賴氨酸的生產(chǎn)工藝-課件

賴氨酸的生產(chǎn)工藝1、賴氨酸概述(2)賴氨酸廣泛存在于動物蛋白質(zhì)中,賴氨酸的生產(chǎn)最早是用酸水解酪素,經(jīng)分離谷氨酸后制得,其后又從血粉中提取(豬血粉中賴氨酸含量約9%～10%),但這種方法,工藝比較復雜,產(chǎn)量受到限制。1、賴氨酸概述(3)1960年以來,日本用營養(yǎng)缺陷型的谷氨酸菌株直截了當發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸,其產(chǎn)量不斷擴大。1977年,日本東麗公司以合成的己內(nèi)酰胺為原料,用酶法生產(chǎn)L-賴氨酸。1、賴氨酸概述(4)目前,國際上賴氨酸產(chǎn)生菌種的生產(chǎn)水平一般為12～14g/L,對糖的轉(zhuǎn)化率為45%。采納淀粉水解糖(或純糖)發(fā)酵,其產(chǎn)酸率、提取率較高;而采納糖蜜發(fā)酵,其產(chǎn)酸率、提取率要低一些。1、賴氨酸概述(5)采納淀粉水解糖(或純糖)發(fā)酵,其產(chǎn)酸率為9%～11%,提取率為83%～87%,原料消耗3、2～3、5t(淀粉)/t(賴氨酸);而采納糖蜜(含糖50%)發(fā)酵,其產(chǎn)酸率7%～9%,提取率80%～85%,原料消耗6～8t/t。我國廣西賴氨酸廠,采納甘蔗糖蜜發(fā)酵,菌種產(chǎn)酸率8、2%,提取率82、4%,接近國際先進水平。2、賴氨酸的性質(zhì)(1)

賴氨酸鹽酸鹽的化學式為C6H14O2N2·HCl,含氮量為15、34%,相對分子質(zhì)量182、65。由于游離的賴氨酸易吸收空氣中的二氧化碳,故制取結(jié)晶比較困難。一般商品都是賴氨酸鹽酸鹽的形式。2、賴氨酸的性質(zhì)(2)賴氨酸的化學名為2,6-二氨基己酸,具有不對稱的α-碳原子,故有兩種光學活性的異構(gòu)體(L/D型)。2、賴氨酸的性質(zhì)(3)賴氨酸鹽酸鹽熔點為263℃,單斜晶系,比旋光度+21°。在水中的溶解度為0℃時53、6g/100mL,25℃時為89g/100mL,50℃時為111、5g/100mL,70℃時為142、8g/100mL。在酒精中的溶解度為0、1g/100mL。

2、賴氨酸的性質(zhì)(4)賴氨酸含有α-氨基及ε-氨基,只有在ε-氨基為游離狀態(tài)時,才能被動物機體所利用,故具有游離ε-氨基的賴氨酸被稱為有效賴氨酸。故在提取濃縮中,要特別注意防止有效賴氨酸受熱破壞而影響其使用價值。3、賴氨酸生物合成途徑

