實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用摘要:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)通過(guò)檢測(cè)PCR產(chǎn)物中熒光訊號(hào)強(qiáng)度來(lái)達(dá)到定量的目的,該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),目前已在動(dòng)植物基因工程,微生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。本文對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理，檢測(cè)方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了評(píng)述,重點(diǎn)及創(chuàng)新點(diǎn)是對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，食品行業(yè)，植物方面的應(yīng)用進(jìn)行了比較全面的綜述,并對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的普及應(yīng)用及領(lǐng)域的前景做了進(jìn)一步的展望。關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光定量PCR；應(yīng)用；展望Researchprogressandapplicationofreal-timePCRtechnologyAbstract:Real-timePCRtechnologytodetectPCRproductbyfluorescencequantitativesignalstrengthtoachievethepurpose,thetechnologynotonlytoachievethePCRfromqualitativetoquantitativeleap,andcomparedwithconventionalPCR,itismorespecific,effectivesolutiontoPCRcontaminationproblem,degreeofautomation,hasbeenwidelyusedingeneticengineeringofplantsandanimals,microbesandmedicinefields.Inthispaper,theprincipleofreal-timePCRtechnology,principles,testingmethods,advantagesanddisadvantagesarereviewed,thefocusandinnovationisareal-timePCRtechnologyinthefieldofmedicine,foodindustry,plantaspectsoftheapplicationofamorecomprehensiveoverview,prospectsandreal-timePCRtechnologyinthefieldofuniversalapplicationandmadeafurtheroutlook.Keywords:Real-timequantitativePCR;application;Outlook聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)自1985年問(wèn)世以來(lái)，以其靈敏性高、特異性強(qiáng)和速度快在分子生物學(xué)等科研領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。但是，由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)不能準(zhǔn)確定量，在操作過(guò)程中易受污染而使假陽(yáng)性率偏高；因此，使其應(yīng)用受到限制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)擁有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為了分子生物學(xué)研究的重要工具。文章對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理、檢測(cè)方法、定量方法及其應(yīng)用進(jìn)行了綜述。1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)概述1.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法[1]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，使產(chǎn)物的數(shù)量與檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，從而得出產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線如圖1。在PCR反應(yīng)早期,不能將產(chǎn)生熒光的水平與背景明顯區(qū)別,之后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺(tái)期,因此可以在指數(shù)期的某一點(diǎn)上檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量,并由此推斷起始模板含量。為了準(zhǔn)確判斷樣品中某基因產(chǎn)物的起始拷貝數(shù)，熒光定量PCR采用參數(shù)“Ct”值，Ct值也稱(chēng)閾值循環(huán)(thresholdcycle),指PCR循環(huán)過(guò)程中,熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù),也就是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究結(jié)果表明,每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小[2]。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)[3]。新近Roche公司研發(fā)并建立了人類(lèi)和鼠的通用探針庫(kù),其探針是由鎖定核酸組成。他們通過(guò)分析人的轉(zhuǎn)錄組中所有不同的可能的8至9堿基序列,按照他們?cè)谵D(zhuǎn)錄組中出現(xiàn)的頻率分類(lèi),找出最普便的8至9堿基序列模式制備成通用探針;每一個(gè)探針可以與7000個(gè)轉(zhuǎn)錄子雜交。