第二章-細胞培養(yǎng)基本技術-課件

?

細胞工程實驗室設計

–原則防止微生物污染和有害因素影響

劃分不同功能區(qū)或用鋁合金隔板隔開無菌操作區(qū)應在室內較少走動的內側清洗和消毒安置在另室–要求工作環(huán)境清潔、空氣清新、干燥和無煙塵1ppt課件◆動物細胞培養(yǎng)室的設置準備室無菌間操作間培養(yǎng)室分析室2ppt課件◆溫度：一般控制在在25±2oC◆光照：光強、光質、光照時間3ppt課件一、動植物細胞工程實驗室通用儀器設備超凈工作臺n超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環(huán)境。4ppt課件冰箱■普通冰箱（4℃，－20

℃）■低溫冰箱（－20℃）■超低溫冰箱（－80℃）5ppt課件電熱干燥箱■烘干和干熱滅菌玻璃器皿■100度以下時再打開箱門■金屬器械、塑料制品、橡膠等不能在干燥箱內消毒

6ppt課件壓力蒸汽消毒器濕熱滅菌，用途廣7ppt課件n使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意n

CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37

℃％CO

2

。，5

的問題：

①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。 ②保持培養(yǎng)箱內空氣干凈。定期消毒（90

℃，14

h)。 ③箱內滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。

8ppt課件細胞冷凍儲存器

——液氮罐液氮溫度：－196℃不斷揮發(fā)，及時補充9ppt課件3.1

細胞工程實驗室條件

◆實驗室基本組成 ◆實驗用品與主要設備◆實驗室的生物安全10ppt課件?

?

?

?

生物安全防護水平（BSL）

由一級防護屏障（安全設備）和二級防護屏障（實驗室設施）組合構成四級生物安全水平。

一級生物安全防護水平

（BSL－1）二級生物安全防護水平

（BSL－2）三級生物安全防護水平

（BSL－3）四級生物安全防護水平（BSL－4）11ppt課件生物安全四級(BSL—4)：處理特別危險的傳染源生物安全一級(BSL-1)：適合于非常熟悉的病源，不會經(jīng)常引發(fā)健康成人疾病，對實驗人員和環(huán)境潛在危險小。一般也不使用特殊的遏制設備和設施。生物安全二級(BSL—2)：適合于對人和環(huán)境有中度潛在危險的病源，應在生物安全柜中或其它物理遏制設備中進行。生物安全三級(BSL—3)：該會引發(fā)嚴重的、可能致死的疾病的病源。在生物安全柜或其他物理遏制裝置中進行，或由穿戴合適防護服及設施的實驗人員進行。實驗室經(jīng)過特殊設計和施工。12ppt課件Summary：細胞培養(yǎng)的基本條件細胞保存條件：液氮罐無菌條件：凈化工作室，高效過濾器，生物安全柜，超凈工作臺，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素細胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標儀，微孔板震蕩器，高速離心機，移液器實驗室安全：生物實驗室安全，P1,P2,P3實驗室安全13ppt課件Chapter

3

細胞工程基本實驗技術◆實驗室設施與基本條件◆無菌技術◆顯微技術◆細胞觀察與分析◆細胞分離◆細胞保存與復蘇14ppt課件3.2

無菌技術◆培養(yǎng)用品清洗◆滅菌方法◆污染檢測與控制15ppt課件一、玻璃器皿的清洗◆浸泡新瓶使用前用自來水簡單刷洗，后用稀鹽酸浸泡過夜。WHY?

于6使用過的器皿應立即浸入水中，避免干涸難洗◆刷洗軟毛刷沾洗滌劑洗滌

◆浸酸關鍵一環(huán)。時間不少于小時，一般過夜。清潔液變綠應重新配制?！魶_洗洗滌裝置與手工◆烘干、包裝、高壓（15磅20分鐘）或干熱（160度2小時）16ppt課件17ppt課件◆常規(guī)清洗方法：水中浸泡自來水沖洗洗2-3次

1%鹽酸浸泡30分鐘晾干 包裝、高壓滅菌

二、膠塞的清洗◆新購置膠塞有大量滑石粉，用自來水洗凈，再常規(guī)處理2%NaOH煮沸10-20分鐘自來水沖洗蒸餾水清18ppt課件三、包裝消毒筒●局部包裝◆包裝材料有皺紋包裝紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒及金屬●全包裝小物品裝飯盒，注意期限，標明物品名。吸管用脫脂棉將管接口端堵塞，裝入消毒筒，筒底墊棉花19ppt課件

3.2

無菌技術◆培養(yǎng)用品清洗◆滅菌方法◆污染檢測與控制20ppt課件?

