流式細胞檢測課件1

王麗2015-07-07流式細胞技術FLOWCYTOMETRYWhatdoesitmean?CYTOCellMeasure(ment)MEASUREMENTOFACELLMETRYFLOWCYTOMETRY：在液流系統(tǒng)中，快速測定單個細胞或微粒的物理特性和生化特性的方法。FlowCytometer(FCM)–流式細胞儀FlowSorter–

流式細胞分選儀2精選pptBDFACSVantageBDCalibur流式細胞儀BD

流式細胞儀液流系統(tǒng)

BECKMAN

CytoFLEXMiltenyiMACSQuantGuava5HT微毛細管細胞分析儀3精選ppt

流式細胞儀的組成OpticsElectronicsSoftwareFluidicsWaste4精選ppt樣品規(guī)格：96孔板或1.5mL小管進樣準備5精選ppt工作流程樣本制備熒光染色上樣檢測數(shù)據(jù)分析FluorescenceDetectorHistogramSingleCellSuspensionCellSuspensionFluorescentlyLabelledAntibodyFluorescenceY+BlueLaser(488nm)6精選ppt

液流系統(tǒng)功能：傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)。樣本：0.2-150微米的粒子，最快可在1秒種內(nèi)計測數(shù)萬個細胞。SheathFluid:~10mL/TestWaste：1L/hrrun10萬—100萬cells/TestNoSheathFluidWaste：<10ml/hrrun2千—1萬cells/Test精選pptVolume=200nlFlowRate=0.1-1ul/second0.1mm20mm50-100mm0.1mmProbeVolume=200plVolume=0.01Volume=0.02Volume=0.03微毛細管流動池8精選ppt460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50Longpass Shortpass BandpassBP500/50=475nm–525nmLP500=>500nmSP500=<500nm光學系統(tǒng)FCM的光學系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成。9精選ppteasyCyte5HTsystem激發(fā)光:75mWBlueLaser(488nm)檢測熒光通道：ForwardScatter–FSCSideScatter–SSCGreen–525/30nmYellow–583/26nmRed1–680/30nm10精選ppt功能:量化電壓脈沖將模型信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號熒光補償數(shù)據(jù)傳給電腦以便分析電子器件檢測器

、光電二極管、光電培增管11精選ppt軟件系統(tǒng)12精選pptInCyte開放模塊-Flexibility拖曳式設門，操作簡單易學整合多組數(shù)據(jù)多種Plot以供選擇R1R2WorkStationHeat-Map數(shù)據(jù)分析直觀化Min/Maxthreshold分析方式靈活13精選ppt測量參數(shù)光散射強度熒光強度樣本體積細胞數(shù)目精選ppt前向散射角側(cè)向散射角Incidentlaserlight前向散射角和側(cè)向散射角“大小”成正比例關系:

截面積大小折射率細胞形狀雖然也與細胞的形狀與大小有關，但是它對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的，折射率更敏感。FSC:Forwardanglelightscatter區(qū)分細胞與細胞碎片SSC:Side-angle(90)lightscatter在細胞大小相同的情況下，區(qū)分不同的細胞種類。精選pptScatter–HowitworksSideScatterForwardScatter02004006008001000LaserLightSSCFSCLaserLightFSC粒細胞SSC淋巴細胞LaserLightSSCFSC單核細胞精選ppt熒光——熒光物質(zhì)吸收符合其波長范圍的光能量，內(nèi)部電子受激上升到高能級。然后受激電子迅速衰落回基態(tài)，釋放過剩能量成為光子。激發(fā)光譜——能夠激發(fā)熒光物質(zhì)的波長范圍。發(fā)射光譜——熒光物質(zhì)的發(fā)射波長范圍。因為更多的能量消耗在吸收轉(zhuǎn)換而不是熒光轉(zhuǎn)換中，所以發(fā)射光波長要高于激發(fā)光波長。FCM多采用氬離子激光器，因為488nm的激光器能夠激發(fā)多種熒光。光源的譜線愈接近被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜的峰值，所產(chǎn)生的熒光信號愈強。熒光信號17精選ppt熒光信號~520nmemission488nmexcitationFITC-labeledantibodybindssurfaceantigen精選ppt熒光染料性能488nmexcitationwavelength(nm)excitation/emission519nmemissionStokesShift精選ppt線性放大——DNA、RNA、總蛋白質(zhì)含量等的檢測。對數(shù)放大——抗原檢測等。熒光信號的面積(FL2－A)——準確反映DNA的含量。熒光信號的寬度(FL2－W)——常用來區(qū)分雙聯(lián)體細胞。熒光信號20精選ppt常見熒光素：FITC(異硫氰酸熒光素）：綠色530nmPE（藻紅蛋白）：橙黃色575nmPerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：深紅色 675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm APC(別藻蘭蛋白）：紅色660nm抗體的選擇：首選直接標記抗體熒光分子強度：APC>PE>PerCP>FITC

PE較強，適用于弱表達抗原

FITC最便宜，適用于強表達抗原21精選ppt常見熒光物質(zhì)的應用PM1(Orange)AddnmPM2(Red)PM3(Green)FluorophoresConjugatedtoanAbPEPE-Cy5FITCDeadCellDyes(DNAstaining)PI7-AADLiveCellDye(DNAStaining)LDS751FluorescentProteinsGFPCellTrackingDyesCFSE精選ppt直方圖和點陣圖直方圖(HistogramPlot)——單參數(shù)分析.X-Axis:熒光信號強度.Y-Axis:細胞數(shù)目.點陣圖(DotPlot)——雙參數(shù)分析.XandYaxis：兩種熒光信號強度.每個點代表一個細胞.Log&

