《天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定 高效液相色譜法》編制說明

農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目《天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定高效液相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)制定編制說明項(xiàng)目名稱：天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定高效液相色譜法項(xiàng)目序號(hào)：14202184提出單位：中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局歸口單位：全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC76）起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、全國(guó)畜牧總站、山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)主要起草人：郝智慧、高雪嫣、李燕松、戰(zhàn)余銘、單麗燕、劉暢、唐啟和實(shí)施時(shí)間：

目 次1工作簡(jiǎn)況

天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定高效液相色譜法1工作簡(jiǎn)況1.1任務(wù)來源本文件由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局提出，計(jì)劃編號(hào)為“14202184”，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、全國(guó)畜牧總站、山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)承擔(dān)并組織相關(guān)技術(shù)人員對(duì)《天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定高效液相色譜法》進(jìn)行了編制。1.2制定背景在畜禽飼料“禁抗令”全面實(shí)行的背景下，天然植物飼料原料成為了提高生長(zhǎng)性能、替抗的重要選擇。天然植物作為飼料使用在我國(guó)有著悠久的歷史，我國(guó)古代勞動(dòng)人民在長(zhǎng)期飼養(yǎng)畜禽的過程中，積累總結(jié)了大量經(jīng)驗(yàn)?？娠曈锰烊恢参飦碓从诖笞匀?，具有天然性、多功能性和毒副作用小等特點(diǎn)，近年來被大量開發(fā)作為飼用抗生素替代品，應(yīng)用對(duì)象從雞、豬、牛、羊、犬、貓、兔等畜禽逐漸拓寬到水產(chǎn)動(dòng)物和特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物；應(yīng)用目的包括補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)成分、提高飼料利用率、增加動(dòng)物產(chǎn)品產(chǎn)量、改善動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量和飼料品質(zhì)等方面。但天然植物飼料原料沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量參差不齊，規(guī)范天然植物飼料原料的質(zhì)量要求亟待解決。我國(guó)在農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第1773號(hào)公告《飼料原料目錄》中規(guī)定了117種可飼用天然植物原料，這117種天然植物可以以單一、復(fù)配或混合的形式進(jìn)行直接添加使用。甘草（Glyeyrrhiza）為“豆科甘草屬植物甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.）、脹果甘草（GlycyrrhizainflataBatal.）或洋甘草（GlycyrrhizaglabraL.）的干燥根和根莖”，是重要的可飼用天然植物原料品種。目前，以甘草為單一或復(fù)配的天然植物飼用原料產(chǎn)品較為普遍。有研究表明，甘草飼料原料能夠有效提高羊的生產(chǎn)性能[1]、提高斷奶仔豬的抗病力[2]、促進(jìn)大黃魚生長(zhǎng)[3]、遏制肉雞體內(nèi)有害菌群的繁殖[4]、減少反芻動(dòng)物胃黏膜的損傷[5-6]等。同時(shí)甘草具有調(diào)和諸藥之功效，使得天然植物飼料原料甘草在天然植物原料中廣泛應(yīng)用。甘草主產(chǎn)于內(nèi)蒙古西部、寧夏、甘肅、新疆等地，東北、陜西、青海、河北、山西等地亦產(chǎn)。甘草中含有甘草酸、甘草次酸等三萜及其皂苷類成分，同時(shí)含有甘草素、異甘草素、新異甘草苷等黃酮類成分。由于其明顯的種屬、地域、生長(zhǎng)環(huán)境等差別，造成甘草中的有效成分及含量具有顯著的差異。目前，市場(chǎng)上，以甘草及其提取物作為飼料原料的產(chǎn)品種類繁多，甘草列入《飼料原料目錄》而未列入其第四部分《單一飼料品種》，因此，甘草的生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)無需辦理《飼料生產(chǎn)許可證》，應(yīng)符合《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》、《飼料標(biāo)簽》等強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的要求。前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)400余家生產(chǎn)飼料原料的企業(yè)，不同企業(yè)之間的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)千差萬別，尚缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，造成市場(chǎng)上甘草可飼用植物原料的質(zhì)量參差不齊，非常不利于飼料添加劑質(zhì)量安全監(jiān)管、養(yǎng)殖業(yè)安全使用。目前我國(guó)沒有檢測(cè)可飼用天然植物原料甘草的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布。國(guó)內(nèi)已發(fā)表的有關(guān)于甘草的標(biāo)準(zhǔn)為“GB/T19618—2004甘草”，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范了甘草為“豆科甘草屬植物甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.）、脹果甘草（GlycyrrhizainflataBatal.）及光果甘草（GlycyrrhizaglabraL.）干燥根及根莖的加工產(chǎn)品”，“內(nèi)在質(zhì)量檢查”項(xiàng)規(guī)定了甘草主要指標(biāo)成分“甘草酸”的測(cè)定方法。甘草酸（GlycyrrhizicAcid）是衡量甘草質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。同時(shí)，甘草酸也是甘草中最主要的活性成分[7]。如表2所示，在甘草、甘草提取物或含甘草藥物的研究中，均是以甘草酸作為指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量控制。文獻(xiàn)名指標(biāo)成分HPLC測(cè)定甘草提取物中甘草酸的含量甘草酸HPLC測(cè)定川芎茶調(diào)散中甘草酸的含量甘草酸HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量甘草酸HPLC法測(cè)定內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量甘草酸甘草酸鉍散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究甘草酸高效液相色譜法測(cè)定清肺顆粒中甘草酸的含量甘草酸經(jīng)典名方溫經(jīng)湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜建立及9種成分含量測(cè)定甘草酸利尿合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析甘草酸UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)參芪健胃顆粒中芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨的含量甘草酸考慮到飼料行業(yè)的整體情況和作為飼料原料的產(chǎn)品屬性，我們選擇了甘草酸作為指標(biāo)成分對(duì)可飼用天然植物原料中的甘草質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)量控制。目前國(guó)內(nèi)已發(fā)表的國(guó)家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)涉及甘草酸的標(biāo)準(zhǔn)主要有GB/T22248—2008保健食品中甘草酸的測(cè)定[8]、SN/T3854—2014出口食品中天然甜味劑甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸的測(cè)定高效液相色譜法[9]。