這種探針的特異性由探針和引物共同實(shí)現(xiàn)。LNA是一種雙RNA聚合的類(lèi)似物,其2p-位的氧原子與核糖4p-碳原子形成亞甲基的橋鍵,并分別在5p和3p標(biāo)記上熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)；LNA單體摻入寡核苷序列可以增加形成體的Tm值,其穩(wěn)定性比PNA高(PNAS2000,97:5633-5638)1因LNA與DNA雜交較DNA與DNA、DNA與RNA甚至PNA與DNA雜交有更高的親和性,故這種探針?lè)€(wěn)定性最好；而且探針實(shí)現(xiàn)了設(shè)計(jì)迅速簡(jiǎn)單、低成本的水解探針特點(diǎn)。一般上其公司網(wǎng)站后,輸入基因序列號(hào),就能訂制,無(wú)需檢測(cè)引物二聚體和非特異性片段。因此LNA技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高熔點(diǎn)和高特異性結(jié)合特點(diǎn)；可以用于所有的熒光定量PCR儀。（6）Simple探針最近Roche公司生產(chǎn)一種簡(jiǎn)單探針,這種探針只在5'端標(biāo)有報(bào)告熒光,在報(bào)告熒光和5'端之間連接一種稱(chēng)作“l(fā)inker”的結(jié)構(gòu),只有在變性階段,探針與目標(biāo)序列互補(bǔ)結(jié)合時(shí),引起“l(fā)inker”結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光得以顯現(xiàn)。這種探針的好處是不用淬滅基團(tuán),從而無(wú)背景熒光。1.2.2雙鏈DNA（目前用于實(shí)時(shí)PCR的dsDNA結(jié)合染料,主要有SYBRGreenI和LCGreenTMI[7]。（1）SYBRGreenI是一種非飽和菁類(lèi)熒光素,可以嵌合于DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的小溝中。其處于游離狀態(tài)時(shí),檢測(cè)不到熒光信號(hào),當(dāng)結(jié)合dsDNA后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),即被熒光探測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到,熒光強(qiáng)度的增加與初始模板量相關(guān),可以進(jìn)行定量DNA分析,已有應(yīng)用于臨床診斷和科學(xué)研究中的報(bào)道。SYBRGreen染料法與探針?lè)ㄏ啾?其優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)方法簡(jiǎn)便,同時(shí)降低了檢測(cè)成本。但是,由于該染料能夠結(jié)合任何dsDNA分子,因此不能保證PCR的特異性?？梢酝ㄟ^(guò)優(yōu)化PCR的反應(yīng)條件,減少或去除非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的產(chǎn)生,另外,也可以借助融解曲線分析法來(lái)區(qū)分非特異性產(chǎn)物和引物二聚體而進(jìn)行定性診斷。（2）LCGreenTMI是最新出現(xiàn)的一種dsDNA結(jié)合染料,與SYBRGreenI相比,該染料是一種飽和結(jié)合染料,能夠完全結(jié)合dsDNA分子,可直接加入PCR反應(yīng)體系中,高濃度的LCGreenTMI不會(huì)抑制PCR反應(yīng)。已有文獻(xiàn)報(bào)道在PCR反應(yīng)體系中加入LCGreenTMI,使用一對(duì)引物,一個(gè)不作標(biāo)記的探針,結(jié)合常規(guī)融解曲線或僅使用一對(duì)引物,PCR結(jié)束后通過(guò)分析融解曲線的形狀和融解溫度(Tm值)的大小,對(duì)純合子和雜合子以及寡核苷酸序列多態(tài)性(SNP)進(jìn)行鑒別。LCGreenTMI染料法簡(jiǎn)便、快速、精確性高,預(yù)期將會(huì)有很好的應(yīng)用前景。1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展PCR技術(shù)發(fā)明以來(lái),研究人員一直致力于用其進(jìn)行核酸精確定量。1991年Holland等[8]首次運(yùn)用不可延伸的寡核苷酸雜交探針與模板結(jié)合,然后利用DNA聚合酶的5'→3'核酸外切酶活性將探針切斷,使探針的能量傳遞結(jié)構(gòu)被破壞發(fā)出熒光來(lái)定量PCR產(chǎn)物。1992年Higuchi等[9,10]在PCR反應(yīng)管中加入EB,反應(yīng)進(jìn)行過(guò)程中,PCR產(chǎn)物增加,EB與DNA雙鏈結(jié)合發(fā)出熒光強(qiáng)度也逐漸增加.他們通過(guò)連續(xù)照相動(dòng)態(tài)觀察熒光強(qiáng)度的變化,并以此定量PCR產(chǎn)物的多少,成為最早的實(shí)時(shí)定量PCR。1996年Heid[11]等首先報(bào)道了TaqmanPCR的原理及方法。同年,美國(guó)AppliedBiosystems公司推出商用實(shí)時(shí)定量PCR(TaqmanPCR)系列。之后,人們又設(shè)計(jì)出不同的熒光探針,如分子信標(biāo)技術(shù)(molecularbeacon)[12]、LightcyclerPCR[13,14]等。隨著研究的不斷進(jìn)展,研究人員不僅定量DNA分子,還定量RNA分子,從而進(jìn)一步定量基因的表達(dá)[15]。1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法有2種，即絕對(duì)定量法和相對(duì)定量法[16]。絕對(duì)定量法是用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)推算未知的樣本量；相對(duì)定量法是在一定樣品中靶序列相對(duì)于另一參照序列量的變化，由于每個(gè)模板Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，利用已知起始DNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)品即可繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.4.1絕對(duì)定量法絕對(duì)定量法指的是用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)推算未知樣本的量，此方法要預(yù)先知道標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度并作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的Ct值為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)未知樣品進(jìn)行定量時(shí)根據(jù)未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中推出樣品的起始拷貝數(shù)。