Lin:熒光強度的坐標可以是線性的，也可以是對數(shù)的.精選ppt直方圖：可根據(jù)單一因素區(qū)分細胞亞群10e010e110e210e310e4CD20-FITC(GRN-HLog)705335180CountM2M110e010e110e210e310e4CD20-FITC(GRN-HLog)705335180Count70cellseachhaveagreenfluorescenceintensityofabout400Noticethesubpopulation?精選ppt血細胞分群

（紅細胞溶解后）點陣圖：根據(jù)多因素區(qū)分細胞亞群25精選ppt熒光補償光譜重疊的校正：目前使用的熒光染料都是寬波譜，兩兩之間的發(fā)射譜范圍有一定的重疊。為了克服這種誤差，可使用熒光補償電路，設置合理的熒光信號補償。精選ppt我需要準備什么？1.Why：為什么進行流式細胞檢測？

流式細胞技術是否是最佳的檢測方法？

檢測的原理是什么？

要檢測的物質(zhì)是什么？2.Where：熒光標記的物質(zhì)在哪里？

是否需要對細胞進行固定？打孔？3.Which：選擇什么熒光標記物？4.How:樣品制備流程，多少個標本？（空白對照、陰性對照……）5.When:預約（175874947群共享下載申請表）

Doit?。ê线m的細胞密度并避免細胞結(jié)團）27精選ppt應用范圍細胞絕對計數(shù)和活力分析細胞增殖細胞周期細胞凋亡細胞毒實驗抗原定量檢測線粒體膜電位檢測……28精選ppt實驗對照的設計空白對照ALL

：采用不標記的細胞進行平行測定，用于確定待測標本的基礎熒光域值或檢測染色方法是否成功。陰性對照：調(diào)節(jié)各熒光探測器合適的放大倍數(shù)，即確定待測標本的基礎熒光域值。常用同型對照（與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同亞型的免疫球蛋白），用于消除抗體與細胞非特異性結(jié)合產(chǎn)生的背景。陽性對照：用已知表達某種抗原的細胞（陽性細胞）進行平行實驗，通常用于檢測抗體是否正?；虼_定實驗方法的穩(wěn)定性和準確性。補償對照：多色分析時，將用于多色標記的各種熒光抗體分別與樣本進行單色標記，以測定熒光信號的光譜重疊情況以進行調(diào)節(jié)。單色分析：設同型抗體對照多色分析：同型對照，補償對照29精選ppt細胞周期：從一次分裂完成時開始，到下一次分裂完成時為止，為一個細胞周期。（細胞內(nèi)的DNA含量隨細胞周期進程發(fā)生周期性變化。）DNA含量：

G1（DNA合成前期，2C）、分裂間期S（DNA合成期，2C-4C）、G2（DNA合成后期，4C）分裂期——M期（DNA為4C）。利用核酸標記的方法，通過流式細胞儀對細胞內(nèi)DNA的相對含量進行測定，可分析細胞周期各時相的百分比。但是分裂期（M期）的前期、中期、后期、末期四個時期，普通流式無法進行定量檢測。1.DNA細胞周期分析應用實例30精選ppt1.DNA細胞周期分析31精選ppt實驗步驟及注意事項：1、細胞周期固定：加200ul細胞（貼壁培養(yǎng)的細胞需要先用胰酶消化）到1.5ml離心管中→300×g轉(zhuǎn)速離心5min，并用1×PBS清洗一次→離心去上清→添加300ulPBS溶解沉淀細胞→緩慢加入－20℃預冷的100%乙醇700ul固定細胞（固定過程中需要邊滴加乙醇，邊震蕩，不要產(chǎn)生細胞聚團，否則會嚴重影響實驗結(jié)果）→最后乙醇終濃度為70%→－20℃孵育至少3小時（建議4℃孵育過夜，效果會更好）。2、將固定好的細胞300×g轉(zhuǎn)速離心5min，并用1×PBS清洗一次。將細胞用200ul的Guava細胞周期試劑重新懸浮，室溫孵育30min，注意避光。3、用200目細胞篩過濾細胞（如果使用PI染色必須過濾），顯微鏡下細胞無結(jié)團，Guava流式細胞儀檢測。1.DNA細胞周期分析32精選ppt2.早期細胞凋亡檢測33精選ppt2.早期細胞凋亡檢測結(jié)果正常細胞：AnnexinV(-)/7-AAD(-)早期凋亡細胞：AnnexinV(+)/7-AAD(-)晚期凋亡細胞：AnnexinV(+)/7-AAD(+)CD95/FASL刺激誘導凋亡34精選ppt實驗步驟

1.樣本準備(貼壁細胞)：棄去培養(yǎng)細胞(對數(shù)生長期)中的舊培養(yǎng)液，加入胰酶消化細胞，。收集舊培養(yǎng)基，通過離心獲得凋亡或死亡細胞，與之后消化后的細胞混合，再檢測。2.細胞染色：在96-well微孔板相應的孔中加入100ulGuavaNexin（貨號：4500-0450）和100ul準備好的細胞懸液，室溫避光孵育20min；盡快用流式細胞儀獲取結(jié)果（1h內(nèi)）。流式細胞儀檢測獲取數(shù)據(jù)。注意：實驗最好包括實驗組、陰性對照和陽性對照（凋亡誘導組）。2.早期細胞凋亡檢測結(jié)果35精選ppt細胞凋亡細胞凋亡是動態(tài)事件，在不同時期展現(xiàn)不同的凋亡信號。早期——磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）暴露在細胞膜上，與PS結(jié)合的AnnexinV成為檢測凋亡早期的最常用指標。除此之外，線粒體膜電位變化和細胞色素C的釋放