在《中國(guó)藥典》2000年版和《中國(guó)獸藥典》2000年版中甘草酸作為甘草含量測(cè)定的單一指標(biāo)成分，此后的《中國(guó)藥典》和《中國(guó)獸藥典》增加了甘草苷和甘草酸共同作為甘草含量測(cè)定項(xiàng)，均為高效液相色譜法。隨著天然植物飼料原料在飼料中的普遍應(yīng)用，甘草酸作為主要的活性指標(biāo)成分之一，尚未制定天然植物飼料原料中甘草酸通用的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法，高效液相色譜法是目前更適合產(chǎn)業(yè)實(shí)際并且具有簡(jiǎn)單、快速，且靈敏度高特點(diǎn)。建立一種高效、靈敏、便捷的檢測(cè)方法作為指導(dǎo)一線檢測(cè)重要活性成分指標(biāo)甘草酸，是指導(dǎo)使用天然植物飼料原料和安全使用提供有力手段。本團(tuán)隊(duì)前期通過收集和監(jiān)測(cè)分析大批量的甘草可飼用植物原料和相關(guān)含甘草的飼料原料樣品，通過對(duì)這些樣品進(jìn)行含量測(cè)定，也確定了以甘草酸為指標(biāo)成分建立天然植物飼料原料中甘草酸高效液相色譜法，能夠更加科學(xué)合理的建立含甘草的天然植物飼料原料產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制。表SEQ表\*ARABIC1國(guó)內(nèi)外甘草相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)匯總序號(hào)標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)名稱檢測(cè)對(duì)象檢測(cè)方法1GB/T19618—2004甘草甘草酸高效液相色譜法2GB/T22248—2008保健食品中甘草酸的測(cè)定甘草酸高效液相色譜法3SN/T3854—2014出口食品中天然甜味劑甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸的測(cè)定高效液相色譜法甘草酸高效液相色譜法因此，針對(duì)上述產(chǎn)業(yè)實(shí)際需求，針對(duì)天然植物飼料原料的不同產(chǎn)品形式，如干燥物、粉碎物和粗提取物產(chǎn)品形式，及單一型和復(fù)配型產(chǎn)品中甘草酸的高效液相檢測(cè)方法進(jìn)行建立，明確色譜工作條件和參數(shù)，并對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行確定。擬制定《天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定高效液相色譜法》方法標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定作為可飼用天然植物原料使用的甘草的主要指標(biāo)成分甘草酸的質(zhì)量控制指標(biāo)和檢測(cè)方法，利用該法完成天然植物飼料原料中甘草酸的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)天然植物飼料原料質(zhì)量的規(guī)范化。這對(duì)規(guī)范天然植物原料生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)，保護(hù)畜禽養(yǎng)殖企業(yè)的利益和促進(jìn)我國(guó)可飼用天然植物原料產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。1.3起草過程及內(nèi)容1.3.1起草過程2020年8月，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、全國(guó)畜牧總站、山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)接到了農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定的任務(wù)后，成立了標(biāo)準(zhǔn)編制小組，主要由從事標(biāo)準(zhǔn)制修訂、儀器分析、具有豐富技術(shù)經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)研究人員組成。2020年9月，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)組織了有關(guān)的專家、主要標(biāo)準(zhǔn)起草人員召開了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定高效液相色譜法》編制項(xiàng)目的啟動(dòng)會(huì)，就《天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定高效液相色譜法》的國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)方法研究進(jìn)展、項(xiàng)目的主要工作內(nèi)容、技術(shù)路線等進(jìn)行了探討，認(rèn)真分析了技術(shù)方案的可行性，并結(jié)合國(guó)內(nèi)外發(fā)展趨勢(shì)、當(dāng)前行業(yè)存在的技術(shù)問題展開討論，確定了該標(biāo)準(zhǔn)制定的技術(shù)路線、技術(shù)內(nèi)容、分工以及時(shí)限要求等。確定了標(biāo)準(zhǔn)制定的技術(shù)路線和方案制定。2020年10月至2021年09月，標(biāo)準(zhǔn)編制小組在有關(guān)質(zhì)量檢測(cè)的基礎(chǔ)上，廣泛查閱國(guó)內(nèi)外研究的文獻(xiàn)資料、標(biāo)準(zhǔn)和其他權(quán)威部門出版物，主要參考《中國(guó)獸藥典》二〇〇五版二部[10]中的樣品前處理及高效液相檢測(cè)方法開展研究。標(biāo)準(zhǔn)編制小組購買標(biāo)準(zhǔn)品、試劑以及采集代表性的含甘草的單一型、混合型和復(fù)配型飼料原料樣品，開展了樣品前處理、色譜分離條件優(yōu)化、儀器條件優(yōu)化等工作，對(duì)建立的方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的方法學(xué)驗(yàn)證，包括準(zhǔn)確性、精密度、穩(wěn)定性以及樣品適用性等，隨后測(cè)定實(shí)際樣品，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了匯總分析。結(jié)合我國(guó)天然植物飼料原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)際情況，對(duì)相關(guān)研究成果進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，制定《天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定高效液相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)草案，形成征求意見稿。2021年10月至2022年6月，標(biāo)準(zhǔn)編制小組選擇了三家質(zhì)檢機(jī)構(gòu)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)文本進(jìn)行了驗(yàn)證，并征求了驗(yàn)證單位意見，根據(jù)專家意見進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明的修改完善。完成了標(biāo)準(zhǔn)草案及編制說明的編寫和實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證。同時(shí)以函審的方式廣泛征求相關(guān)科研院所的專家和有關(guān)企業(yè)技術(shù)人員的意見，通過意見反饋，進(jìn)行修改和完善，形成預(yù)審稿。2022年11月至2022年12月，組織專家評(píng)審，進(jìn)行會(huì)議審核，再次討論和征求專家意見，并進(jìn)行相應(yīng)的修改完善，最后形成送審稿，報(bào)全國(guó)飼料標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)。2023年3月1日，全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)微生物及酶制劑標(biāo)準(zhǔn)化工作組組織專家對(duì)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位起草的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定高效液相色譜法》（預(yù)審稿）進(jìn)行審查。2023年3月至2023年5月，根據(jù)全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)微生物及酶制劑標(biāo)準(zhǔn)化工作組專家建議對(duì)標(biāo)準(zhǔn)和編制說明進(jìn)行修改完善，形成公開征求意見稿。