賴氨酸的生物合成途徑與其他氨基酸不同,依微生物的種類而異。細菌的賴氨酸生物合成途徑需要經(jīng)過二氨基庚二酸(DAP)合成賴氨酸;3、賴氨酸生物合成途徑(續(xù))酵母、霉菌的賴氨酸生物合成途徑,需要經(jīng)過α-氨基己二酸合成賴氨酸。同樣是二氨基庚二酸合成賴氨酸途徑,不同的細菌,賴氨酸的生物合成途徑的調(diào)節(jié)機制有所不同。4賴氨酸的生產(chǎn)發(fā)酵賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)有直截了當(一步)發(fā)酵與兩步發(fā)酵。賴氨酸的直截了當發(fā)酵法可使用黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、諾卡桿菌等,碳源可為葡萄糖、醋酸、乙醇與石蠟。其轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)酸率也有所不同。直截了當發(fā)酵法工藝流程賴氨酸的兩步發(fā)酵法先使用大腸桿菌的賴氨酸缺陷型菌株,因缺少二氨基庚二酸脫羧酶,不能生成賴氨酸,因此積累大量的二氨基庚二酸(DAP)。然后再選用含有二氨基庚二酸脫羧酶的產(chǎn)氣桿菌或大腸桿菌,進行酶法脫羧而生成L-賴氨酸。4、1L-賴氨酸生產(chǎn)菌種及擴大培養(yǎng)直截了當發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸工藝生產(chǎn)菌種:中科院北京微生物研究所選育的北京棒桿菌AS1、563與鈍齒棒桿菌PI-3-2(AECr、Hse-);AEC賴氨酸類似物S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸;Hse天冬氨酰半醛脫氫酶黑龍江輕工研究所選育的241134及179等。L-賴氨酸生產(chǎn)菌種(續(xù))這些菌種產(chǎn)酸水平一般為7～8g/L,轉(zhuǎn)化率25%～35%,對我國賴氨酸的生產(chǎn)起了較大的作用。但產(chǎn)酸率與轉(zhuǎn)化率均較低,與國外先進水平相比還有較大差距。種子擴大培養(yǎng)賴氨酸發(fā)酵一般依照接種量及發(fā)酵罐規(guī)模采納二級或三級種子培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度30-32℃。通風比1:0、2m3/(m3?min),攪拌轉(zhuǎn)速200r/min。培養(yǎng)時間8～11h。依照發(fā)酵規(guī)模,必要時可采納三級培養(yǎng)。4、2賴氨酸發(fā)酵工藝及控制要點

(1)發(fā)酵工藝流程賴氨酸發(fā)酵工藝及控制要點(2)(2)發(fā)酵培養(yǎng)基組成不同菌株,發(fā)酵培養(yǎng)基的組成不完全相同,賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的組成見有關文獻。賴氨酸發(fā)酵工藝及控制要點(3)(3)發(fā)酵工藝條件及影響因素溫度、pH值控制、種齡與接種量、供氧對賴氨酸發(fā)酵的影響、生物素對賴氨酸生物合成的影響、硫酸銨對賴氨酸發(fā)酵的影響。賴氨酸發(fā)酵工藝及控制要點(4)溫度:幼齡菌對溫度敏感,在發(fā)酵前期,提高溫度,生長代謝加快,產(chǎn)酸期提早,但菌體的酶容易失活,菌體衰老,賴氨酸產(chǎn)量少。賴氨酸發(fā)酵,前期控制溫度32℃,中后期30℃。賴氨酸發(fā)酵工藝及控制要點(5)

pH值控制

賴氨酸發(fā)酵最適pH值為6、5～7、0?？刂品秶趐H=6、5～7、5,在整個發(fā)酵過程中,應盡量保持pH值平穩(wěn)。賴氨酸發(fā)酵工藝及控制要點(6)種齡與接種量

一般在采納二級種子擴大培養(yǎng)時,接種量較少,約2%,種齡一般為8～12h,當采納三及種子擴大培養(yǎng)時,種量較大約10%,種齡一般為6～8h?？傊?以對數(shù)生長期的種子為好。賴氨酸發(fā)酵工藝及控制要點(7)供氧對賴氨酸發(fā)酵的影響

賴氨酸是天冬氨酸族氨基酸,它的最大生成量是在供氧充足,細菌呼吸充足條件下實現(xiàn)的。供氧不足,細菌呼吸受抑制,賴氨酸產(chǎn)量降低,供氧不足只是輕微影響賴氨酸生成。嚴重供氧不足時,產(chǎn)賴氨酸量特別少而積累乳酸。賴氨酸發(fā)酵工藝及控制要點(8)生物素對賴氨酸生物合成的影響

在以葡萄糖,丙酮酸為唯一碳源的情況下,添加過量生物素(200～500μg/L),賴氨酸積累量顯著增加。因為生物素量增加,促進了草酰乙酸的合成,增加了天冬氨酸供給。生物素對賴氨酸生物合成的影響(續(xù))另一方面,過量生物素使細胞內(nèi)合成的谷氨酸對谷氨酸脫氫酶起反饋抑制作用,抑制谷氨酸的大量合成,使代謝流轉(zhuǎn)向合成天冬氨酸的方向進行。

賴氨酸發(fā)酵工藝及控制要點(9)硫酸銨對賴氨酸發(fā)酵的影響

硫酸銨對賴氨酸發(fā)酵影響特別大。當硫酸銨含量大時菌體生長迅速,使賴氨酸產(chǎn)量低。但在無其他銨離子情況下,用量為4、0%～4、5%時賴氨酸產(chǎn)量最高。

