分子病理檢測(cè)平臺(tái)原位雜交課件

分子病理檢測(cè)平臺(tái)

------原位雜交病理科1分子病理檢測(cè)平臺(tái)

------原位雜交原理及實(shí)驗(yàn)過程原位雜交的應(yīng)用1.EBER2.HPV3.Kappa和Lamda熒光原位雜交的原理及探針類型熒光原位雜交的應(yīng)用1.實(shí)體性腫瘤2.淋巴造血系統(tǒng)腫瘤3.產(chǎn)前診斷22原位雜交原理核酸分子雜交（nucleicacidhybirdzation）：指具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成雙鏈的過程。雜交雙方分別為待檢的核酸序列和已知的核酸序列，后者常用核素和非核素示蹤標(biāo)記，稱為探針（probe），雜交后形成異源性雙鏈分子稱為雜交體。生命科學(xué)的“釣魚”。3原位雜交原理核酸分子雜交（nucleicacidhybi44DNA將探針置于載玻片上制片雜交變性檢測(cè)在熒光顯微鏡下觀察5DNA將探針置于載玻片上制片雜交變性檢測(cè)在熒光顯微鏡下觀察5原位雜交原理及實(shí)驗(yàn)過程原位雜交的應(yīng)用1.EBER2.HPV3.Kappa和Lamda熒光原位雜交的原理及探針類型熒光原位雜交的應(yīng)用1.實(shí)體性腫瘤2.淋巴造血系統(tǒng)腫瘤3.產(chǎn)前診斷66普通原位雜交（ISH）用途：檢測(cè)DNA及RNA表達(dá)的情況，輔助病學(xué)學(xué)診斷檢測(cè)項(xiàng)目：1.EBV病原EBER原位雜交檢測(cè)2.HPV病原體低危6/11和高危16/18原位雜交檢測(cè)3.Kappa和lambda克隆性分析原位雜交法檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果分析：僅為細(xì)胞核著色。只有當(dāng)核分裂時(shí)可以出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性著色。7普通原位雜交（ISH）用途：檢測(cè)DNA及RNA表達(dá)的情

1、EBER檢測(cè)：潛伏性EBV感染與幾種情況相關(guān)：鼻咽癌、淋巴組織疾?。ɑ羝娼鹆馨土觥urkitt淋巴瘤、NK/T細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞淋巴瘤、腸病T細(xì)胞淋巴瘤、免疫抑制劑患者淋巴瘤、淋巴樣肉芽腫、傳染性單核細(xì)胞增多癥等）。一旦感染EBV，受感染者終身帶病毒。EBV具有感染和轉(zhuǎn)化B細(xì)胞特性，能使小淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變成永生的類淋巴母細(xì)胞的特征。8

8992、HPV檢測(cè)：HPV感染與生殖器疣、宮頸癌相關(guān)（12個(gè)低危型、15個(gè)高危型）。HPV原位雜交檢測(cè)；低危HPV6/11、高危16/18型。102、HPV檢測(cè)：103.Kappa及Lambda檢測(cè)輕鏈限制性或者單克隆性可用于區(qū)分B細(xì)胞反應(yīng)性增殖和腫瘤性增殖。113.Kappa及Lambda檢測(cè)11原位雜交原理及實(shí)驗(yàn)過程原位雜交的應(yīng)用1.EBER2.HPV3.Kappa和Lamda熒光原位雜交的原理及探針類型熒光原位雜交的應(yīng)用1.實(shí)體性腫瘤2.淋巴造血系統(tǒng)腫瘤3.產(chǎn)前診斷1212131314141515FISH探針種類16FISH探針種類16FISH探針種類17FISH探針種類1718181919原位雜交原理及實(shí)驗(yàn)過程原位雜交的應(yīng)用1.EBER2.HPV3.Kappa和Lamda熒光原位雜交的原理及探針類型熒光原位雜交的應(yīng)用1.實(shí)體性腫瘤2.淋巴造血系統(tǒng)腫瘤3.產(chǎn)前診斷2020熒光原位雜交（FISH）原理：通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交用途：檢測(cè)基因異常1.基因片段擴(kuò)增