圖SEQ圖\*ARABIC1標(biāo)準(zhǔn)編制的技術(shù)路線1.3.2起草內(nèi)容建立天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定高效液相色譜法。飼料原料在進(jìn)行分析檢測(cè)前，根據(jù)“GB/T19424—2018天然植物飼料原料通用要求”[11]中天然植物飼料原料具體種類及市場(chǎng)調(diào)研結(jié)果，目前市場(chǎng)上用于天然植物飼料原料的樣品主要分為三類，即單一型（粉碎物或粗提物）天然植物飼料原料、復(fù)配型（粉碎物或粗提物）天然植物飼料原料、混合型天然植物飼料原料。標(biāo)準(zhǔn)編制小組陸續(xù)從全國(guó)各地收集各類天然植物飼料原料，共計(jì)93種樣品，用于本標(biāo)準(zhǔn)的方法開發(fā)、方法驗(yàn)證和實(shí)際樣品的測(cè)定。對(duì)初步建立的天然植物飼料原料中甘草酸前處理方法，以檢測(cè)含量為指標(biāo)，分別考察不同提取溶劑、提取體積、提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響。對(duì)天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定高效液相色譜方法，分別從專屬性、線性、檢出限、定量限、精密度、準(zhǔn)確度、耐用性、標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性等方面進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。本標(biāo)準(zhǔn)的主體內(nèi)容包括，范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、原理、試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、精密度等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于天然植物原料中甘草酸含量的測(cè)定。1.4起草單位本文件起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、全國(guó)畜牧總站、山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)。1.5主要起草人本文件主要起草人：郝智慧、高雪嫣、李燕松、戰(zhàn)余銘、單麗燕、劉暢、唐啟和。2行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)編制原則、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容及其確定依據(jù)2.1標(biāo)準(zhǔn)編制原則在編制過程中，標(biāo)準(zhǔn)編制小組查閱了國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)等資料，并對(duì)全國(guó)天然植物飼料原料及甘草作為飼料原料添加使用的市場(chǎng)規(guī)模進(jìn)行了調(diào)研，參考各部門制定的同類標(biāo)準(zhǔn)方法及飼料生產(chǎn)企業(yè)相關(guān)的產(chǎn)品質(zhì)控方法，遵循“先進(jìn)性、實(shí)用性、統(tǒng)一性和規(guī)范性”的原則，堅(jiān)持標(biāo)準(zhǔn)的可操作性，完成了天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定工作，形成了標(biāo)準(zhǔn)草案和編制說明。本標(biāo)準(zhǔn)編寫主要依據(jù)GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》[12]、GB/T20001.4—2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》[13]、GB/T27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》[14]以及GB/T19424—2018《天然植物飼料原料通用要求》[11]的要求進(jìn)行起草制定，并且按照GB/T27417—2017《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[15]對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了考察，確保方法的科學(xué)性、可行性和可靠性。依據(jù)高效液相色譜法檢測(cè)天然植物飼料原料中甘草酸的優(yōu)化試驗(yàn)、方法驗(yàn)證試驗(yàn)的數(shù)據(jù)及研究結(jié)果編制。利用高效液相色譜法，能夠快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)天然植物飼料原料中甘草酸的含量，通過檢測(cè)方法優(yōu)化和方法驗(yàn)證，本方法靈敏度高，能夠滿足檢測(cè)天然植物飼料原料中甘草酸含量檢測(cè)的要求。標(biāo)準(zhǔn)制定符合我國(guó)國(guó)情，滿足相關(guān)檢測(cè)要求，且普適性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，易于推廣。2.2新舊標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比問題迄今，我國(guó)尚無“天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定高效液相色譜法”國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或地方標(biāo)準(zhǔn)。本文件系首次制定，不存在新舊標(biāo)準(zhǔn)水平對(duì)比的問題。2.3制定本文件的主要內(nèi)容及其確定依據(jù)對(duì)甘草酸含量檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了查閱，目前已發(fā)表的國(guó)家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)涉及的檢測(cè)范圍有限，如：GB/T22248—2008保健食品中甘草酸的測(cè)定[8]、SN/T3854—2014出口食品中天然甜味劑甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸的測(cè)定高效液相色譜法[9]，尚未制定天然植物飼料原料中甘草酸的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法。通過查找甘草酸含量檢測(cè)相關(guān)文獻(xiàn)，不論是檢測(cè)含甘草酸的藥品、藥材還是提取物，針對(duì)甘草酸的分離和檢測(cè)絕大部分采用了高效液相色譜法（見表2）。并且高效液相色譜法是一種具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等特點(diǎn)的檢測(cè)方法，能夠?qū)μ烊恢参镲暳显现械挠行С煞诌M(jìn)行測(cè)定。因此，通過選擇利用高效液相色譜法，建立一種高效、靈敏、便捷的甘草酸檢測(cè)方法，作為指導(dǎo)一線檢測(cè)重要活性成分指標(biāo)甘草酸的方法，可為天然植物飼料原料的質(zhì)量檢測(cè)和監(jiān)測(cè)提供指導(dǎo)。表SEQ表\*ARABIC2以“甘草酸”為含量檢測(cè)指標(biāo)的含量檢測(cè)方法部分相關(guān)文獻(xiàn)文獻(xiàn)名檢測(cè)手段參考文獻(xiàn)HPLC測(cè)定甘草提取物中甘草酸的含量HPLC[16]HPLC測(cè)定川芎茶調(diào)散中甘草酸的含量HPLC[17]HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量HPLC[18]HPLC法測(cè)定內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量HPLC[19]甘草酸鉍散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究HPLC[20]高效液相色譜法測(cè)定清肺顆粒中甘草酸的含量HPLC[21]經(jīng)典名方溫經(jīng)湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜建立及9種成分含量測(cè)定HPLC[22]利尿合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析HPLC[23]UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)參芪健胃顆粒中芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨的含量UPLC-MS/MS[24]根據(jù)GB/T19424—2018天然植物飼料原料通用要求，天然植物飼料原料（單一型和復(fù)配型）包含了不同的干燥物、粉碎物、粗提物、復(fù)配型和混合型產(chǎn)品形式。隨后，通過市場(chǎng)調(diào)研確定目前市場(chǎng)中存在的天然植物飼料原料的產(chǎn)品形式，最常見的天然植物飼料原料為粉碎物、粗提物、復(fù)配型粉碎物和粗提物、混合型產(chǎn)品（表3）。因此，在收集不同類型的樣品（單一型粉碎物、單一型粗提物、復(fù)配型粉碎物、復(fù)配型粗提物和混合型產(chǎn)品等），共計(jì)93種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（表4）。