6、賴氨酸的提取與精制

賴氨酸的提煉過程包括:發(fā)酵液預處理提取精制6、1賴氨酸發(fā)酵液的主要性質(zhì)賴氨酸發(fā)酵液由于所用的原料、培養(yǎng)基組成及濃度、菌種與發(fā)酵工藝不同,其組成也不同,一般由以下四部分組成:氨基酸、菌體、培養(yǎng)基殘留物、(1)氨基酸氨基酸代謝主產(chǎn)物賴氨酸,含量為7~8g/L;少量其他氨基酸,如纈氨酸,丙氨酸與甘氨酸,當發(fā)酵不正常時含有谷氨酸;少量有機酸,特別是發(fā)酵工藝控制不行時,含有乳酸。(2)菌體菌體一般含量在15~20g(干重)/L。(3)培養(yǎng)基殘留物培養(yǎng)基殘留物如殘?zhí)?~20g/L(隨原料不同而異),無機離子(如NH4+、Ca2+、Mg2+、K+與一些陰離子,其中NH4+濃度較高)。(4)色素色素發(fā)酵液中的這些雜質(zhì)對賴氨酸的提取與精制影響特別大,特別是菌體與鈣離子等,應盡量除去。6、2發(fā)酵液的預處理發(fā)酵液的預處理,包括除菌體與影響提取收率的雜質(zhì)離子。去除菌體的方法有離心分離法與添加絮凝劑沉淀兩種方法。離心分離法采納高速離心機分離除去,如菌體體積小時需反復分離,成本高。添加絮凝劑沉淀法是先將發(fā)酵液調(diào)節(jié)到一定的pH值,加適宜絮凝劑如聚丙烯酰胺,使菌體絮凝而沉淀,加助濾劑過濾出去。發(fā)酵液的預處理(3)鈣離子一般通過添加草酸或硫酸,成鈣鹽沉淀而除去。經(jīng)驗證明,發(fā)酵液經(jīng)過預處理后,提取收率明顯提高。6、3賴氨酸的提取

從發(fā)酵液中提取賴氨酸通常有四種方法:

a、沉淀法,利用賴氨酸生成難溶性鹽而沉淀分離,或使賴氨酸結(jié)晶析出;

b、有機溶劑萃取法;

c、離子交換法;

d、電滲析法。賴氨酸的提取(2)工業(yè)生產(chǎn)主要采納離子交換法提取賴氨酸,該法回收率高,產(chǎn)品純度高。賴氨酸是堿性氨基酸,等電點(pI)為9、59。在pH=2、0左右能最大程度地被強酸性陽離子交換樹脂吸附。pH=7、0~9、0被弱酸性陽離子交換樹脂吸附。賴氨酸的提取(3)強酸性陽離子交換樹脂與弱酸性陽離子交換樹脂對純賴氨酸溶液與發(fā)酵液中賴氨酸的吸附量是不同的。賴氨酸的提取(4)弱酸性陽離子交換樹脂對純賴氨酸的吸附能力大,但對發(fā)酵液中的賴氨酸吸附能力大為降低,這是因為發(fā)酵液中除賴氨酸外還有相當多雜質(zhì)影響所致。因此,從發(fā)酵液中提取賴氨酸常選用強酸性陽離子交換樹脂。賴氨酸的提取(5)強酸性陽離子交換樹脂的氫型對賴氨酸的吸附比銨型容易得多。然而銨型強酸性陽離子交換樹脂能選擇性地吸附賴氨酸與其他堿性氨基酸,不吸附中性與酸性氨基酸,故容易與其他氨基酸分離。賴氨酸的提取(6)另外,選用銨型樹脂,能夠簡化樹脂的轉(zhuǎn)型操作,如在用氨水洗脫賴氨酸的同時,樹脂已轉(zhuǎn)成銨型,不必再生。因此從發(fā)酵液中提取賴氨酸均選用銨型強酸性陽離子交換樹脂。賴氨酸提取精制工藝流程

6、4離子交換法提取賴氨酸離子交換法提取賴氨酸可用三柱串聯(lián)的方式,以提高收率。上柱吸附:上柱方式、交換量、上柱流速洗脫劑(氨水洗脫、氨水+氯化銨洗脫、氫氧化鈉洗脫)上柱吸附－上柱方式

