金屬鈣離子與堿性蛋白酶的相互作用及應(yīng)用研究

金屬鈣離子與堿性蛋白酶的相互作用及應(yīng)用研究堿性蛋白酶是一種在堿性pH范圍內(nèi)，通過催化水解連接氨基酸的肽鍵來催化蛋白質(zhì)分解代謝的特殊蛋白質(zhì)。目前堿性蛋白酶廣泛用于生活的方方面面,包括洗滌劑制造，皮革加工，烘焙合成行業(yè)，因此成為最主要研究的蛋白酶類型。堿性蛋白酶的性能受到多種因素（pH、離子強(qiáng)度、溫度和機(jī)械操作）的影響。具有優(yōu)良性能的堿性蛋白酶可以進(jìn)一步優(yōu)化工藝流程，因此總是處于需求狀態(tài)。對(duì)于工業(yè)應(yīng)用，堿性蛋白酶在比較不利的環(huán)境下也必須具有活性，因此蛋白酶需具有工藝適應(yīng)性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性。由于傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的酶活性較低，再加上蛋白酶在環(huán)境條件極端改變時(shí)，其結(jié)構(gòu)變得無序，酶活性降低甚至喪失，使得堿性蛋白酶的應(yīng)用受到了限制?？紤]到這一點(diǎn)，堿性蛋白酶活性的激活劑成為蛋白酶制劑實(shí)際應(yīng)用中需要考慮的重要因素。研究表明Ca²⁺是大多數(shù)蛋白酶的激活劑和穩(wěn)定劑，來提高酶的活性，結(jié)合在蛋白酶特定位點(diǎn)以保護(hù)酶的構(gòu)象。因此,本論文選取已知結(jié)構(gòu)的堿性蛋白酶PB92作為研究對(duì)象，其結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)Ca²⁺結(jié)合位點(diǎn),選擇氯化鈣和甲酸鈣來研究金屬鈣離子對(duì)堿性蛋白酶的作用。本文主要研究了氯化鈣和甲酸鈣對(duì)堿性蛋白酶PB92活性的影響，通過動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)和相互作用的熒光光譜探討了二者相互作用的機(jī)理。第一，通過測(cè)定加入不同濃度的氯化鈣和甲酸鈣后，堿性蛋白酶PB92酶活力的變化，得到1mmol/L到5mmol/L濃度范圍內(nèi)的氯化鈣和甲酸鈣在溫度40°C、pH10.5下對(duì)蛋白酶的酶活均有促進(jìn)作用，其中氯化鈣相對(duì)甲酸鈣對(duì)堿性蛋白酶PB92酶活的促進(jìn)作用更加明顯。第二，測(cè)定了加入不同濃度Ca²⁺后,堿性蛋白酶PB92粒徑和蛋白酶溶液電位的變化。加入不同濃度Ca²⁺后粒徑變化表明，Ca²⁺的加入使得堿性蛋白酶PB92的平均粒徑減小，疏水結(jié)構(gòu)逐漸向蛋白酶內(nèi)部轉(zhuǎn)移，從而蛋白酶的結(jié)構(gòu)更為緊密，有利于蛋白酶酶活力的提高。加入不同濃度Ca²⁺后蛋白酶溶液電位變化表明，隨著濃度逐漸增大Ca²⁺所帶的正電荷使帶負(fù)電荷的堿性蛋白酶逐漸趨向于電中性，其結(jié)果是雙電層變薄,Zeta電位負(fù)值逐漸減小,消除了帶電基團(tuán)對(duì)酶的不利影響，有利于酶活力的保持。第三,研究了Ca²⁺與堿性蛋白酶PB92結(jié)合后熒光強(qiáng)度的變化，發(fā)現(xiàn)Ca²⁺對(duì)堿性蛋白酶PB92具有一定的猝滅作用。根據(jù)Stern-Volmer公式對(duì)其猝滅機(jī)理的探討,得到了Ca²⁺與堿性蛋白酶PB92的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=1.90,結(jié)合常數(shù)K_b=6.03X10⁵L/mol,確定了Ca²⁺對(duì)堿性蛋白酶的猝滅機(jī)制為單一的靜態(tài)猝滅，且Ca²⁺與堿性蛋白酶的結(jié)合能力很強(qiáng)。通過Ca²⁺與堿性蛋白酶計(jì)算得到的熱力學(xué)參數(shù)分析可知Ca²⁺與堿性蛋白酶通過靜電作用力形成穩(wěn)定的復(fù)合物，且結(jié)合過程能夠自發(fā)進(jìn)行。最后,研究了Ca²⁺提高堿性蛋白酶催化活性在洗滌劑中的應(yīng)用。研究表明其他洗滌條件相同時(shí)，添加蛋白酶的洗滌劑和添加加鈣蛋白酶的洗滌劑對(duì)國(guó)標(biāo)蛋白污布JB02和自制血漬污布的去污效果明顯高于未添加蛋白酶PB92及Ca²⁺的洗滌劑。洗滌效果（好一差）排序均為:添加加鈣蛋白酶PB92的洗滌劑>添加蛋白酶PB92的洗滌劑>市售洗滌劑。通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，蛋白污布纖維表面和縫隙中的蛋白污漬被去除。尤其是在添加蛋白酶PB92的洗滌劑、添加加鈣蛋白酶PB92的洗滌劑中洗滌后，污布單根纖維表面變得光滑明亮,并且纖維排列也較整齊分明。由洗滌前后ATR-FTIR圖變化可知，Ca²⁺與堿性蛋白酶PB92協(xié)同作用于國(guó)標(biāo)污布JB02和血漬污布的污漬，針對(duì)性的催化水解連接氨基酸的肽鍵來