操作人員的手部？

?

實驗室桌面、地面等？細胞培養(yǎng)室中下列物品該如何消毒？?

玻璃培養(yǎng)瓶，移液管，

試管等玻璃器皿？?

超凈工作臺臺面？

?

金屬手術器械？?

不耐熱的液體培養(yǎng)基和胰蛋白酶等

？?

橡膠塞和塑料瓶蓋等？

?

細胞培養(yǎng)室？

21ppt課件消毒（1）

物理消毒

?

火焰

?

射線消毒：鈷60（60Co

），用于牛血清、塑料制品

?

紫外線消毒空氣、操作臺表面

。紫外燈距地面2.5米

?

干熱消毒玻璃器皿

160

度保持90-120分鐘

?

濕熱消毒布類、膠塞、金屬器械、玻璃器皿某些液布

體物品不宜過滿液體和橡膠制品10磅10分鐘 類、金屬器械、玻璃器皿

15磅20分鐘

?

濾過消毒培養(yǎng)用液

0.22

μm微孔濾膜22ppt課件消毒（2）化學消毒

?

來蘇爾（煤酚皂）

?

0.1%新潔爾滅

?

70％（或75％）酒精

?

0.5過氧乙酸抗生素消毒氣體消毒：37％甲醛加熱沸騰后，加適量高錳酸鉀，關門窗1～3天煮沸消毒23ppt課件物品濕熱干熱過濾培養(yǎng)室工作臺玻璃制品＋＋＋＋金屬器械塑料制品＋橡膠制品培養(yǎng)用液布類棉類＋＋＋＋紫外化學氣體消毒劑電離輻射＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋24ppt課件

消毒與滅菌重要概念1.消毒2.滅菌3.防腐4.無菌

殺死物體上病原微生物的方法；并不一定能 殺死含芽胞的細菌或非病原微生物 殺死物體上所有微生物的方法。防止或抑制微生物生長繁殖的方法。 不存在活的微生物。5.無菌操作防止微生物進入機體或局部環(huán)境的操作技術。25ppt課件一、物理消毒滅菌法（一）熱力滅菌法1.濕熱滅菌法2.干熱滅菌法26ppt課件蛋白質含水量（%）

50

25

凝固所需溫度

56

18

6

0

76

80-90

145

160-170

結論一：蛋白質在濕熱中較易凝固變性

。27ppt課件熱型

溫度（度）時間 （h)

