩沖液池(樣品池）；毛細管柱；鉑電極；檢測器；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，（恒溫系統(tǒng)）20.3HPCE儀器的基本結(jié)構(gòu)一般流程：預(yù)平衡、進樣、分離、檢測和數(shù)據(jù)處理高效毛細管電泳儀實圖高壓電源：采用（0±30）kV連續(xù)可調(diào)的直流高壓電源，電壓輸出精度應(yīng)高于0.1％。

高壓電源應(yīng)能夠切換極性。電極：兩個相同的直徑0.51mm的鉑絲制成，可用注射器針套代替鉑絲。一般一端為高壓電極，一端接地。注意！高壓電的安全保護問題

措施：注意保持干燥、隔離或適當(dāng)降低分離電壓。一、高壓電源二、毛細管柱管材要求：化學(xué)和電惰性，能透過紫外和可見光，有一定的韌性，易于彎曲，耐用而且便宜。常用管材：聚四氟乙烯：能透過紫外光，柱均勻性差。玻璃：電滲最強，雜質(zhì)含量較高石英：柱參數(shù)：內(nèi)徑：25

75m

柱長：<70cm管壁的厚度：石英本身：涂在外測的聚酰亞胺：幾個m

細柱子的最大優(yōu)點：（1）減小電流，因此能減少自熱（焦耳熱）。（2）增大散熱面積（側(cè)面積/截面積），因而能加快散熱，減小徑向擴散，保持電滲流型為扁平型，提高柱效。厚壁（375m）薄壁（150m）用石英毛細管作電泳分離時，會遇到兩種現(xiàn)象（1）電滲：適當(dāng)控制（分離大分子蛋白）（2）吸附：予以消除

消除吸附方法：毛細管壁改性是限制溶質(zhì)吸附的一種有效手段管壁靜態(tài)改性：在管壁涂漬親水聚合物可以減少電滲同時減少吸附。管壁動態(tài)改性：改變緩沖溶液和加入添加劑對CE進樣技術(shù)的要求：進樣時不能引入顯著的區(qū)帶擴張，以確保系統(tǒng)的高效。進樣區(qū)帶寬度大體是柱長的1％2％。樣品量必須<100nl，否則易造成過載。三、CE的進樣技術(shù)直接柱頭進樣的進樣方式電動進樣（電遷移進樣）氣動進樣（壓力進樣）擴散進樣：濃差擴散原理毛細管的陽極端（假設(shè)電滲流向接地端移動），先不與緩沖溶液接觸，而直接置于樣品溶液中，然后在很短的時間內(nèi)施加進樣電壓（為分離時操作電壓的1/5或1/3），使樣品通過電遷移進入毛細管。1.電動進樣（也稱電遷移進樣）通過改變進樣電壓和進樣時間控制樣品的進樣量。一定時間t進樣的量Q（g或mol）可以用下列公式計算：ep—組分的電泳淌度os—組分的電滲率V—外加電壓r—毛細管內(nèi)徑c—組分的濃度t—進樣時間L—毛細管的總長度特點：進樣裝置簡單，不需要附加設(shè)備，在介質(zhì)粘度很高時使用更加有利。是凝膠電泳進樣的唯一方式?？捎糜诤哿扛患?。其突出的特點為實際的進樣量與組分的表觀淌度有關(guān)。存在“歧視效應(yīng)”，即電泳淌度大的組分進樣量大，反之則小。三種辦法：（a）在進樣端加壓（b）在出口端減壓（c）調(diào)節(jié)進樣槽和出口槽之間的相對高度使之產(chǎn)生虹吸現(xiàn)象。2.氣動進樣（壓差進樣）:最常用的進樣方法特點：不存在“歧視效應(yīng)”，進樣量不受樣品基質(zhì)的影響，應(yīng)用最廣泛。進樣體積可通過Hagen-Poiseuille方程求出?！鱌—毛細管兩端的壓力差d—毛細管的內(nèi)徑t—進樣時間