表SEQ表\*ARABIC3含甘草的可飼用天然植物原料產(chǎn)品的調(diào)研情況（單位：個(gè)）調(diào)查產(chǎn)品粉劑液態(tài)粗提物復(fù)配型注明規(guī)格未注明規(guī)格明確有效成分未明確有效成分30220815312510表SEQ表\*ARABIC4全部實(shí)驗(yàn)樣品明細(xì)樣品類型樣品成分來源地單一型粗提物甘草粗提物煙臺(tái)單一型粗提物甘草粗提物保定冀中單一型粗提物甘草粗提物（GT7）濰坊單一型粗提物甘草粗提物濱州單一型粗提物甘草粗提物無錫單一型粗提物甘草粗提物保定安國(guó)單一型粗提物甘草粗提物保定冀中單一型粗提物甘草粗提物（GT8）北京單一型粗提物甘草粗提物（GT9）新疆單一型粗提物甘草粗提物（GT10）煙臺(tái)單一型粉碎物甘草粉碎物煙臺(tái)單一型粉碎物甘草粉碎物保定冀中單一型粉碎物甘草粉碎物濰坊單一型粉碎物甘草粉碎物濱州單一型粉碎物甘草粉碎物無錫單一型粉碎物甘草粉碎物（GF8）保定安國(guó)單一型粉碎物甘草粉碎物保定冀中單一型粉碎物甘草粉碎物菏澤單一型粉碎物甘草粉碎物（GF9）甘肅單一型粉碎物甘草粉碎物（GF10）內(nèi)蒙古復(fù)配型粗提物甘草粗提物+杜仲葉粗提物保定冀中復(fù)配型粗提物甘草粗提物+杜仲葉粗提物保定冀中復(fù)配型粗提物甘草粗提物+訶子粗提物無錫復(fù)配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物保定冀中復(fù)配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物無錫復(fù)配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物濱州復(fù)配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物保定冀中復(fù)配型粗提物甘草粗提物+女貞子粗提物濰坊復(fù)配型粗提物甘草粗提物+蒲公英粗提物保定冀中復(fù)配型粗提物甘草粗提物+蒲公英粗提物保定冀中復(fù)配型粗提物甘草粗提物+山茶籽粕粗提物濱州復(fù)配型粗提物甘草粗提物+山楂粗提物（4：6）保定安國(guó)復(fù)配型粗提物甘草粗提物+藤茶黃酮-c黃晶無錫復(fù)配型粗提物甘草粗提物+甜葉菊粗提物無錫復(fù)配型粗提物甘草粗提物+淫羊藿粗提物保定冀中復(fù)配型粗提物甘草粗提物+淫羊藿粗提物保定冀中復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+當(dāng)歸粉碎物（1：1）（FP1）保定安國(guó)復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+黨參粉碎物煙臺(tái)復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+杜仲葉粉碎物保定冀中復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+杜仲葉粉碎物無錫復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+茯苓粉碎物煙臺(tái)復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+訶子粉碎物無錫復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+黃柏粉碎物（6：4）菏澤復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+黃柏粉碎物（9：1）菏澤復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+黃芪粉碎物煙臺(tái)復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+黃芪粉碎物保定冀中復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+黃芪粉碎物無錫復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+金銀花粉碎物無錫復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+女貞子粉碎物濰坊復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+蒲公英粉碎物保定冀中復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+蒲公英粉碎物煙臺(tái)復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+生白術(shù)粉碎物保定冀中復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+生白術(shù)粉碎物保定冀中復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+甜葉菊粉碎物無錫復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+楊樹花粉碎物無錫復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+楊樹花粉碎物煙臺(tái)復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+淫羊藿粉碎物保定冀中復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+棗粉（50%棗+50%蒙脫石粉）煙臺(tái)混合型甘草粗提物+川芎粉碎物（4：1）保定安國(guó)混合型甘草粗提物+黨參粉碎物煙臺(tái)混合型甘草粗提物+杜仲葉粉碎物保定冀中混合型甘草粗提物+杜仲葉粉碎物無錫混合型甘草粗提物+茯苓粉碎物煙臺(tái)混合型甘草粗提物+訶子粉碎物無錫混合型甘草粗提物+黃芪粉碎物煙臺(tái)混合型甘草粗提物+黃芪粉碎物保定冀中混合型甘草粗提物+黃芪粉碎物無錫混合型甘草粗提物+金銀花粉碎物無錫混合型甘草粗提物+金銀花粉碎物濱州混合型甘草粗提物+女貞子粉碎物濰坊混合型甘草粗提物+蒲公英粉碎物保定冀中混合型甘草粗提物+蒲公英粉碎物煙臺(tái)混合型甘草粗提物+生白術(shù)粉碎物保定冀中混合型甘草粗提物+生白術(shù)粉碎物保定冀中混合型甘草粗提物+甜葉菊粉碎物無錫混合型甘草粗提物+楊樹花粉碎物無錫混合型甘草粗提物+楊樹花粉碎物煙臺(tái)混合型甘草粗提物+淫羊藿粉碎物保定冀中混合型甘草粗提物+棗粉（50%棗+50%蒙脫石粉）煙臺(tái)混合型甘草粉碎物+杜仲葉粗提物保定冀中混合型甘草粉碎物+甘草粗提物濰坊混合型甘草粉碎物+甘草粗提物濱州混合型甘草粉碎物+甘草粗提物保定安國(guó)混合型甘草粉碎物+甘草粗提物保定冀中混合型甘草粉碎物+訶子粗提物無錫混合型甘草粉碎物+黃芪粗提物保定冀中混合型甘草粉碎物+黃芪粗提物濱州混合型甘草粉碎物+黃芪粗提物無錫混合型甘草粉碎物+蒲公英粗提物保定冀中混合型甘草粉碎物+山楂粗提物（1：4）保定安國(guó)混合型甘草粉碎物+藤茶黃酮-c黃晶無錫混合型甘草粉碎物+甜葉菊粗提物無錫混合型甘草粉碎物+淫羊藿粗提物保定冀中3主要試驗(yàn)或驗(yàn)證的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果3.1主要試驗(yàn)或驗(yàn)證的分析、綜述報(bào)告3.1.1主要試劑與儀器a）主要試劑：水：GB/T6682，一級(jí)水。甲醇：色譜純。0.2mol/L乙酸銨溶液：稱取乙酸銨15.73g，用水溶解并稀釋至1000mL，混勻。乙酸銨緩沖溶液：準(zhǔn)確量取冰醋酸5mL，0.2mol/L乙酸銨溶液165mL，混勻。流動(dòng)相：準(zhǔn)確量取甲醇335mL，乙酸銨緩沖溶液170mL，混勻。甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0mg/mL）：準(zhǔn)確稱取10mg甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：53956-04-0，純度≥96.2%）（精確至0.01mg）于10mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解、定容，搖勻。2℃～8℃保存，有效期90d。甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確移取適量甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用流動(dòng)相稀釋定容，配制成濃度為0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.06mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。臨用現(xiàn)配。微孔濾膜：0.45μm，有機(jī)系。b）主要儀器：高效液相色譜儀：配紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。分析天平：精度0.01mg和0.1mg。超聲波清洗儀：240W。3.1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)a）色譜檢測(cè)條件選擇依據(jù)：通過甘草酸峰形、分離度、理論塔板數(shù)等指標(biāo)考察了不同C18色譜柱條件下樣品中甘草酸的檢測(cè)情況，確定相對(duì)較優(yōu)液相檢測(cè)條件。