上柱方式上柱方式有正上柱與反上柱兩種。假如發(fā)酵液含菌體等固形物較多,流速較快時,容易造成樹脂層堵塞,這是采納反上柱較好。上柱吸附－交換量交換量正向上柱時,一般為每噸樹脂可吸附90~100kg賴氨酸鹽酸鹽,反向上柱可吸附70~80kg賴氨酸鹽酸鹽。流出液pH=5時表明吸附達飽與。上柱吸附－上柱流速上柱流速上柱流速應依照上柱液性質(zhì)、樹脂的性質(zhì)、柱大小及上柱方式等具體情況決定。應在小柱中進行試驗確定適合的上柱流速。一般正向上柱速度大些,能夠10L/min的流速吸附;反上柱流速小些。洗滌上柱后,需用水洗去停留在樹脂的菌體、殘?zhí)堑入s質(zhì),直至洗滌水清亮,同時使樹脂疏松以利洗滌。洗脫劑(1)氨水洗脫優(yōu)點是洗脫液經(jīng)濃縮除氨后,含雜質(zhì)較小,有利于后工序精制;缺點是樹脂吸附的陽離子,如Ca2+、Mg2+等不易洗脫。洗脫劑(續(xù))殘留在樹脂中,隨著操作次數(shù)的增加而積累,造成樹脂吸附氨基酸能力下降。因此在樹脂使用一段時間后需要用酸或食鹽溶液進行再生處理。洗脫劑(2)(2)氨水+氯化銨洗脫特點是能夠洗脫樹脂吸附的Ca2+等陽離子,提高樹脂的交換容量,由于在堿性條件下賴氨酸先被洗脫,然后才有Ca2+等離子被洗脫,采取分段收集可不能導致賴氨酸收集液中Ca2+含量增加。氨水+氯化銨洗脫通過調(diào)節(jié)氨水與氯化銨的物質(zhì)的量之比為1:1,可直截了當使賴氨酸成單鹽酸鹽形式存在,不需在中與。洗脫劑(3)(3)氫氧化鈉洗脫特點是沒有氨味,容易操作,但在洗脫液中Na+含量較高,影響賴氨酸的提純精制。洗脫劑(4)洗脫劑的濃度對洗脫效果有影響。一般來講,為了分離只能用適當濃度的洗脫劑。假如洗脫劑濃度太高,達不到洗脫目的。假如洗脫劑濃度太低,洗脫時間長,收集不集中,賴氨酸濃度低。洗脫劑(5)使用氨水洗脫時,一般濃度為3、6%~5、4%。假如用5％的氨水洗脫,收集液賴氨酸平均濃度可達6%~8%,洗脫高峰段,賴氨酸鹽酸鹽含量與達15%~16%。洗脫劑(6)洗脫操作及洗脫液收集,采納單柱順流洗脫,為了使洗脫集中,賴氨酸濃度高,應控制好洗脫液流速。一般比上柱流速慢些,多用6L/min的速度洗脫,可依照柱的大小而異。洗脫劑(7)用茚三酮檢查流出液,當有賴氨酸流出時即可收集。一般為pH=9、5~12,前后流分賴氨酸濃度低而銨含量高,可合并于洗脫用氨水中,以提高收得率。一般收得率可達90%~95%。6、5賴氨酸的精制濃縮與除氨賴氨酸鹽酸鹽的結(jié)晶與分離賴氨酸鹽酸鹽的重結(jié)晶與干燥濃縮與除氨

經(jīng)過離子交換提取的賴氨酸洗脫液,體積較大,賴氨酸含量較低(約為60~80g/L),還含有較多的氨(約為10~15g/L),因此需要進行濃縮與除氨。為了收集蒸發(fā)出來的氨蒸氣,可采納單效蒸發(fā)。濃縮與除氨(2)濃縮液濃縮至19~20oBé(賴氨酸鹽酸鹽含量約為340~360g/L)放出料液,用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH=4、9,再接著濃縮至22~23oBé。在堿性溶液中濃縮時,溫度不宜過高,時間不宜過長,否則會生成DL-賴氨酸。波美度與密度換算

賴氨