1.4.2相對(duì)定量法（1）比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對(duì)定量法相對(duì)定量法指的是在一定樣本中靶序列相對(duì)于另一參照樣本量的變化。由于該方法中量的表達(dá)是相對(duì)于某個(gè)參照物而言的；因此，相對(duì)定量法的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較容易制備，對(duì)于所用的標(biāo)準(zhǔn)品只需知道其稀釋度即可。在整個(gè)試驗(yàn)中，待測(cè)樣本靶序列的量來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后必須除以參照物的量，其他的樣本為參照物量的n倍。在試驗(yàn)中為了準(zhǔn)確加入反應(yīng)體系的RNA或DNA，通常在反應(yīng)中擴(kuò)增1個(gè)內(nèi)源管家基因作為參照基因，由于管家基因在各種組織中的恒定表達(dá)，所以可用來(lái)作為標(biāo)準(zhǔn)，比較來(lái)源不同的樣本目的基因表達(dá)量的差異。管理基因是用于比較目的基因拷貝數(shù)，根據(jù)內(nèi)參照補(bǔ)償待測(cè)樣本核酸抽提過(guò)程中造成的目的基因損失，反應(yīng)體系內(nèi)是否存在擴(kuò)增抑制因素及參照物標(biāo)準(zhǔn)化等[17]。（2）比較Ct值的相對(duì)定量法該方法是同時(shí)擴(kuò)增待測(cè)靶基因片段和內(nèi)參照基因片段。這2個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)可以在2個(gè)反應(yīng)管中分別進(jìn)行，也可以在同1個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行，測(cè)得兩者的Ct值之差即ΔCt。該方法不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，與標(biāo)準(zhǔn)曲線法不同之處在于其運(yùn)用了數(shù)學(xué)公式來(lái)計(jì)算相對(duì)量，前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加1倍的產(chǎn)物，以PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到Ct值來(lái)估算起始模板的量，一個(gè)循環(huán)(Ct=1)相當(dāng)于起始模板數(shù)的2倍。此方法節(jié)省試劑，操作簡(jiǎn)便，但由于是以靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率基本一致為前提的，效率的偏移會(huì)影響對(duì)實(shí)際拷貝數(shù)的估計(jì)；因此，如何優(yōu)化反應(yīng)體系，使得目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相等是該方法的難點(diǎn)。2．實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用.2.1醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的運(yùn)用應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病原DNA不僅可以定性,還可以檢測(cè)出病原量的多少,為臨床診斷提供了強(qiáng)有力的依據(jù)?，F(xiàn)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR已經(jīng)應(yīng)用于許多病原體的檢測(cè),比如乙型肝炎病毒DNA[18]、尖銳濕疣皮損中HPVD-NA[19]、與鼻咽癌關(guān)系密切的EB病毒(Epstein-Banvirus)[20]、豬內(nèi)生逆轉(zhuǎn)錄酶病毒[21]。Andersen等[22]用定量PCR的方法測(cè)定了結(jié)直腸癌淋巴結(jié)的癌胚抗原(CEA)mRNA的表達(dá)量,可作為診斷癌癥微轉(zhuǎn)移的重要依據(jù)。Cassinat等[23]應(yīng)用RQ-PCR對(duì)t(15;17)NB4白血病細(xì)胞進(jìn)行了研究,其敏感性達(dá)10-6。Pongers-Willemse等[24]首先應(yīng)用RQ-PCR對(duì)4例前B細(xì)胞ALL中IgH/TCR重排進(jìn)行了研究,他們針對(duì)每個(gè)病例設(shè)計(jì)一個(gè)與連接區(qū)互補(bǔ)的等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針和各自特異性的一對(duì)引物,比較了RQ-PCR與斑點(diǎn)雜交和液相雜交檢測(cè)的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其敏感性與斑點(diǎn)雜交相似(10-3~10-5),但低于液相雜交。劉敬忠等報(bào)道使用dsDNA結(jié)合染料SYBRGreenI，結(jié)合融解曲線分析對(duì)A-地中海貧血純合子、雜合子作出診斷[25]。使用雙色熒光標(biāo)記探針,結(jié)合不同的引物設(shè)計(jì)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)某些先天性疾病的定量檢測(cè)。趙衛(wèi)東等[26]通過(guò)熒光定量的方法對(duì)各細(xì)胞株的轉(zhuǎn)錄因子T-boxex-pressioninTcells(T-bet)、GATA3的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),建立了腫瘤細(xì)胞株轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的熒光定量PCR檢測(cè)方法,較常規(guī)PCR方法更為簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確,有很好的應(yīng)用前景。