η—緩沖溶液的粘度L—毛細管的總長度進樣的重現(xiàn)性優(yōu)于1%～2%RSD！進樣量是通過毛細管截面的壓差、樣品組分的濃度、毛細管的尺寸、緩沖溶液的粘度和進樣時間的函數(shù)。與樣品的淌度無關(guān)。緩沖溶液池：小玻璃瓶或聚四氟乙烯塑料瓶（15ml）帶螺帽的，要便于密封。四、CE的檢測器CE對檢測器的要求：既能作靈敏檢測，又不使譜帶展寬。（死體積小）一般采用柱上檢測。CE檢測器方法紫外可見光檢測器二極管陣列檢測器熒光檢測器（激光誘導(dǎo)熒光）電化學(xué)檢測器質(zhì)譜檢測器其他電導(dǎo)檢測法安培檢測法電位檢測法1.紫外－可見檢測器：最常用除去保護層特點：通用性好，特別是對蛋白質(zhì)的適用很強。類型：固定波長可變波長DAD

A=Ecl增加光程，提高檢測靈敏度特點：（1）多波長信號檢測（2）峰純度的確定（3）峰的定性確證（4）未分離的峰的定量：峰消除或信號扣除的方法2.二極管陣列檢測器消色差透鏡把光聚焦在毛細管上，透過光束被一個衍射光柵色散到光二極管陣列上（211個）?？色@得時間－波長－吸光值三維電泳圖。3.激光誘導(dǎo)熒光檢測器：靈敏度最高優(yōu)點：激光光強度大，單色性、相干性好；聚焦性能好，易于校準并減小光的散射；可以使用更小孔徑毛細管；靈敏度高，檢測限達，可實現(xiàn)單細胞檢測。缺點：通用性差，適合DNA檢測，樣品需要衍生化。檢測方法：把一束激光發(fā)出的輻射通過短聚焦透鏡或顯微物鏡聚焦到毛細管壁上，通過一個棱鏡系統(tǒng)或者（顯微物鏡（光導(dǎo)纖維）將產(chǎn)生的熒光收集到一個和激發(fā)光束成90度的位置上。分離熒光和反射光采用前照明顯微鏡結(jié)構(gòu)，通過同一物鏡收集熒光發(fā)射，提高熒光的收集效率，減小背景干擾。激光誘導(dǎo)熒光顯微鏡檢測系統(tǒng)可實現(xiàn)分子水平級檢測！消除樣品、毛細管管壁界面產(chǎn)生的散射光，以減小背景信號的產(chǎn)生。比普通在柱檢測靈敏度高4個數(shù)量級，質(zhì)量檢測可達幾個分子級。激光誘導(dǎo)熒光柱后鞘流池檢測系統(tǒng)鞘流的成分與毛細管緩沖液相同5.電化學(xué)檢測器：具有氧化－還原性質(zhì)的物質(zhì)電勢檢測器（EPD）安培檢測器（AED）柱后ECD柱上ECD柱頭ECD抑制ECD柱后EPD柱上EPD4.電導(dǎo)檢測器（ECD）：無機離子和較小有機離子檢測Ag/AgCl參比電極飽和甘汞電極參比電極6.質(zhì)譜檢測器：聯(lián)用技術(shù)電噴射離子式質(zhì)譜：由于可以確定105道爾頓的分子，對蛋白質(zhì)的鑒別特別有用，被視為與毛細管電泳聯(lián)用的首選儀器。接口技術(shù)：毛細管端部的電場強度約為4kV，對立電極的電場強度約為1kV。從毛細管里出來的樣品溶液被驅(qū)散后進入一個有高電荷微滴的噴霧器中，這就是所謂的電噴霧。檢測器檢測限（mol/L）特點UV-vis10-5~10-6近似通用，常規(guī)應(yīng)用Fluorescence10-7~10-9靈敏度高，樣品通常需要衍生化LaserinducedF10-14~10-16高靈敏度，價格昂貴安培10-10~10-11有選擇性，靈敏度高電導(dǎo)10-5~10-7通用性好，需專用設(shè)備質(zhì)譜10-7~10-9儀器復(fù)雜，可獲得結(jié)構(gòu)信息間接法為直接檢測的1/10或1/100表：毛細管電泳檢測器性能