2.基因片段缺失

3.基因片段易位FISH技術(shù)的應(yīng)用：1.靶向藥物篩選2.危險(xiǎn)人群篩查3.風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)分析4.輔助診斷21熒光原位雜交（FISH）21FISH檢測(cè)項(xiàng)目1.實(shí)體性腫瘤Her-2基因檢測(cè)，指導(dǎo)Herceptin分子靶點(diǎn)的治療；EGFR基因擴(kuò)增檢測(cè)，指導(dǎo)肺癌、腸癌分子靶點(diǎn)治療；ALK基因易位檢測(cè)，指導(dǎo)肺癌分子靶點(diǎn)治療；檢測(cè)尿脫落細(xì)胞染色體非整倍性，用于膀胱癌的診斷、復(fù)發(fā)判斷；檢測(cè)宮頸癌腫瘤細(xì)胞TERC基因擴(kuò)增，判斷CIN病變的演進(jìn)風(fēng)險(xiǎn)等。2.淋巴造血系統(tǒng)疾病淋巴瘤診斷分型，檢測(cè)特異染色體易位，協(xié)助淋巴瘤分類；慢性粒細(xì)胞白血病等白血病及多發(fā)性骨髓瘤FISH檢測(cè)，判斷預(yù)后等。3.產(chǎn)前診斷唐氏綜合癥（21三體）等產(chǎn)前染色體數(shù)目檢測(cè)，協(xié)助產(chǎn)前診斷。22FISH檢測(cè)項(xiàng)目1.實(shí)體性腫瘤22計(jì)數(shù)細(xì)胞必須是各通道信號(hào)均清晰可辨的細(xì)胞，細(xì)胞核輪廓不清或有重疊的不要分析。雜交不均勻的區(qū)域不要分析。背景深影響信號(hào)判斷的區(qū)域不要分析。在分析石蠟切片時(shí)，分析的區(qū)域應(yīng)在腫瘤細(xì)胞集中的部位（需由病理科醫(yī)師認(rèn)定）如果超過25％的細(xì)胞核內(nèi)信號(hào)太弱，則該區(qū)域不要進(jìn)行分析。如果超過10％的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有信號(hào)，則該區(qū)域不要進(jìn)行分析。結(jié)果判讀、分析

23計(jì)數(shù)細(xì)胞必須是各通道信號(hào)均清晰可辨的細(xì)胞，細(xì)胞核輪廓不清或有FISH結(jié)果觀察流程觀察程序：首先在HE染色切片上確認(rèn)癌細(xì)胞區(qū)域；然后在10×物鏡下，于FISH標(biāo)本上找到與HE染色切片上相同的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，仔細(xì)觀察信號(hào)；在40×物鏡下掃描整張切片，觀察是否存在表達(dá)的異質(zhì)性，以及標(biāo)本的質(zhì)量，滿意的標(biāo)本應(yīng)是75%以上癌細(xì)胞核中都有雜交信號(hào)；在100×物鏡下觀察癌細(xì)胞核的FISH結(jié)果并進(jìn)行信號(hào)計(jì)數(shù)和比值計(jì)算。24FISH結(jié)果觀察流程觀察程序：24實(shí)體腫瘤FISH應(yīng)用25實(shí)體腫瘤FISH應(yīng)用251.乳腺癌Her-2/neu基因擴(kuò)增檢測(cè)261.乳腺癌Her-2/neu基因擴(kuò)增檢測(cè)2627272828HER2/CEN-171.8-2.2臨界需重新再進(jìn)行另外20個(gè)的細(xì)胞計(jì)數(shù)或重新FISH檢測(cè)，如仍不確定，則建議臨床結(jié)合IHC檢測(cè)HER2蛋白表達(dá)情況決定是否使用靶向治療。CEN-17多體性：計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞內(nèi)綠信號(hào)的均值。CEN-17均值<1.75亞二體性CEN-17均值1.76-2.25二體性CEN-17均值2.26-3.75低多體性CEN-17均值>3.76高多體性29HER2/CEN-171.8-2.2臨界29石蠟切片（ASCO/CAP2013指南）計(jì)數(shù)至少30個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)Ratio值（Ratio值＝30個(gè)細(xì)胞核中紅/綠）。

Ratio≥2.0或者＜2.0但HER-2信號(hào)數(shù)為≥6.0，結(jié)果為陽性，提示基因擴(kuò)增；

Ratio＜2.0且HER-2信號(hào)數(shù)＜4.0為陰性結(jié)果，提示樣本無基因擴(kuò)增；

Ratio＜2.0且4.0≤HER-2信號(hào)數(shù)＜6.0時(shí)結(jié)果為不確定，可以選擇增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至100個(gè),或重做FISH實(shí)驗(yàn)來判斷最終結(jié)果。若紅信號(hào)明顯成簇或成團(tuán)，判斷為擴(kuò)增。乳腺癌HER-2FISH評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)30石蠟切片（ASCO/CAP2013指南）乳腺癌HER-23131323233333434353536362.胃癌Her-2/neu基因擴(kuò)增檢測(cè)372.胃癌Her-2/neu基因擴(kuò)增檢測(cè)373838胃癌HER-2FISH評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)胃癌HER-2檢測(cè)指南：計(jì)數(shù)至少30個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)Ratio值（Ratio值＝30個(gè)細(xì)胞核中紅/綠）。