通過查閱甘草酸含量檢測(cè)相關(guān)的文獻(xiàn)、藥典、標(biāo)準(zhǔn)及其他資料顯示（表5），甘草酸的分離一般使用C18色譜柱。表SEQ表\*ARABIC5甘草酸含量檢測(cè)文獻(xiàn)中使用的色譜柱文獻(xiàn)名色譜柱參考文獻(xiàn)HPLC測(cè)定甘草提取物中甘草酸的含量C18[16]HPLC測(cè)定川芎茶調(diào)散中甘草酸的含量KromasilC18[17]HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量C18[18]HPLC法測(cè)定內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量ZORBAXExundC18[19]甘草酸鉍散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究C18[20]高效液相色譜法測(cè)定清肺顆粒中甘草酸的含量C18[21]經(jīng)典名方溫經(jīng)湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜建立及9種成分含量測(cè)定KromasilC18[22]利尿合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析AgilentZORBAXXDBC18[23]UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)參芪健胃顆粒中芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨的含量AgilentEclipsePlusC18[24]因此，比較了AgilentZORBAXSBC18、AgilentEclipseXDBC18、WelchXtimateC18、AgilentEclipsePlusC18、ShimadzuInertSustainC18等六種不同的C18色譜柱對(duì)樣品中甘草酸的分離效果。結(jié)果顯示（表6），C18色譜柱對(duì)甘草酸色譜峰的分離度良好。最終選擇分離度較好的ShimadzuInertSustainC18色譜柱進(jìn)行了后續(xù)的試驗(yàn)。表SEQ表\*ARABIC6不同色譜柱檢測(cè)分離度比較色譜柱分離度AgilentZORBAXSBC182.61AgilentEclipseXDBC183.03WelchXtimateC181.66AgilentEclipsePlusC182.17ShimadzuInertSustainC182.26WatersSymmetryShieldRP182.01通過高效液相色譜儀全掃光譜確定甘草酸最大吸收波長(zhǎng)為250nm（圖2），因此，確定250nm為本方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。隨后，通過甘草酸峰形、分離度等指標(biāo)考察了不同流動(dòng)相、不同柱溫條件下甘草酸的檢測(cè)情況。結(jié)果顯示，以甲醇-0.1%磷酸水（70：30，v/v）為流動(dòng)相對(duì)樣品進(jìn)行甘草酸含量檢測(cè)時(shí)，分離度約為1.72，但未能完全將甘草酸色譜峰（保留時(shí)間12.715min）與雜質(zhì)峰完全分離（見圖3A），而以甲醇-0.2mol/L乙酸銨溶液-冰醋酸（67：33：1，v/v/v）（見圖3B）為流動(dòng)相對(duì)樣品進(jìn)行甘草酸含量檢測(cè)時(shí)，分離度約為1.78，因此，選擇甲醇-0.2mol/L乙酸銨溶液-冰醋酸（67：33：1，v/v/v）作為流動(dòng)相，即甲醇335mL，乙酸銨緩沖溶液170mL，混勻。隨后考察了不同柱溫對(duì)甘草酸檢測(cè)效果的影響，比較了20℃、25℃、30℃、35℃等四種柱溫，隨著柱溫的增加，甘草酸保留時(shí)間隨之減少，峰高隨著柱溫的增加而增加（圖4）。盡管峰高越高檢測(cè)峰形越好，但隨著柱溫的增加，甘草酸保留時(shí)間的降低也將導(dǎo)致甘草酸色譜峰與雜質(zhì)峰更加接近，因此選取30℃為測(cè)定甘草酸含量的柱溫。圖SEQ圖\*ARABIC2甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1mg/mL）光譜圖圖SEQ圖\*ARABIC3甲醇-0.1%磷酸水（70：30，v/v）(A)和甲醇-0.2mol/L乙酸銨溶液-冰醋酸（67：33：1,v/v/v）(B)對(duì)甘草酸的分離效果圖SEQ圖\*ARABIC4不同柱溫與甘草酸保留時(shí)間、吸光度的關(guān)系綜上所述，最終確定最佳液相檢測(cè)條件：色譜柱為C18，柱長(zhǎng)250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm，或性能相當(dāng)者；流動(dòng)相為甲醇335mL，乙酸銨緩沖溶液170mL，混勻；等度洗脫；流速為1mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm；進(jìn)樣量為10μL。b）樣品前處理方法選擇依據(jù)根據(jù)檢測(cè)甘草酸相關(guān)文獻(xiàn)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中的含量檢測(cè)方法，甘草酸的提取方法主要為超聲提取（表7），并且超聲提取方法可達(dá)到有效提高提取分離率，縮短提取時(shí)間、節(jié)約成本、甚至提高產(chǎn)品的質(zhì)量，同時(shí)達(dá)到增加產(chǎn)量的效果，故將提取方式確定為超聲提取。表SEQ表\*ARABIC7甘草酸含量檢測(cè)文獻(xiàn)中甘草酸的提取方法文獻(xiàn)名提取方法參考文獻(xiàn)HPLC測(cè)定甘草提取物中甘草酸的含量超聲提取[16]HPLC測(cè)定川芎茶調(diào)散中甘草酸的含量超聲提取[17]HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量超聲提取[18]HPLC法測(cè)定內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量超聲提取[19]甘草酸鉍散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究超聲提取[20]高效液相色譜法測(cè)定清肺顆粒中甘草酸的含量超聲提取[21]利尿合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析超聲提取[22]UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)參芪健胃顆粒中芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨的含量超聲提取[23]通過甘草酸峰形、峰面積、分離度等指標(biāo)考察了不同提取體積、不同提取液、不同提取時(shí)間條件下甘草酸的檢測(cè)情況。分別比較了25mL、50mL、100mL的提取體積對(duì)GF10和GT8中的甘草酸進(jìn)行提取，結(jié)果顯示（表8），3種提取體積下，甘草粉碎物中甘草酸含量無顯著性差異（P＞0.05），甘草提取物中甘草酸含量相差不大，但50mL提取液得到的甘草酸含量相對(duì)較高。為保證方法能夠?qū)⒏什菟嵬耆崛?，延用藥典中的檢測(cè)體積50mL。表SEQ表\*ARABIC8不同提取體積得到的含量比較提取體積/mL甘草粉碎物GF10檢測(cè)含量/%甘草提取物GT8檢測(cè)含量/%252.037.13502.047.301002.047.22在檢索文獻(xiàn)的過程中發(fā)現(xiàn)，大部分方法采用流動(dòng)相對(duì)甘草酸進(jìn)行提?。ㄒ姳?），部分方法使用了純甲醇提取、堿性溶液提取法，因此，本方法分別比較了甲醇、流動(dòng)相、1mol/L氨水的提取效果。如圖5所示，不同提取溶劑不會(huì)影響甘草酸色譜峰的分離效果。但不同提取溶劑提取得到的甘草酸的量不同，甲醇作為提取溶劑時(shí)，GF10樣品中甘草酸含量為1.27%，明顯低于流動(dòng)相、氨水提取液（分別為2.04%和2.02%）。對(duì)于GT8樣品來說也顯示出了相似的含量差異（甲醇6.6%、流動(dòng)相和氨水提取液約7.4%）。因此，選擇流動(dòng)相作為提取液。表SEQ表\*ARABIC9甘草酸含量檢測(cè)文獻(xiàn)中甘草酸的提取溶劑文獻(xiàn)名提取溶劑參考文獻(xiàn)HPLC測(cè)定甘草提取物中甘草酸的含量流動(dòng)相[16]HPLC測(cè)定川芎茶調(diào)散中甘草酸的含量流動(dòng)相[17]HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量甲醇[18]HPLC法測(cè)定內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量流動(dòng)相[19]高效液相色譜法測(cè)定清肺顆粒中甘草酸的含量流動(dòng)相[20]HPLC法測(cè)定甘草中甘草酸的含量1mol/L氨水[21]利尿合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析流動(dòng)相[22]UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)參芪健胃顆粒中芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨的含量70%甲醇[23]圖SEQ圖\*ARABIC5不同提取液對(duì)GF10中甘草酸的檢測(cè)圖譜。