典型的實驗步驟：（1）將運行緩沖液充滿毛細管；（2）移去進樣端緩沖液池，用樣品池代替；（3）用電動或壓力進樣方式進樣；（4）將進樣端緩沖溶液放回；（5）毛細管兩端加操作電壓進行電泳分離；（6）分離樣品遷移至檢測窗檢測，記錄數(shù)據(jù)和處理。一般流程：預(yù)平衡、進樣、分離、檢測和數(shù)據(jù)處理五、定性定量分析1.定性分析采用遷移時間或淌度為定性參數(shù)。使用淌度的重現(xiàn)性更好。影響因素原因/結(jié)果解決辦法溫度變化改變粘度和電滲流恒溫毛細管毛細管壁吸附改變電滲流清洗毛細管管壁的滯后效應(yīng)在使用低（高）pH值緩沖液時，用高（低）pH值緩沖液洗毛細管避免用與緩沖液相pH值差大的溶液清洗毛細管、延長平衡時間緩沖液組成變化由電解引起的pH值變化更換緩沖液緩沖液液面不水平引起不重現(xiàn)的層流保持兩緩沖液液面水平不用進樣端緩沖液沖洗毛細管石英管批號不同，含硅醇基不同管壁電荷不同，電滲流變化測量電滲流操作電壓變化與遷移時間變化成正比表：影響遷移時間重現(xiàn)性的因素2.定量分析峰高或峰面積為定量參數(shù)。峰面積更準確。峰面積的重現(xiàn)性對定量分析是關(guān)鍵。一般在好的操作條件下，峰面積的RSD2％。影響因素原因/結(jié)果解決辦法溫度變化改變粘度和進樣量毛細管恒溫樣品蒸發(fā)增加樣品濃度加蓋或冷卻自動進樣器樣品過載額外進樣使用進樣端平滑的毛細管毛細管插入樣品引起零進樣額外進樣不能消除，但能量化。管壁吸附樣品峰形畸變無樣品流出改變緩沖液pH值和增加濃度使用添加劑低信噪比積分誤差優(yōu)化積分參數(shù)，增加樣品濃度、用峰高測定電動進樣樣品基質(zhì)不同用壓力進樣表：影響峰面積重現(xiàn)性的因素定量方法：內(nèi)標法復(fù)習(xí)：內(nèi)標法定量，定量準確。適合小進樣量，進樣重復(fù)性差的方法。方法學(xué)驗證：準確度精密度線性范圍專屬性近年來毛細管電泳在藥物分析中的應(yīng)用得到了迅速發(fā)展，在中藥材、中成藥制劑、西藥復(fù)方制劑及生物技術(shù)產(chǎn)品等藥物和制劑的分離、鑒定和分析中，顯示了高效、快速的特點，正越來越受到重視。20.4CE在藥學(xué)中的應(yīng)用一、多肽和蛋白質(zhì)類藥物二、中藥及中藥復(fù)方制劑三、化學(xué)藥物及其復(fù)方制劑四、抗生素類藥物五、體內(nèi)藥物及代謝分析六、電泳指紋圖譜CE用于中成藥分析時，除分離柱效高和分析時間短外，由于毛細管柱容易清洗、不易產(chǎn)生柱污染，因此可以用于如蜜丸等中藥制劑的分析，在樣品前處理時也比HPLC法簡單。對分析成分復(fù)雜的中藥復(fù)方制劑具有很大的優(yōu)越性。二、中藥及中藥復(fù)方制劑應(yīng)用范圍：生物堿、黃酮及其苷、各種苷類、香豆素類、酚酸類等。方法：CZE和MECC為主生物堿是植物中一類重要的化學(xué)成分，在植物中分布較廣。已知的生物堿約3000以上。生物堿類能解離帶正電荷，可采用CZE分離模式。植物中的生物堿結(jié)構(gòu)極為相似，有時pKa差值很小，除可根據(jù)pKa值不同選擇緩沖溶液pH值外，還可適當(dāng)增加一些添加劑以增加選擇性和分離度。1.生物堿