干熱

130-140

4

濕熱

105.3

3

布層內溫度

20層

40層

100層滅菌效 果

86

72

70.5

不完全

101

101

101

完全

結論二：濕熱的穿透力比干熱強。28ppt課件

一、物理消毒滅菌法（一）熱力滅菌法

煮沸法 流通蒸汽消毒法1.濕熱滅菌法

2.干熱滅菌法間歇滅菌法巴氏消毒法高壓蒸汽滅菌法 干烤法 焚燒法 燒灼法29ppt課件

方法名煮沸法

方法內容100度

5min

間歇滅菌法

流通蒸汽消毒法

100度

10-30min

100度

10-30min

,37

巴氏消毒法

61.1-62.8度

30min

71.7度

15-30s

高壓蒸汽滅菌法

121度20-40min

焚燒法燒灼法干烤法

160度

2小時

適用物質飲水和一般器械的消毒

耐濕不耐高溫物品的消毒

度過夜，每日一次，不耐高溫的營養(yǎng)物

連續(xù)三次牛奶和酒類等

耐高溫、耐水物品無經(jīng)濟價值的污染物品微生物實驗室的接種針等不怕熱的金屬器械玻璃器皿、瓷器等滅菌30ppt課件1.日光與紫外線殺菌波長：210-300nm最適波長：265-266nm殺菌機制：干擾DNA復制特點：穿透力弱（二）輻射殺菌法2.電離輻射應用：不耐熱的塑料制品以及食品消毒應用：空氣和物體表面的消毒缺點：損傷皮膚和眼睛種類：γ射線、χ射線和電子流滅菌機制：產(chǎn)生游離基，破壞壞DNA特點：具有較高的能量和穿透力31ppt課件（三）過濾除菌法（四）超聲波殺菌法（五）干燥和低溫抑菌法負壓？正壓？32ppt課件二、化學消毒滅菌法（一）消毒劑的主要種類（二）消毒劑的應用33ppt課件類別作用機制常用消毒劑用途酚類蛋白質變性、損傷細胞膜、滅活酶類3%～5%石炭酸或或2%來蘇兒地面、器具表面的消毒0.01%～0.05%洗必泰皮膚消毒，術前洗手、陰道沖洗等醇類蛋白質變性與凝固、干擾代謝70%～75%乙醇50%～70%異丙醇皮膚、溫度計消毒重金屬鹽類氧化作用、蛋白質變性與沉淀,滅活酶類0.05%～0.1%升汞非金屬器皿的消毒0.1%硫柳汞皮膚、粘膜、小創(chuàng)傷消毒1%硝酸銀1%～5%蛋白銀新生兒滴眼，預防淋病奈瑟菌感染氧化劑氧化作用、蛋白質沉淀0.1%高錳酸鉀皮膚、尿道、蔬菜、水果消毒3%過氧化氫創(chuàng)口、皮膚粘膜消毒0.2%～0.3%過氧乙酸塑料、玻璃器材消毒2.0%～2.5%碘酒皮膚消毒0.2～0.5ppm氯飲水及游泳池消毒10%～20%漂白粉地面、廁所與排泄物消毒34ppt課件類別作用機制常用消毒劑用途氧化劑氧化作用、蛋白質沉淀4ppm二氯異氰尿酸鈉水消毒3%二氯異氰尿酸鈉空氣及排泄物消毒0.2%～0.5%氯胺室內空氣及表面消毒表面活性劑損傷細胞膜、滅活氧化酶等酶活性、使蛋白質沉淀0.05%～0.1%新潔爾滅外科手術洗手，皮膚粘膜消毒，浸泡手術器械0.05%～0.1%杜滅芬塑料、橡皮類消毒烷化劑菌體蛋白質及核酸烷基化10%甲醛物體表面消毒,空氣消毒50mg/L環(huán)氧乙烷手術器械、敷料等消毒2%戊二醛精密儀器、內窺鏡等消毒染料抑制細菌繁殖，干擾氧化過程2%～4%龍膽紫淺表創(chuàng)傷消毒酸堿類破壞細胞膜和細胞壁，蛋白質凝固

335ml/m～10ml/m10ml/m醋酸加等量水蒸發(fā)空氣消毒生石灰(按11∶4～1∶8比例加水配成糊狀狀)地面、排泄物消毒皮膚創(chuàng)傷沖洗，金屬器械、35ppt課件（三）影響消毒滅菌效果的因素1.影響因素（1）消毒劑的性質、濃度與作用時間36ppt課件（三）影響消毒滅菌效果的因素1.影響因素（1）消毒劑的性質、濃度與作用時間（2）微生物的污染程度（3）微生物的種類和生活狀態(tài)（4）環(huán)境中有機物（5）溫度、濕度、酸堿度（6）化學拮抗物2.注意事項37ppt課件2.注意事項①嚴格掌握所用消毒劑的濃度、消毒時間與使用方法。②使用新鮮配制的消毒劑。③消毒劑應置于消毒過的清潔容器內貯放備用。④待消毒物品須洗刷干凈，去除油污及血、膿等有機物方可消毒。⑤揮發(fā)性消毒液應貯放在有蓋容器內，并定期測量比重。38ppt課件◆新玻璃器皿的洗滌與消毒毒.wmv◆舊玻璃器皿的洗滌與消毒毒.wmv◆金屬器械的洗滌與消毒毒.wmv◆橡膠塑料的洗滌與消毒毒.wmv39ppt課件◆無菌操作成功或失敗的首要條件無菌操作技術要領?操作野消毒

?洗手和著裝

?火焰消毒◆培養(yǎng)前準備操作卡片

用品置于場地，然后消毒40ppt課件?動作準確敏捷

?不用手觸及已消毒物品

?操作面布局合理

?操作保持一定順序

?培養(yǎng)用瓶和吸管的放置

?防止各種用液的交叉污染

?不向操作野講話或咳嗽41ppt課件42ppt課件43ppt課件

3.2

無菌技術◆培養(yǎng)用品清洗◆滅菌方法◆污染檢測與控制44ppt課件一、污染途徑◆空氣◆器材清洗消毒不徹底◆操作◆血清◆組織45ppt課件戰(zhàn)-二、污染對培養(yǎng)細胞的影響及檢測