甲醇（A）、流動(dòng)相（B）、1mol/L氨水（C）隨后，考察了不同的提取時(shí)間對(duì)甘草酸含量的影響，分別以25min、30min、35min為提取時(shí)間對(duì)GF10樣品和GT8樣品中甘草酸進(jìn)行提取，結(jié)果顯示（表10），25min、30min、35min時(shí)測(cè)得的樣品含量相似。與25min相比，提取時(shí)間為30min時(shí)GF10樣品含量略有升高，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)（35min），GF10樣品中甘草酸含量沒有繼續(xù)升高，說明30min即可將樣品中的甘草酸提取完全。因此，延用藥典方法，選擇超聲30min為提取時(shí)間，故選擇超聲時(shí)間為30min。表SEQ表\*ARABIC10不同提取時(shí)間GF10、GT8樣品中甘草酸含量比較提取時(shí)間/min甘草粉碎物GF10檢測(cè)含量/%甘草提取物GT8檢測(cè)含量/%251.987.28302.067.29352.047.29進(jìn)一步，確定本方法最適稱樣量，依據(jù)《中國(guó)藥典》2000年版和《中國(guó)獸藥典》2000年版中甘草酸含量測(cè)定方法的取樣量0.3g，比較了三種不同的稱樣量（0.1g、0.3g和0.5g）的重復(fù)性。結(jié)果顯示（表11），不同類型樣品在使用不同稱樣量時(shí)，均能滿足重復(fù)性RSD不超過2%的要求，其中，0.3g和0.5g的稱樣量得到的重復(fù)性RSD更低，結(jié)果更可靠。為避免浪費(fèi)試劑、產(chǎn)生過高的成本，選擇0.3g為本方法的取樣量。表SEQ表\*ARABIC11不同稱樣量對(duì)不同類型樣品檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性比較稱樣量甘草粉碎物（GF8）甘草粗提物（GT7）復(fù)配型粉碎物（FP1）平均值（g/kg）RSD/%平均值（g/kg）RSD/%平均值（g/kg）RSD/%0.1g31.711.4857.180.5714.541.240.3g31.700.5857.740.2113.950.450.5g30.720.7457.350.5013.920.52綜上所述，最終確定了如下的樣品前處理方法：稱取試樣0.3g，分別置于50mL容量瓶中，加入約45mL流動(dòng)相，超聲30min，取出，放至室溫，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜將樣液濾入樣品瓶中，供高效液相色譜儀測(cè)定。3.1.3方法學(xué)a）系統(tǒng)適應(yīng)性按照“3.1”項(xiàng)下的色譜檢測(cè)條件及樣品前處理方法，經(jīng)測(cè)定天然植物飼料原料中甘草酸的出峰位置均無雜峰干擾（圖6）。圖SEQ圖\*ARABIC60.12mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)、單一型樣品(B)、復(fù)配型粉碎物樣品(C)、復(fù)配型粗提物樣品(D)、混合型樣品(E)檢測(cè)譜圖b）線性范圍甘草酸在0.01～0.20mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好（圖7），R2＞0.9999。圖SEQ圖\*ARABIC7甘草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線c）檢出限和定量限將甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品、單一型樣品、復(fù)配型樣品、混合型樣品進(jìn)樣濃度為0.001mg/mL時(shí)，信噪比約為10，計(jì)算得到該方法的定量限為0.16g/kg（圖8）。將甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品、單一型樣品、復(fù)配型樣品、混合型樣品進(jìn)樣濃度為0.0004mg/mL時(shí)，信噪比約為3，計(jì)算得到該方法的檢出限為0.06g/kg。圖SEQ圖\*ARABIC80.001mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)、單一型樣品(B)、復(fù)配型粉碎物樣品(C)、復(fù)配型粗提物樣品(D)、混合型樣品(E)中定量限檢測(cè)譜圖d）精密度和加標(biāo)回收率連續(xù)三天對(duì)GF9、GF10、GT8、GT9、GT10進(jìn)行提取和檢測(cè)，每批平行3個(gè)樣品，計(jì)算批內(nèi)和批間精密度。采用三種加標(biāo)水平，每種水平平行3個(gè)樣品的方法（3×3）進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。三個(gè)加標(biāo)水平分別為80%、100%、120%，方法檢測(cè)量為6mg，故甘草酸的加標(biāo)量分別為1.8mg、3.0mg、4.2mg，儲(chǔ)備液濃度為1mg/mL，故分別量取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液1.8mL、3.0mL和4.2mL，并分別置于3個(gè)50mL容量瓶中，加入50%稱樣質(zhì)量的飼料原料，加入流動(dòng)相至容量瓶?jī)?nèi)體積約為45mL，超聲30min，放冷，用流動(dòng)相定容至刻度，每種添加濃度水平平行制備3份，即得加標(biāo)回收率考察溶液。本方法批內(nèi)精密度在0.15%～1.35%之間，批間精密度0.12%～1.23%（見表10）；甘草酸在1.8mg、3.0mg、4.2mg添加水平的加標(biāo)回收率在92%～105%之間。天然植物飼料原料中甘草酸含量檢測(cè)的精密度和加標(biāo)回收率見表12～表17。表SEQ表\*ARABIC12甘草酸批內(nèi)及批間精密度樣品批內(nèi)精密度/%批間精密度/%1批2批3批GF90.310.790.290.75GF100.850.521.351.23GT81.341.250.370.37GT90.150.590.870.12GT100.961.070.880.31表SEQ表\*ARABIC13GF9中甘草酸的加標(biāo)回收率添加質(zhì)量/mg稱量粉碎物質(zhì)量/g實(shí)際檢測(cè)總質(zhì)量/mg實(shí)際檢測(cè)加標(biāo)準(zhǔn)品總質(zhì)量/mg回收率/%平均值/%RSD/%4.20.114236.5963.95594.1394.461.380.111266.6014.02995.890.115376.5893.92593.343.00.111355.3352.76491.9995.583.280.113415.5572.93997.790.113265.5282.91196.961.80.127344.6321.69093.6994.051.250.114254.3591.71895.360.118284.4111.67893.10表SEQ表\*ARABIC14GF10中甘草酸的加標(biāo)回收率添加質(zhì)量/mg稱量粉碎物質(zhì)量/g實(shí)際檢測(cè)總質(zhì)量/mg實(shí)際檢測(cè)加標(biāo)準(zhǔn)品總質(zhì)量/mg回收率/%平均值/%RSD/%4.20.164327.2513.91693.2293.631.240.155297.1403.98894.940.165337.2513.89692.743.00.138215.6702.86495.4794.331.050.163266.1312.81793.890.164246.1432.80893.631.80.145264.6331.66091.9593.922.060.152314.8151.69994.010.144284.6821.73095.82表SEQ表\*ARABIC15GT8中甘草酸的加標(biāo)回收率添加質(zhì)量/mg稱量粗提物質(zhì)量/g實(shí)際檢測(cè)總質(zhì)量/mg實(shí)際檢測(cè)加標(biāo)準(zhǔn)品總質(zhì)量/mg回收率/%平均值/%RSD/%4.20.039326.9914.00194.9897.045.010.040227.0003.93393.550.051448.2374.403102.603.00.045266.2712.82193.8494.181.180.032255.2612.80793.280.031435.2632.88695.421.80.046015.2441.71695.2996.671.850.036284.5591.79898.690.046165.2691.74196.02表SEQ表\*ARABIC16GT9中甘草酸的加標(biāo)回收率添加質(zhì)量/mg稱量粗提物質(zhì)量/g實(shí)際檢測(cè)總質(zhì)量/mg實(shí)際檢測(cè)加標(biāo)準(zhǔn)品總質(zhì)量/mg回收率/%平均值/%RSD/%4.20.046217.1893.91292.9192.720.740.046267.2083.93193.280.047317.2273.87991.963.00.034245.2462.82493.7093.931.910.033405.2502.90095.830.037075.4042.76992.261.80.038164.4171.71094.6297.104.310.035064.1991.70694.760.036434.4261.861101.93表SEQ表\*ARABIC17GT10中甘草酸的加標(biāo)回收率添加質(zhì)量/mg稱量粗提物質(zhì)量/g實(shí)際檢測(cè)總質(zhì)量/mg實(shí)際檢測(cè)加標(biāo)準(zhǔn)品總質(zhì)量/mg回收率/%平均值/%RSD/%4.20.049227.3223.86791.8792.650.830.043336.9423.91092.690.048267.3193.93593.413.00.049246.2712.81793.5593.090.430.041195.6832.79292.820.050306.3262.80192.901.80.038334.3761.69793.2693.241.340.028113.6341.66091.980.037234.3201.71294.48e）方法耐用性考察柱溫和流動(dòng)相比例改變對(duì)甘草酸在不同檢測(cè)出樣品中分離度的影響，進(jìn)而考察方法的耐用性，其分離度大于1.5，耐用性良好（表18）。