例1：黃連成藥中7種小檗堿生物堿的CZE分離分離條件：柱：57cm×75m分離電壓：14kV檢測波長：254nm低壓進樣：2s柱溫：30℃電泳緩沖液：50mmol/LNaH2PO4-甲醇（65：35）緩沖溶液：磷酸二氫鈉毛細管：6075m例2：CZE同時分離17種堿性藥物毛細管電泳法用于中藥及生物樣品分析的優(yōu)點

（1）它具有柱效高、進樣體積小等特點。

（２）抗污染能力強。分析中藥樣品時，前處理簡單，甚至于勿需前處理。醫(yī)學(xué)診斷、藥理研究的血、尿樣等。

（３）分析運行成本低。

（４）特征性強。

例如:用CE分析冬蟲夏草獲44個峰，很易區(qū)別蛹蟲草、人工培養(yǎng)品、偽品、次品等。而用HPLC法只能獲得十幾個色譜峰例３

冬蟲夏草的毛細管區(qū)帶電泳分析冬蟲夏草為麥角科植物冬蟲夏草菌的子座及其寄主蟲草蝙蝠蛾的幼蟲尸體的復(fù)合體。子座出自寄生主幼蟲的頭部。主產(chǎn)地四川、青海、云南、貴州等。主要成分

除脂肪、蛋白外,含不飽和脂肪酸、蟲草酸、蟲草素（核苷類）等。子座（夏草菌）

蟲體(蟲草蝙蝠蛾）各種蟲草的毛細管電泳對比圖冬蟲夏草的子座冬蟲夏草的蟲體冬蟲夏草亞香棒蟲草蛹蟲草子座手性對映體的存在是自然界的普遍現(xiàn)象，在有機化學(xué)、藥物化學(xué)和生物化學(xué)等領(lǐng)域尤其突出。以藥物為例，大約有50％的藥物是手性的。臨床應(yīng)用的手性藥物，除天然和半合成藥物外，人工合成的含手性藥物仍以外消旋體供藥為主。在外消旋體藥物中各對映體的藥理活性通常具有較大差異。1.手性藥物的分離三、化學(xué)藥物及其復(fù)方制劑（1）治療作用完全依賴一種異構(gòu)體。（2）藥理作用的差別不大，定性、定量都相近。（3）藥理作用的特性相似，但反應(yīng)強度有明顯差別。（4）藥理及（或）毒理作用存在質(zhì)的差別。