最嚴峻的挑戰(zhàn)

污染

(contamination)

細胞培養(yǎng)的污染問題十分重要，一旦發(fā)生污染，將導致前功盡棄。所以細胞培養(yǎng)一定要建立無菌觀念。遇到培養(yǎng)污染要分析原因，及時處理。46ppt課件

細胞培養(yǎng)中常見的污染物有細菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現(xiàn)以下情況時培養(yǎng)的細胞可能有污染

：1)

培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變

。2)

培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁。

3)

光鏡觀察到菌絲和顆粒

。4)

細胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢等。47ppt課件細菌污染

?培養(yǎng)液渾濁

?鏡下可見菌體48ppt課件真菌污染

?大多呈白色或淺黃色小點漂浮于培養(yǎng)液表面

?鏡下呈絲狀、管狀或樹枝狀，縱橫交錯49ppt課件50ppt課件51ppt課件支原體污染

?最常見、不易察覺

?大小介于0.2-2μm，

約1%可通過濾菌器?對酸耐受性差，對熱較敏感

，青霉素無效?“正?！备杏X

?腺苷酸環(huán)化酶

?精氨酸

?檢測52ppt課件◆支原體檢測:

支原體污染細胞后，能抑制細胞代謝和生長，改變核酸合成，影響細胞的抗原性，引起細胞染色體改變，干擾擾DNA的復制，以及具有類病毒作用。在培養(yǎng)細胞初期，由于支原體對細胞的繁殖影響較小而往往被忽略。53ppt課件支原體檢測方法和處理

2）直接培養(yǎng)法：實驗室常用。

3）放射自顯影檢測：

4）DNA分子雜交：檢測完畢后，所有實驗用具均應經(jīng)過高壓消毒處理1)熒光技術檢測：支原體含有

DNA,能與一種熒光染料Hoechest

33258特異性的結合，可根據(jù)細胞表面的熒光來顯示細胞是否污染有支原體。

54ppt課件支原體污染電鏡照片（×30K）55ppt課件病毒的污染及檢測

2）血細胞吸附試驗；

3）雞胚接種。1）致細胞病變效應（

Cytopathic

effect,

CPE）或集落的檢測：采用相差顯微 鏡檢測

56ppt課件57ppt課件細胞間交叉污染瓶內；為避免細胞間交叉污染，應注意：◆了解各細胞系的特征；◆培養(yǎng)各細胞系的操作手續(xù)要快速；◆培養(yǎng)各細胞系不用同一瓶的培養(yǎng)液和酶等；◆吸過培養(yǎng)液和細胞懸液的吸管，不能放回儲存培養(yǎng)液和酶的◆經(jīng)常檢查培養(yǎng)物特征，注意任何突然的形態(tài)學改變，通過染色體或同工酶譜分析，檢查是否有交叉污染。58ppt課件三、污染的預防)?消毒(Sterilization

)?無菌操作(Aseptic

technique

59ppt課件四、污染的排除

?：v抗生素處理：v動物體內接種除菌法：受支原體污染的腫瘤細胞可接種到動v加溫除菌：支原體熱耐受性差，可把污染的細胞41度處理5～10小時，以殺滅支原體，但對培養(yǎng)細胞本身也有很大影響。v共培養(yǎng)法：從動物腹腔采集巨噬細胞，與污染細胞共培養(yǎng)。v重新克隆法：抗生素處理后，將細胞稀釋后傳代，每周換2次含抗生素的新鮮培養(yǎng)液，4～5周后，重復克隆2次。物皮下或腹腔中，借助動物的免疫系統(tǒng)殺滅支原體。60ppt課件?

被毛生長異常，呈裸體外表。：T裸小鼠（nudemice）：淋巴細胞功能缺陷動物?

即先天性無胸腺裸小鼠，由11號染色體上nu隱性基因突變導致。?

無胸腺，僅有胸腺殘跡或異常胸腺上皮，不能使T-cell正常分化，

導致細胞免疫力低下。幼齡鼠有殘存的未分化的上皮細胞。?B細胞功能正常，NK細胞活力增強。?