表SEQ表\*ARABIC18方法耐用性（分離度）樣品種類柱溫流動(dòng)相（甲醇-0.2mol/L乙酸銨-冰醋酸）比例35℃30℃25℃（70：30：1）（67：33：1）（65：35：1）GF92.592.642.612.292.642.78GF101.841.782.151.681.782.07GT82.562.622.572.332.622.76GT92.542.552.532.322.552.76GT102.562.572.562.332.572.77f）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的穩(wěn)定性結(jié)果表明，24h內(nèi)甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)工作液的穩(wěn)定性良好（見表19）。表SEQ表\*ARABIC1924h甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)工作液穩(wěn)定性樣品編號(hào)進(jìn)樣時(shí)間/h保留時(shí)間/min峰面積平均值/%RSD/%108.9601727.11730.720.77228.9681743.2348.9831746.2488.9611710.75128.9921722.96249.0031734.2g）甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性為檢測(cè)儲(chǔ)備液穩(wěn)定性，連續(xù)三個(gè)月，每月同一時(shí)間進(jìn)行一次含量檢測(cè)，每次均重新稱量甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品，與儲(chǔ)備液穩(wěn)定性樣品進(jìn)行比較，無顯著差異，表明儲(chǔ)備液三個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定性良好（見表20）。表SEQ表\*ARABIC20甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性存放條件儲(chǔ)備液峰面積（n=3）RSD/%4℃存放臨用現(xiàn)配檢測(cè)時(shí)間第0個(gè)月———8863.388855.858853.620.06第1個(gè)月8769.258783.418795.308775.578759.018769.700.14第2個(gè)月9019.768989.098979.789014.758974.118992.230.21第3個(gè)月8836.308848.698860.758857.108862.048846.880.11h）甘草苷和甘草次酸的干擾檢測(cè)配置含甘草酸銨、甘草苷、甘草次酸均為0.2mg/mL的混標(biāo)溶液。檢測(cè)圖譜顯示（圖8），甘草酸的保留時(shí)間為4.697min、甘草苷的保留時(shí)間為1.974min、甘草次酸的保留時(shí)間為44.052min。結(jié)果表明，甘草酸、甘草苷和甘草次酸保留時(shí)間相差較大，且峰分離度良好，甘草苷和甘草次酸對(duì)于甘草酸的檢測(cè)不存在干擾。圖8混標(biāo)溶液（甘草酸、甘草苷、甘草次酸濃度均為0.2mg/mL）3.1.3方法驗(yàn)證結(jié)果本標(biāo)準(zhǔn)方法經(jīng)國(guó)家飼料質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心（北京）、山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心、北京英太格瑞檢測(cè)技術(shù)有限公司等3家實(shí)驗(yàn)室參加了該農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證，標(biāo)準(zhǔn)編制單位向驗(yàn)證單位提供方法草案、驗(yàn)證方案和標(biāo)準(zhǔn)品。驗(yàn)證單位按照方法草案準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法的線性范圍、回收率和精密度等技術(shù)指標(biāo)的驗(yàn)證試驗(yàn)并返回試驗(yàn)結(jié)果。3家實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)證結(jié)果標(biāo)明，方法的線性范圍、回收率和精密度等技術(shù)指標(biāo)均符合GB/T27417—2017和GB/T27404—2008的要求，說明該方法可行。3.1.4實(shí)際樣品的測(cè)定使用本方法對(duì)從全國(guó)各地采集不同來源不同批次的單一型、復(fù)配型和混合型天然植物飼料原料，共93種。按照“3.1”項(xiàng)下的色譜檢測(cè)條件及樣品前處理方法，對(duì)這些樣品中的甘草酸進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表21所示，不同類型樣品間含量差異較大，在93種樣品中甘草酸含量在0.77～88.08g/kg之間，同一類型樣品間甘草酸的含量也存在較大差異，其中，單一型粗提物中甘草酸的含量在44.65～88.08g/kg之間、單一型粉碎物中甘草酸的含量在12.01～30.70g/kg之間、復(fù)配型粗提物中甘草酸的含量在2.57～44.07g/kg之間、復(fù)配型粉碎物中甘草酸的含量在4.85～15.71g/kg之間、混合型天然植物飼料原料中甘草酸的含量在0.77～57.49g/kg之間。同時(shí)，實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果顯示，不同類型的天然植物飼料原料（單一型粗提物、單一型粉碎物、復(fù)配型粗提物、復(fù)配型粉碎物、混合型）的稱樣量為0.3g時(shí)，均能夠滿足試驗(yàn)要求。表SEQ表\*ARABIC21實(shí)際樣品中甘草酸含量測(cè)定結(jié)果樣品類型樣品名稱來源地甘草酸含量（g/kg）單一型粗提物甘草粗提物1煙臺(tái)78.81單一型粗提物甘草粗提物2保定冀中85.63單一型粗提物甘草粗提物3濰坊57.74單一型粗提物甘草粗提物4濱州86.31單一型粗提物甘草粗提物5無錫88.08單一型粗提物甘草粗提物6保定安國(guó)44.65單一型粗提物甘草粗提物7保定冀中79.55單一型粗提物甘草粗提物8北京76.95單一型粗提物甘草粗提物9新疆71.29單一型粗提物甘草粗提物10煙臺(tái)70.52單一型粉碎物甘草粉碎物1煙臺(tái)23.49單一型粉碎物甘草粉碎物2保定冀中20.76單一型粉碎物甘草粉碎物3濰坊25.17單一型粉碎物甘草粉碎物4濱州19.53單一型粉碎物甘草粉碎物5無錫18.81單一型粉碎物甘草粉碎物6保定安國(guó)31.70單一型粉碎物甘草粉碎物7保定冀中21.16單一型粉碎物甘草粉碎物8菏澤12.01單一型粉碎物甘草粉碎物9甘肅23.02單一型粉碎物甘草粉碎物10內(nèi)蒙古20.44復(fù)配型粗提物甘草粗提物+杜仲葉粗提物1保定冀中37.39復(fù)配型粗提物甘草粗提物+杜仲葉粗提物2保定冀中40.03復(fù)配型粗提物甘草粗提物+訶子粗提物無錫40.80復(fù)配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物1保定冀中36.32復(fù)配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物2無錫40.03復(fù)配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物3濱州10.27復(fù)配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物4保定冀中39.56復(fù)配型粗提物甘草粗提物+女貞子粗提物濰坊39.17復(fù)配型粗提物甘草粗提物+蒲公英粗提物1保定冀中19.66復(fù)配型粗提物甘草粗提物+蒲公英粗提物2保定冀中39.67復(fù)配型粗提物甘草粗提物+山茶籽粕粗提物濱州44.07復(fù)配型粗提物甘草粗提物+山楂粗提物（4：6）保定安國(guó)2.57復(fù)配型粗提物甘草粗提物+藤茶黃酮-c黃晶無錫35.93復(fù)配型粗提物甘草粗提物+甜葉菊粗提物無錫40.04復(fù)配型粗提物甘草粗提物+淫羊藿粗提物1保定冀中30.32復(fù)配型粗提物甘草粗提物+淫羊藿粗提物2保定冀中39.52復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+當(dāng)歸粉碎物（1：1）保定安國(guó)13.95復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+黨參粉碎物煙臺(tái)9.99復