例如：R-反應(yīng)停是安眠藥，S-式致胎兒畸形；

對映體的藥效學(xué)差別，將對合理用藥與新藥開發(fā)產(chǎn)生重要影響。純異構(gòu)體將可發(fā)展成為副作用較小的新藥。對映體的藥效學(xué)差異，在質(zhì)與量上都因藥而異，可歸納為四類：對映體的拆分方法：非色譜類方法：根據(jù)物理化學(xué)性質(zhì)差別色譜法：已成為對映體拆分的一個主要工具，包括所有的色譜方法（TCL,GC，HPLC，超臨界流體色譜法，電泳法）。HPLC拆分法：（引入不對稱中心）間接法：與手性試劑在柱前衍生，形成一非對映異構(gòu)體對直接法：使用手性固定相或手性流動相拆分的方法。藥物拆分的主要用途：（1）生物體液中藥物對映體的分離分析，各對映體的藥物動力學(xué)及體內(nèi)處置過程；（2）藥物對映體的制備，給實驗室和臨床提供純的對映體，以進行單個對映體的藥理學(xué)評價。（3）藥物對映體的質(zhì)量控制分析。手性分離基本策略手性藥物在拆分前的對映體通常以鏡像存在或以外消旋體的形式存在。用常規(guī)分析和制備方法不能將其拆分，需要引入不對稱（即手性）環(huán)境。不管是哪一種色譜法，其基本原理大多數(shù)是基于把對映體的混合物轉(zhuǎn)化成非對映體，然后利用它們在物理化學(xué)性質(zhì)上的差異使之分開。為了使對映體轉(zhuǎn)化為化學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)不同的非對映體，多宜提供一種手性源，使欲拆分的對映體（樣品）、手性作用物（比如固定相）和手性源之間形成一個非對映異構(gòu)分子的絡(luò)合物。用CE拆分對映體的策略：一是手性消除：與手性試劑進行化學(xué)反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成非對映異構(gòu)體，用普通的CE方法分析。一般采用柱前反應(yīng)的方法，產(chǎn)物的手性可能不能恢復(fù)。二是構(gòu)建手性環(huán)境：使用手性添加劑、使用手性填充毛細管柱和使用手性涂層毛細管柱。常用的手性選擇劑有：環(huán)糊精、冠醚、膽酸鹽、手性混合膠束、手性選擇性金屬絡(luò)合物、蛋白糖等7類型。目前應(yīng)用最多的是以環(huán)糊精為手性選擇劑的毛細管區(qū)帶電泳。β-環(huán)糊精（β-CD）：是7個－(D)吡喃型葡萄糖單體以1，4－脫水縮合聯(lián)結(jié)而成的環(huán)狀分子。該分子結(jié)構(gòu)中所含環(huán)狀空腔具有手性識別能力，能以包結(jié)的方式與對映體分子形成非對映體主客體復(fù)合物，從而在色譜過程中造成滯留的差異，達到分離的目的。環(huán)糊精常用的修飾方法之一，是用烷基、羥烷基、?；热〈揎棪?環(huán)糊精(β-CD)中的羥基[5,6],以改變CD的空腔尺寸,增加手性分子與β-CD之間的相互作用,提高β-CD的手性識別和拆分能力。內(nèi)部疏水，外部親水手性CE和手性HPLC相比的優(yōu)點：避免了HPLC需要將大量手性試劑加入流動相中，或使用昂貴的特殊固定相的缺點；CE使用的毛細管價格較低，使用溶劑僅需幾毫升，樣品量極微。CE在準確度、精密度、檢測限、線性范圍及重現(xiàn)性等方面均已達到甚至超過了HPLC。HPCE法：對開發(fā)中的新藥的對映體的分離和生物體內(nèi)藥物代謝過程中對映體的分離，CE更有其獨特的優(yōu)點。例1：CD-CZE分離腎上腺素等4種胺類化合物的對映體酚乙醇胺腎上腺素異丙腎上腺素多西拉敏分離條件：毛細管柱64.5cm×50m操作電壓：30kV，檢測波長：200nm，柱溫：25，緩沖液為：50mmol/LTris-H3PO4，20mmol/L二甲基--CD(pH=2.4)摘要:以新型環(huán)糊精衍生物單-6-O-苯基胺甲?；?β-CD為手性選擇劑,用毛細管區(qū)帶電泳法成功地分離了β-CD及常用環(huán)糊精衍生物無法拆分的手性藥物山莨菪堿。

考察了手性選擇劑濃度、緩沖液pH值和濃度及有機溶劑對拆分的影響。手性藥物山莨菪堿的毛細管電泳拆分研究2.復(fù)方制劑分析例1：MECC分析復(fù)方感冒制劑中的13種藥物電泳分離條件：毛細管柱60cm×75m操作電壓：18kV，檢測波長：214nm，虹吸進樣（10cm)緩沖液為：20mmol/L硼酸鈉-磷酸二氫鈉0.1mmol/L-膽酸鈉(pH=9.0）中藥的毛細管電泳指紋圖譜研究

孫毓慶，阮婧華，馬欣

(沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽110016)目前，用于中藥指紋圖譜研究的方法分為色譜法和光譜法兩類，