繁育能力差，乳腺發(fā)育缺損，以雄性純合子與雌性雜合子繁育。?T細胞缺陷可通過移植成熟T細胞、胸腺細胞或正常胸腺上皮得 到校正。61ppt課件62ppt課件分別為青霉素（單位/ml和鏈霉素（可配（

為防止污染，細胞培養(yǎng)液中常添加青霉素和鏈霉素，即所謂“雙抗”，二者的常用終濃度）單位/ml和鏈霉素（）微克/ml。假設每100ml培養(yǎng)基加50ul

“雙抗”就可達到終濃度，母液濃度應配成：青霉素（））微克/ml。P每瓶80萬U，）ml母液？相應加入（）克S？63ppt課件Chapter

3

細胞工程基本實驗技術◆實驗室設施與基本條件◆無菌技術◆顯微技術◆細胞觀察與分析◆細胞分離◆細胞保存與復蘇64ppt課件◆

Light

microscopy

◆

Electron

microscopy

◆

Scanning

tunneling

microscope

◆

Micromanipulation

technique

3.3

顯微技術

65ppt課件二、培養(yǎng)細胞的觀察方法

細胞在體外培養(yǎng)過程中需要每天進行常規(guī)檢查和顯微鏡觀察，及時了解細胞生長狀態(tài)、數(shù)量改變、細胞形態(tài)、細胞有無移動、有無污染、培養(yǎng)液pH是否變酸、變黃是否更換等。

由于細胞小而復雜，若不借助適當?shù)氖侄危瑒t難以觀察其形態(tài)、結構，更難發(fā)現(xiàn)細胞內各種組分的分子組成及功能。目前，已有多種研究細胞的技術，從光鏡到電子顯微鏡，從一般細胞化學法到免疫化學法等。66ppt課件1.

肉眼觀察

變淺變黃。

?

肉眼觀察培養(yǎng)液的顏色和

透明度的變化。?

正常情況下，培養(yǎng)液pH介于7.2～7.4之間，呈桃紅色清亮透明。（指示劑：

酚紅）?

培養(yǎng)時，細胞代謝會使培養(yǎng)液pH值下降，引起顏色?

發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變黃，應及時換液傳代。一般生長穩(wěn)定 的細胞2～3天換液一次，生長緩慢的細胞3～4天換 液一次。67ppt課件

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為為PH值的指示劑:中性時為 紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。

苯酚紅

Phenol

red

別名：酚紅；苯酚磺酞；Phend-

-sulphonphthalein

分子式：C19H1405S

相對分子質量：354．38

性狀:

紅色結晶性粉末。微溶于水，易溶于乙醇及堿溶液， 不溶于三氯甲烷及醚。溶于稀堿溶液呈紅色。

用途：酸堿指示劑，pH值1.2（橙）～3.0(黃），6.5（棕 黃）～8.0(紫紅）問題：細胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基會逐漸變黃，為什么？培養(yǎng)基如果暴露在空氣中會逐漸變紫

，為什么？（page45）68ppt課件?

生長良好的細胞，在顯微鏡下可觀察到細胞透明度2.

顯微鏡觀察

大，折光性強，輪廓不清

。?

相差顯微鏡觀察時可見細胞部分細微結構

。?

若細胞生長狀態(tài)不良，可見細胞輪廓增強，細胞折 光性變弱，胞質中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物 質，細胞之間空隙增大，細胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失 去原有細胞的特點，產(chǎn)生圓縮脫落，有時細胞表面 及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。發(fā)現(xiàn)這種情況應及時處理。69ppt課件◆倒置顯微鏡70ppt課件培養(yǎng)的CHO細胞71ppt課件◆相差顯微鏡72ppt課件相差顯微鏡的結構?

相差顯微鏡由相差聚光器和相差接物鏡兩個主要部分 組成。它與普通光鏡相比多了兩個部件，一個是在聚 光器上增加一個環(huán)形光闌，使透過聚光器的光線形成 空心光錐、聚焦到標本上。另一個是在物鏡的后焦面 增加一個相板，相板有一個環(huán)形區(qū)，其大小恰好通過 環(huán)形光闌束的直射光，相板各區(qū)鍍以不同物質，使得 通過環(huán)形區(qū)的光比通過相板其他部位的光超前或滯后

1/4λ

73ppt課件相差顯微鏡的基本原理

?

把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了 各種結構之間的對比度，使標本的各種結構變得更清晰 可見。光線透過標本后，發(fā)生折射，偏離了未通過標本 的光線的光路，這兩組光線合軸后，則發(fā)生相互干涉現(xiàn) 象。透過生物標本發(fā)生折射的光線與未透過標本的光線 之間產(chǎn)生了光程差。前者被阻滯了1/4λ(波長)。如果把 光程差再增加1/4λ，則變?yōu)?/2λ，合軸后兩束光線的干 涉加強，使標本周圍發(fā)生暈圈，提高了可見度。74ppt課件相差顯微鏡觀察活細胞的步驟

?