Ratio≥2.2或者HER-2信號(hào)簇狀，結(jié)果為陽性，提示基因擴(kuò)增；

Ratio＜1.8為陰性結(jié)果，提示樣本無基因擴(kuò)增；

Ratio在1.8-2.2時(shí)，選擇增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至100個(gè),若Ratio≥2.0，判斷為陽性，若Ratio<2.0，判斷為陰性。必要時(shí)重做FISH實(shí)驗(yàn)來判斷最終結(jié)果。39胃癌HER-2FISH評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)胃癌HER-2檢測(cè)指南：3940403.肺癌EML4-ALK基因融和檢測(cè)413.肺癌EML4-ALK基因融和檢測(cè)4142424343肺癌EML4-ALK檢測(cè)指南：計(jì)數(shù)至少50個(gè)腫瘤細(xì)胞1.無ALK基因斷裂的腫瘤細(xì)胞中，橘紅色和綠色重疊為黃色或者相互粘合（兩個(gè)信號(hào)之間的間隔小于兩個(gè)信號(hào)的直徑）；2.在ALK基因斷裂的腫瘤細(xì)胞中，橘紅色和綠色分離（兩個(gè)信號(hào)之間的間隔大于兩個(gè)信號(hào)的直徑），如果50個(gè)肺癌細(xì)胞中至少有25個(gè)存在分離信號(hào)，則為ALK

FISH陽性；3.在ALK基因斷裂的腫瘤細(xì)胞中，橘紅色和綠色分離（兩個(gè)信號(hào)之間的間隔大于兩個(gè)信號(hào)的直徑），如果50個(gè)肺癌細(xì)胞中分離信號(hào)為5—25個(gè)，則需重復(fù)計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，累計(jì)100個(gè)細(xì)胞中超過15個(gè)存在分離信號(hào)（〉=15%）則為ALK

FISH陽性；肺癌EML4-ALK

FISH評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)44肺癌EML4-ALK檢測(cè)指南：肺癌EML4-ALKFISH454546464747484849494.其他實(shí)體腫瘤FISH應(yīng)用1.TOP2A/CSP17(乳腺癌)：指導(dǎo)化療藥物蒽環(huán)類應(yīng)用2.EGFR/CDP17(肺癌)：指導(dǎo)靶向藥物應(yīng)用3.C-MET(肺癌)：指導(dǎo)靶向藥物的應(yīng)用4.TERC/CSP3

(宮頸癌)：判斷CIN病變的演進(jìn)風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)，早診5.CSP3/CSP7、P16/CSP17(膀胱癌)：膀胱癌的早診、復(fù)發(fā)判斷；6.PTEN/CEN10、FGFR1/CEN8、ERG（前列腺癌）：判斷預(yù)后、早診7.1p36/1p25、19q13/19p13、N-Myc/2q11（神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤）：輔助診斷、判斷預(yù)后、指導(dǎo)化療方案應(yīng)用、8.

PTEN/CEN10（黑色素瘤）：指導(dǎo)藥物治療、判斷預(yù)后9.CCND1/CEN11、MDM2/CEN12（間質(zhì)瘤）：判斷預(yù)后10.SYT(滑膜肉瘤)：輔助診斷11.EWS(尤文肉瘤)：輔助診斷12.FKHR(橫紋肌肉瘤)：輔助診斷13.MDM2(脂肪肉瘤)：輔助診斷504.其他實(shí)體腫瘤FISH應(yīng)用1.TOP2A/CSP17(5151返回52返回5253535454返回55返回555656返回57返回575858返回59返回596060返回61返回6162626363返回64返回64返回65返回65返回66返回66返回67返回67返回68返回68血液病FISH應(yīng)用69血液病FISH應(yīng)用69目前常見的淋巴瘤染色體易位檢測(cè)IGH/BCL6t(3;14)t(3;22)t（2；3）染色體易位-彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤IGH/BCL2t(14;18)(q32;q21)染色體易位-濾泡性淋巴瘤IGH/MYCt(8;14)(q24;q32)染色體易位-Burkitt’s淋巴瘤IGH/CCND1t(11;14)(q13;q32)染色體易位-套細(xì)胞淋巴瘤API2/MALT1t(11;18)(q21;q21)染色體易位-粘膜相關(guān)淋巴瘤IGH/MALT1t(14;18)(q32;q21)染色體易位-粘膜相關(guān)淋巴瘤BCR/ABLt(9;22)染色體易位-慢性粒細(xì)胞性白血病PM