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+杜仲葉粉碎物1保定冀中9.94復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+杜仲葉粉碎物2無錫9.96復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+茯苓粉碎物煙臺(tái)9.92復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+訶子粉碎物無錫10.34復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+黃柏粉碎物（6：4）菏澤4.85復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+黃柏粉碎物（9：1）菏澤9.10復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+黃芪粉碎物1煙臺(tái)9.98復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+黃芪粉碎物2保定冀中9.89復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+黃芪粉碎物3無錫9.88復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+金銀花粉碎物無錫10.12復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+女貞子粉碎物濰坊12.82復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+蒲公英粉碎物1保定冀中9.90復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+蒲公英粉碎物2煙臺(tái)9.95復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+生白術(shù)粉碎物1保定冀中9.74復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+生白術(shù)粉碎物2保定冀中15.71復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+甜葉菊粉碎物無錫9.78復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+楊樹花粉碎物1無錫10.07復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+楊樹花粉碎物2煙臺(tái)9.63復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+淫羊藿粉碎物保定冀中9.92復(fù)配型粉碎物甘草粉碎物+棗粉（50%棗+50%蒙脫石粉）煙臺(tái)9.67混合型甘草粗提物+川芎粉碎物（4：1）保定安國(guó)28.23混合型甘草粗提物+黨參粉碎物煙臺(tái)39.36混合型甘草粗提物+杜仲葉粉碎物1保定冀中38.83混合型甘草粗提物+杜仲葉粉碎物2無錫39.71混合型甘草粗提物+茯苓粉碎物煙臺(tái)33.82混合型甘草粗提物+訶子粉碎物無錫41.68混合型甘草粗提物+黃芪粉碎物1煙臺(tái)39.27混合型甘草粗提物+黃芪粉碎物2保定冀中38.32混合型甘草粗提物+黃芪粉碎物3無錫38.22混合型甘草粗提物+金銀花粉碎物1無錫30.49混合型甘草粗提物+金銀花粉碎物2濱州46.09混合型甘草粗提物+女貞子粉碎物濰坊40.99混合型甘草粗提物+蒲公英粉碎物1保定冀中38.69混合型甘草粗提物+蒲公英粉碎物2煙臺(tái)39.04混合型甘草粗提物+生白術(shù)粉碎物1保定冀中38.41混合型甘草粗提物+生白術(shù)粉碎物2保定冀中39.63混合型甘草粗提物+甜葉菊粉碎物無錫37.67混合型甘草粗提物+楊樹花粉碎物1無錫32.36混合型甘草粗提物+楊樹花粉碎物2煙臺(tái)39.76混合型甘草粗提物+淫羊藿粉碎物保定冀中39.80混合型甘草粗提物+棗粉（50%棗+50%蒙脫石粉）煙臺(tái)39.33混合型甘草粉碎物+杜仲葉粗提物保定冀中9.87混合型甘草粉碎物+甘草粗提物1濰坊52.70混合型甘草粉碎物+甘草粗提物2濱州57.49混合型甘草粉碎物+甘草粗提物3保定安國(guó)32.63混合型甘草粉碎物+甘草粗提物4保定冀中36.84混合型甘草粉碎物+訶子粗提物無錫10.13混合型甘草粉碎物+黃芪粗提物1保定冀中9.82混合型甘草粉碎物+黃芪粗提物2濱州9.31混合型甘草粉碎物+黃芪粗提物2無錫10.18混合型甘草粉碎物+蒲公英粗提物保定冀中9.65混合型甘草粉碎物+山楂粗提物（1：4）保定安國(guó)0.77混合型甘草粉碎物+藤茶黃酮-c黃晶無錫11.75混合型甘草粉碎物+甜葉菊粗提物無錫9.91混合型甘草粉碎物+淫羊藿粗提物保定冀中10.03此外，對(duì)其他天然植物飼料原料進(jìn)行測(cè)定，并與甘草飼料原料進(jìn)行復(fù)配或混合得到天然植物飼料原料的空白樣品色譜圖、復(fù)配及混合樣品色譜圖，結(jié)果顯示（圖9），不同種類樣品雜質(zhì)峰對(duì)甘草酸色譜峰均無干擾，表明該方法可適用于不同種類的天然植物飼料原料，具有較好的普適性。圖90.12mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)、金銀花粉碎物(B)及其對(duì)應(yīng)復(fù)配型粉碎物樣品(C)、甜葉菊粗提物(D)及其對(duì)應(yīng)復(fù)配型粗提物樣品(E)、淫羊藿粗提物(F)及其對(duì)應(yīng)混合型樣品(G)檢測(cè)譜圖3.1.5綜述報(bào)告本文件對(duì)天然植物飼料原料中甘草酸的色譜條件及樣品前處理進(jìn)行了優(yōu)化，包括流動(dòng)相、柱溫、提取液、提取時(shí)間等對(duì)檢測(cè)方法的影響等，并對(duì)建立的檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。上述技術(shù)參數(shù)的確定主要依據(jù)是課題組進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)測(cè)定試驗(yàn)獲取的數(shù)據(jù)資料。分別考察色譜條件（不同流動(dòng)相、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)）、前處理?xiàng)l件（不同提取方式、提取溶劑、提取體積、提取時(shí)間）對(duì)檢測(cè)方法的影響。最終選擇檢測(cè)方法為：流動(dòng)相：甲醇335mL，乙酸銨緩沖溶液170mL，混勻；等度洗脫；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；進(jìn)樣量：10μL；流速：1.0mL/min。平行做兩份試驗(yàn)。稱取試樣約0.3g（精確至0.1mg），置于50mL容量瓶中，加入約45mL流動(dòng)相，超聲30min，期間振搖2～3次，取出后冷卻至室溫，用流動(dòng)相定容，搖勻，靜置。上清液用微孔濾膜過濾，備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍設(shè)置：以設(shè)計(jì)樣品濃度（約0.12mg/mL）為標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的中間濃度，設(shè)置線性范圍為0.01～0.20mg/mL。定量限、檢出限設(shè)置：樣品的定量限為0.16g/kg，檢出限為0.06g/kg。3.2技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證擬定各種可能的技術(shù)經(jīng)濟(jì)方案，建立多種技術(shù)方案。按規(guī)劃目標(biāo)的要求建立若干個(gè)技術(shù)方案，包括多種建設(shè)方案和多種改造方案（新技術(shù)方案代替舊技術(shù)方案）。對(duì)各種方案進(jìn)行初步加工，確定對(duì)比方案評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)計(jì)包括數(shù)量、質(zhì)量、成本、投資、資金回收等各種指標(biāo)。對(duì)技術(shù)方案進(jìn)行分析、計(jì)算、比較。對(duì)各類指標(biāo)進(jìn)行“可比”處理，使各種技術(shù)方案在使用價(jià)值上等同化，然后進(jìn)行比較。綜合分析、評(píng)價(jià)、擇優(yōu)。在分析、計(jì)算、比較的基礎(chǔ)上，對(duì)各種指標(biāo)與指標(biāo)體系進(jìn)行定量與定性的分析評(píng)價(jià)，最后選出最優(yōu)的方案。3.3預(yù)期效益分析天然植物飼料原料中甘草酸的測(cè)定高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)的制定預(yù)期產(chǎn)生如下作用和效益：通過本文件的制定，能夠?yàn)楦什菟嵩谔烊恢参镲暳显现泻繖z測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。主管部門或有關(guān)企業(yè)可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)建立全面的檢測(cè)方法質(zhì)量管理體系，健全產(chǎn)品質(zhì)量管理法規(guī)，迅速提高和發(fā)展企業(yè)的