首先調好相位板，使聚光器相位板號與接物鏡放大倍數(shù)

(相位板)相一致。然后抽出接目鏡，再換輔助望遠鏡， 移動輔助鏡筒并調整聚光器相位板，使視影中兩個大小 一樣的光環(huán)相互吻合。再重新?lián)Q上原接目鏡，即成相差 圖像。當更換不同倍數(shù)接物鏡時，需按上述過程重新調 節(jié)。75ppt課件?

用相差顯微鏡觀察細胞應注意瓶（或皿）的厚度、均勻 性、清潔度、氣溫等。經(jīng)標準化生產(chǎn)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶 （或皿）一般成像效果都較好，但反復刷洗過的玻璃或 塑料器皿將嚴重影響分辨力。天氣較冷時，若與顯微鏡 觀察處溫差較大，由于溫差使培養(yǎng)瓶內壁形成霧滴而影 響觀察的清晰度，此時可輕輕將瓶傾斜使瓶內培養(yǎng)液浸 潤內壁，以得到好的相差像。若對原代細胞培養(yǎng)進行相 差顯微照相，最好選擇換液后進行，這樣可以去除漂浮 的組織塊和死細胞，提高成像清晰度。觀察細胞時要有 無菌概念，動作要輕，避免猛烈振蕩。觀察時間不要太 長，觀察次數(shù)也不要太頻繁，以免影響細胞生長。76ppt課件77ppt課件78ppt課件思考提示：（1）細胞形態(tài)的觀察手段和觀察指標 （2）檢測細胞生長增殖狀態(tài)的手段和指標某種藥物（或向細胞中轉入某個新基因；或抑制細胞中某個原有基因的表達后）對培養(yǎng)的某種腫瘤細胞的形態(tài)和生長增殖的影響。79ppt課件Chapter

3

細胞工程基本實驗技術◆實驗室設施與基本條件◆無菌技術◆顯微技術◆細胞觀察與分析◆細胞分離◆細胞保存與復蘇80ppt課件三、培養(yǎng)細胞的檢測指標

1.

細胞計數(shù)細胞生長狀況有關指標的檢測方法81ppt課件Cell

counting

using

a

haemocytometer82ppt課件83ppt課件1毫升＝1立方厘米

計數(shù)原則：

不數(shù)死細胞（染 藍）、壓線細胞數(shù) 上不數(shù)下，數(shù)左不 數(shù)右，一團細胞按 一個計數(shù)！

1毫米細胞數(shù)/毫升細胞懸液＝4大格細胞總數(shù)

/4×10000×稀釋倍數(shù)

視頻：細胞計數(shù).wmv84ppt課件2.

細胞生長曲線三、培養(yǎng)細胞的檢測指標如何作？page73

85ppt課件◆生長曲線是培養(yǎng)細胞生物學特性的基本參數(shù)之一，是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標。◆常用于測定藥物等外來因素對細胞生長的影響！86ppt課件三、培養(yǎng)細胞的檢測指標

3.

細胞分裂指數(shù)

?

細胞分裂指數(shù)是表示細胞增殖旺盛程度的指標。它以被測1000個細胞中的分裂細胞數(shù)來計算。其方法為：用秋水仙素將細胞處理1～2小時后，按染色體制片法制片并染色，計算1000個細胞中分裂相的數(shù)目，重復4次取平均值，用百分比表示。87ppt課件基本步驟：

(1)細胞準備用蓋片(支持物)培養(yǎng)法

。(2)每24小時取出一個小玻片，按常規(guī)方法進行固定，吉姆薩或HE染色，封片，制成永久標本

。(3)顯微鏡下選擇細胞密度適中的區(qū)域觀察分裂細胞并計 數(shù)。逐個視野進行，對每一時間組的玻片各取細胞多、 中、少3個區(qū)域各一區(qū)，共數(shù)1000個細胞，計算出平均 分裂相值所占百分比。觀察時要掌握好分裂相標準，主 要是確定好劃分間期和前期，末期和間期等的界限，以 減少誤差。細胞分裂指數(shù)=細胞分裂相數(shù)/細胞總數(shù)(1000)×100088ppt課件4.