2.2食品研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以對(duì)食品中致病菌進(jìn)行檢測(cè)。李光偉[27]等采用沙門(mén)菌fimY基因序列，設(shè)計(jì)特異引物和探針，建立了檢測(cè)食品中沙門(mén)菌的FQ-PCR方法。胡建華等根據(jù)Grenbank公布的志賀菌ipaH基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，篩選合適的DNA模板制備方法嗎，以SABHGreen染料監(jiān)控?zé)晒庾兓腇Q-PCR與常規(guī)PCR結(jié)合,檢測(cè)培養(yǎng)液和牛奶陽(yáng)性樣品中的志賀菌[28]。FQ-PCR技術(shù)除了在微生物檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，也是食品微生物研究中不可缺少的工具，是作為微生物生理代謝、菌群分布、菌株鑒定等的研究工具。同時(shí)PCR技術(shù)是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品最方便快捷的方法，基于轉(zhuǎn)基因特異DNA片段的FQ-PCR篩選方法已被一些國(guó)家作為相關(guān)食品法規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。日本和美國(guó)等13個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合采用FQ-PCR方法對(duì)5種轉(zhuǎn)基因玉米和1種轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行了定量研究。結(jié)果表明這種方法可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物標(biāo)識(shí)制度的實(shí)際檢測(cè)[29]。2.3植物研究上的運(yùn)用傳統(tǒng)的病原菌檢測(cè)方法依賴(lài)于癥狀觀察、孢子或菌落計(jì)數(shù)等手段。與傳統(tǒng)方法相比，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)，不受植物癥狀的限制，能區(qū)分細(xì)微差異。目前該技術(shù)在植物病原菌檢測(cè)中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。如伍永明等[30]根據(jù)西瓜細(xì)菌性果斑病菌（Acidovoraxavenaesubsp.citrulli）與相關(guān)細(xì)菌16SrDNA序列差異，設(shè)計(jì)出對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌具有穩(wěn)定點(diǎn)突變特異性探針Aac-probe，利用該探針對(duì)23種供試菌株進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試驗(yàn)。植物抗病性及其機(jī)制研究一直是當(dāng)今植物病理學(xué)和植物抗病育種研究工作中的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)問(wèn)題。而抗病基因的研究是植物抗病性及其機(jī)制研究的基礎(chǔ)，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)可檢測(cè)轉(zhuǎn)入抗病基因的植株中病毒的積累[31]，從而比較抗病植株與感病植株之間的病毒復(fù)制和積累的差異，為抗病基因抑制病毒的復(fù)制和運(yùn)動(dòng)提供強(qiáng)有力的分子證據(jù)。3．實(shí)時(shí)熒光定量PCR的展望實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)自1996面世以來(lái),短短的幾年就被廣泛應(yīng)用到生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域,涉及到的范圍包括DNA、mRNA和病毒荷載量的定量,核酸多態(tài)性分析,基因突變分析等多個(gè)領(lǐng)域。但隨著該技術(shù)應(yīng)用的領(lǐng)域范圍不斷擴(kuò)大延伸，研究的層次不斷深入，它也開(kāi)始顯現(xiàn)出不足:(1)降低探針制備的成本或發(fā)掘新的熒光染料；(2)進(jìn)一步提高分析的靈敏度及實(shí)驗(yàn)重復(fù)性；(3)樣品制備簡(jiǎn)單化,程序化和機(jī)械化以節(jié)約時(shí)間降低成本。相信,實(shí)時(shí)熒光定量PCR將以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在分子生物學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面發(fā)揮更多更大的作用。另外,基因分析的定量化和均相化是未來(lái)基因診斷的發(fā)展趨勢(shì),目前在該領(lǐng)域的研究剛剛開(kāi)始,仍有許多問(wèn)題需要解決,如分析靈敏度及重復(fù)性問(wèn)題、自動(dòng)化儀器和試劑成本、樣品處理及多基因同時(shí)分析等問(wèn)題。生物芯片技術(shù)與熒光探針定量技術(shù)的結(jié)合將有助于上述問(wèn)題的解決[32],屆時(shí)將大大推動(dòng)該技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用普及,特別是臨床診斷領(lǐng)域的推廣。隨著科學(xué)技術(shù)與科學(xué)知識(shí)的增長(zhǎng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)將繼續(xù)被改進(jìn)，新的問(wèn)題被攻克，從而建立更新、更便捷、更完善的PCR體系，并應(yīng)用到更廣、更深的科學(xué)領(lǐng)域。參考文獻(xiàn)[1]歐陽(yáng)松應(yīng),楊冬,歐陽(yáng)紅生等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J].生命的化學(xué),2004,24(1):742－761.[2]VerderioP,PizzaMiglioS,GalloF,etal.FCI:anR－basedalgorithmforevaluatinguncertaintyofabsolutereal－timePCRquantification[J].BMCBioinformatics,2008,9:13.