細胞貼壁率三、培養(yǎng)細胞的檢測指標

細胞貼壁率又稱細胞接種存活率。它是細胞被制成分散的懸液后，以低密度(2～5個細胞/cm2)被接種到底物上，貼壁并能存活生長形成細胞小群(克隆)的細胞百分數(shù)值，用以表示細胞的生存能力和細胞群的活力。89ppt課件

基本步驟：（1）取對生長期細胞，用消化法制成細胞懸液，計數(shù)后 按檢測細胞生長曲線的接種細胞的原則，將細胞接種 于培養(yǎng)瓶(濃度相對高些)。接種12～15瓶。（2）每2小時取出一瓶細胞，倒掉培養(yǎng)液，然后加入胰 酶消化已貼壁細胞，計數(shù)已貼壁細胞，用下面公式逐個計算每個時間上的貼壁率。每2小時一次，共觀察24

小時即12。接種存活率%(貼壁率)=(貼壁存活細胞數(shù)/接種細胞數(shù))×100%90ppt課件三、培養(yǎng)細胞的檢測指標

5.

克隆形成率

?

細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數(shù)，但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細胞生物學性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。并且克隆形成率與接種密度有一定關系，做克隆形成率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在碟皿中，持續(xù)一周，隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養(yǎng)。91ppt課件平板克隆形成試驗基本步驟：

(1)取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞，用0.25%胰蛋白酶消 化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在

10%胎牛血清的

RPMI1640培養(yǎng)液中備用。

(2)將細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以適當?shù)募毎芏?根 據(jù)增殖能力)接種于培養(yǎng)皿中

。一般分每皿50、100、

200個細胞的梯度密度分別接種含10mL

37℃預溫培 養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉動，

使細胞分散均勻。置37℃ 5%

CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2～3周。92ppt課件克隆數(shù)接種細胞數(shù)(3)經(jīng)常觀察，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止

培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS

小心浸洗2次。加純甲醇或

1:3醋酸/甲醇5mL，固定15

分鐘。然后去固定液，加適

量Giemsa應用染色液染10

～30分鐘，然后用流水緩慢 洗去染色液，空氣干燥。

(4)將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片

，用肉眼直 接計數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細胞的 克隆數(shù)。最后計算克隆形成率。

克隆形成率=

—————

×100%

93ppt課件?

平板克隆形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長

的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗 成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細 胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度 不能過大。94ppt課件

軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗

基本步驟：

(1)取對數(shù)生長期細胞，用0.25%

胰蛋白酶消化并輕輕吹打，

使之成為單細胞，作活細胞計數(shù)

，用含20%胎牛血清的

DMEM培養(yǎng)液調整細胞密度至1×10

6

細胞/L。然后根據(jù) 實驗要求作梯度倍數(shù)稀釋。

(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊 脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會凝固。95ppt課件(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和

2×DMEM培養(yǎng)基(含有

2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，

可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用

。(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基在無菌 試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細胞懸液，充 分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙 瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃5%CO2溫箱中 培養(yǎng)10～14天。

(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數(shù)。計算 形成率。96ppt課件

?

軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細胞和轉化細胞系。 試驗中瓊脂與細胞相混時

，瓊脂溫度不宜超過40

℃。接種細胞的密度每平方厘米不超過35

個，

一般6cm的平皿接種1000

個細胞。正常細胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗。97ppt課件5.

細胞周期

三、培養(yǎng)細胞的檢測指標

mitoses，PLM）：

?

標記有絲分裂百分率法（percentage

labeled

?

對測定細胞進行脈沖標記、定時取材、利用放射自顯 影技術顯示標記細胞，通過統(tǒng)計標記有絲分裂細胞百 分數(shù)的辦法來測定細胞周期

。放射標記物為

3

H或者

14

C標記的TdR。98ppt課件99ppt課件T

G2

+1/2T

M

T

G2

100

50

0

T

M

T

s

T

c

常以T

C

-（T

G2

+T

M

+T

S

）的方式求出T

G1100ppt課件101ppt課件6.