[3]WolfgangK,JonathanN,KarasS,etal1Fluorogenicprimersforreal-timePCRAmericanBiotechnologyLaboratory,2003,(7):52-56[4]王愛(ài)民.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(TaqMan)法測(cè)定外源基因的拷貝數(shù)[J].廣西植物,2009,29(3):408－412.[5]BonnetG,TyagiS,LibchaberA,etal.ThermodynamicbasisoftheenhancedspecificityofstructuredDNAprobes[J].ProcNatlAcadSciUSA,1999,96:6171－6176.[6]BrechtbuehlK,WhalleySA,DusheikoGM,etal.Arapidreal－timequantitativepolymerasechainreactionforhepatitisBvirus[J].JVirolMethods,2001,93(1/2):105－113.[7]WittwerCT,ReedGH,GundryCN,etal.1High-resolutiongenotypingbyampliconmeltinganalysisusingLCGreen1ClinChem,2003,49(6):853-860.[8]HollandPM,AbramsonRD,WatsonR,etal.Detectionofspecificpolymerasechainreactionproductbyutilizingthe5'-3'exonucleaseactivityofThermusaquaticusDNApolymerase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991,88:7276－7280.[9]HiguchiR,DollingerG,WalshPS,etal.SimultaneousamplificationanddetectionofspecificDNAsequences.Biotechnology,1992,10:413.[10]HiguchiR,FocklerC,etal.KineticPCRanalysis:real-timemonitoringofDNAamplificationreactions.Biotechnology,1993,11:1026－1030.[11]HeidCA,StevensJ,LivakJK,etal.Real－timequantitativePCR[J].GenomeRes,1996,6:9862－9941.[12]TyagiS,KramerFR.Molecularbeaconsprobes:thatfluoresceuponhybridization.NationalBiotechnology,1996,14:303－308.[13]WittwerCT,HerrmannMG,MossAA,etal.ContinuousfluorescencemonitoringofrapidcycleDNAamplification.Biotechniques,1997,22:130－138.[14]WittwerCT,RirieKM,AndrewRV,etal.Thelightcycler:amicrovolumemultisamplefluorimeterwithrapidtemperaturecontrol.Biotechnique,1997,22:176－181.[15]MayerZ,FrberP,GeisenR.MonitoringtheproductionofaflatoxinB1inwheatbymeasuringtheconcentrationofnor-1mRNA.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2003,69(2):1154－1158.[16]鄧文星,張映.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)綜述[J].生物技術(shù)通報(bào),2007,27(5):93－96.[17]胡秀華,何苗,劉麗等.水中輪狀病毒實(shí)時(shí)定量PCR外標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建[J].環(huán)境科學(xué),2008,29(2):380－385.[18]CuiZ,WangS.Real-timefluorescencequantitativePCRindeterminationofhepatitisBvirusDNA[J].JBengbuMedCol,2004,29(1):67-68.[19]LuJY,HuangJH,ChenJ,etal.QuantitativedetectionofHPV-DNAfromtheskinlesionsofCondylomaacuminataanditsclinicalsignificance[J].ClinRes,2003,20(8):569-571.[20]TongJH,TsangRK,LoKW,etal.QuantitativeEpsteinBarrvirusDNAanalysisanddetectionofgenepromoterhypermethylationinnasopharyngeal(NP)brushingsamplesfrompatientswithNPcarcinoma[J].ClinCancerRes.,2002,8(8):2612-2619.[21]ShahCA,BoniJ,BissetLR,etal.Ultrasensitiveandspecificdetectionofporcineendogenousretrovirususingasequence-capturereal-timePCRapproach[J].VirolMethods,2003,109(2):209-216.[22]AndersenCL,JeusenJL,OrntoftTF.Normalisationofreal-timequantitativereversetranscription-PCRdata:amodel-basedvarianceestimationapproachtoidentifygenessuitedfornormalizationappliedtobladderandcoloncancerdatasets[J].CancerRes.,2004,64:5245-5250.[23]CassinatB,ZassadowskiF,BalitrandN,etal.Quantitationofminimalresidualdiseaseinacutepromyelocyticleukemiapatientswith(15;17)translocationusingreal-timeRT-PCR.Leukemia,2000,