MTT法測定細胞活力三、培養(yǎng)細胞的檢測指標試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍，

四唑鹽比色法的原理：活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將

四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物甲臜（formazan)

，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物

，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定

OD值。MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒性102ppt課件操作步驟：（1）細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；10

3

-10

4

細胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗目的決定培養(yǎng)時間）（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／

孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時。（3）吸出孔內培養(yǎng)液后，加入DMSO

液（150微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結晶物溶解。（4）酶標儀檢測各孔OD值（檢測波長570

納米）。記錄結果，繪制細胞生長曲線。每隔24小時測量一個點，3個平行樣品！103ppt課件視頻：藥物對細胞增殖的影響——細胞生物學實驗教學案例

.wmv

RNAi基因抑制對細胞生長和增殖的影響

.ppt

基因抑制對細胞生長和增殖的影響.ppt104ppt課件

離體活細胞染 色觀察中性紅染色中性紅是常用的活體染色染料，常用的濃度為1:10000，用生理鹽水(或Hanks液)溶解后進行高壓蒸氣滅菌暗處存放，可直接浸染活體細胞顯微鏡下觀察或用于細胞的病毒蝕斑，肉眼計數(shù)空斑數(shù)目。因其毒性大，染色后細胞不能再培養(yǎng)。105ppt課件臺盼藍染色細胞死活鑒定——

染料排除檢測法

用0.5%濃度的臺盼藍（Trypan

blue

）,用PBS配制，室溫保存，該染料只對死細胞著色，可測定活細胞數(shù)和計算存活百分率。

106ppt課件熒光染料染色觀察

溴化乙錠（EB）和碘化丙啶（PI）染色嵌入核酸雙鏈之間，只能標記死細胞?。t色熒光）Acridine

Orange（AO

）丫啶橙可染活或死細胞，同時標記

DNA和RNADNA：綠色熒光

RNA：紅色熒光107ppt課件Chapter

3

細胞工程基本實驗技術◆實驗室設施與基本條件◆無菌技術◆顯微技術◆細胞觀察與分析◆細胞分離◆細胞保存與復蘇108ppt課件1、動物細胞的解離常用機械法和消化法進行當實驗室需要制備具有均勻細胞層的培養(yǎng)物；從單個細胞出發(fā)獲得細胞群體；從一定量的組織中獲得最多的細胞量時。109ppt課件機械法解離細胞胞懸液的分離。右的小塊。1）離心分離法：適用于血液、腹水等細2）切割分離法：將組織塊剪切成成1mm3左3）機械分散法：纖維成分很少的某些軟組織（脾、胸腺、腦等）。110ppt課件消化法解離細胞是破損細胞。3）螯合劑解離細胞法：分離效果差1）胰蛋白酶解離細胞法：所需時間較短，主要缺點2）膠原酶解離細胞法：這種方法對解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的。膠原酶最終濃度度200u/ml，36.5℃溫育，一般溫育4-48h。膠原酶和透明質酸酶協(xié)同作用有助于分離大鼠或兔的肝臟組織。（通常用1：1的EDTA和胰蛋白酶混合液）111ppt課件112ppt課件2、植物細胞的分離葉片是分離單細胞的最好材料機械法酶解法113ppt課件2-1、機械法

&Ball

(1968)

第一種方法：用刀片刮葉片

研究材料：花生成熟葉片

研究者和時間：Ball&Joshi

(1965)

、

Noggle

(1967)

、Joshi

114ppt課件具體方法撕去下表皮露出葉肉細胞用解剖刀刮下細胞115ppt課件第二種方法：葉片研碎、離心加研磨介質

研碎成粉過濾、離心116ppt課件2-2、酶解法

Takebe等（1968）最早報道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細胞加果膠酶過濾、離心117ppt課件3、單個細胞的獲得（1）有限稀釋法118ppt課件（1）流式細胞術（flow

cytometry

，F(xiàn)CM）

Fluorescence

activated

cell

sorter,

FACS

?

用途：對單個細胞進行快速定量分析與分選

的一門技術。?

原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成 包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出 散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉換為電信號，送入計算 機處理，輸出統(tǒng)計結果，并可根據(jù)這些性質分選出高純度 的細胞亞群，分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘 液，所用儀器稱為流式細胞計

（flowcytometer）。119ppt課件120ppt課件121ppt課件122ppt課件（3）顯微操作/注射儀123ppt課件（4）激光捕獲顯微分離系統(tǒng)

Laser

Capture

Microdissection

System

（LCM）可以準確、快速、無損傷地分離出純凈的特定細胞或組織，保證了實驗中細胞內生物分子的完整性

，以便用于后續(xù)的DNA、RNA和蛋白質分析。124ppt課件（5）免疫磁珠分離（immunomagnetic

beads

separation

）免疫磁珠法分離細胞是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。

125ppt課件Chapter

3

細胞工程基本實驗技術◆實驗室設施與基本條件◆無菌技術