基因編輯方法CRISPR-Cas9課件

CRISPR-Cas9一種新型基因編輯方法*CRISPR-Cas9一種新型基因編輯方法*1又稱基因組定點修飾技術，通過在某些物種基因組中進行靶向特異性的突變，從而解答并提出更多精確的生物學問題。方法包括：鋅指核酸酶（Zinc-fingernuclease，ZFN）技術轉錄激活因子樣效應物核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN）技術Cas9/gRNA系統(tǒng)(CRISPR-cas9技術)基因組編輯技術*又稱基因組定點修飾技術，通過在某些物種基2Cell2014157,1262-1278Figure2B不論是TALEN技術還是ZFN技術，其定向打靶都依賴于DNA序列特異性結合蛋白模塊的合成,將蛋白模塊與限制性內切酶(FokⅠ)的DNA切割域融合而得到。由蛋白特異結合域定位，DNA切割域剪切。鋅指核酸酶（ZFN）＆轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALEN）技術Cell2014157,1262-1278Figure2A*Cell2014157,1262-1278Figu3

CRISPR-Cas9技術

原理：規(guī)律性重復短回文序列簇（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPRs）CRISPR-Cas系統(tǒng)是細菌和古細菌在不斷進化的過程中獲得一種適應性免疫防御機制，研究者根據CRISPR-Cas系統(tǒng)的特性對此系統(tǒng)進行改造產生了第3代人工核酸內切酶技術——CRISPR-Cas9技術。該技術通過小片段的RNA介導對入侵的核酸進行靶向定位并通過Cas酶對核酸進行酶切、降解。CRISPR-Cas9技術是一種多物種適應性的，位點特異性的有效基因組編碼工具。Cell2014157,1262-1278Figure4*

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原理：規(guī)律性重復短回文序列4

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從已知的序列中通過PAM進行定位尋找合適的靶位點并合成gRNA構建gRNA與/Cas9重組質粒。對重組質粒進行活性檢測，敲除活性的計算挑選活性較高的敲除質粒導入培養(yǎng)的細胞或者生物體內進行基因組定點編輯操作利用測序、RFLP等方法檢測基因組定點修飾結果*

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從已知的序列中通過PAM5sgRNA的設計選擇PAM（NGG）5‘端的一段堿基序列20nt作為原間隔序列，即敲除的靶位點。(PAM，Protospaceradjacentmotifs原間隔序列臨近基序。一般形式為NGG，其作用是將間隔序列定位于入侵的噬菌體或質粒的DNA序列中)原則：選擇的序列必須在全基因組中進行比對，原間隔序列必須唯一，否則會對其他基因進行敲除而出現(xiàn)錯誤的實驗結果。優(yōu)先選擇DSB位點的側翼存在重復序列（如果DSB的側翼存在重復序列，在進行非同源末端重組時能夠精確的介導斷裂位點堿基的缺失）。PAM的5‘端盡量存在酶切位點。（有利于后期的活性檢測）*sgRNA的設計選擇PAM（NGG）5‘端的一段堿基序列6構建重組質粒構建方案：一是將gRNA與Cas9連入同一個質粒載體中并以雙啟動子啟動，載體中攜帶熒光報告基因（用于流式細胞儀篩選）或抗性基因（用于藥物篩選）。二是將gRNA與Cas9分別連載不同的載體上，兩個載體攜帶有不同的熒光報告基因或抗性基因載體選擇：慢病毒載體

以HIV-1的主要功能元件為基礎構建起來的轉基因和基因治療載體。區(qū)別于腺病毒載體，可實現(xiàn)外源基因在目標細胞內穩(wěn)定的傳代表達。*構建重組質粒構建方案：*7**8降低sgRNA/Cas9脫靶率的方法Cas9的兩個內切酶活性域為RuvC和HNH,兩個亞基分別負責對一條DNA單鏈的切割。任一亞基的失活都將形成DNA單鏈斷裂（nickedDNA）。當結合于兩條互補的DNA鏈上相鄰位置的一對sgRNA同時引導Cas9D10A識別并切割靶位點時才能造成DSB，從而加大了識別的長度，有效的提高了Cas9-sgRNA技術的特異性。Cell2014157,1262-1278Figure6A,B*降低sgRNA/Cas9脫靶率的方法Cas9的9重組質粒導入細胞/生物體C、將編碼Cas9和sgRNA的表達質粒直接轉染至細胞系中。D、將純化的Cas9和體外表達的sgRNA顯微注射至受精卵，快速得到轉基因動物模型。E、將編碼CRISPR組分的高效價的病毒載體轉導至組織或細胞，完成特定時間，組織的基因編輯。Cell2014157,1262-1278Figure6C,D,E*重組質粒導入細胞/生物體C、將編碼Cas9和sgRNA的表達10CRISPR-Cas9技術的應用進展CRISPR/Cas系統(tǒng)可以作為一種位點特異性基因編輯平臺Cas9-sgRNA在靶位點切割產生DSB后，細胞可以通過兩種方式對DNA進行修復，非同源末端連接（non-homologousendjoining，NHEJ）修復方式和同源重組方式（homology-directedrepair，HDR）。NHEJ往往使得核酸鏈被剪切的區(qū)域發(fā)生基因突變，導致編碼的基因Knockdown。而HDR往往通過供體DNA與基因組DNA之間的同源重組造成靶位點的糾正或者靶向插入外源基因Knockin。Cell2014157,1262-1278Figure2A*CRISPR-Cas9技術的應用進展CRISPR/Cas系11CRISPR-Cas9技術的應用進展通過點突變使Cas9蛋白的兩個核酸內切酶結構域活性全部喪失獲得dCas9，將dCas9-sgRNA作為與DNA特異性識別的平臺，令轉錄因子或表觀調控酶與dCas9-sgRNA融合表達，即可實現(xiàn)轉錄水平對基因表達的調節(jié)。Cell2014157,1262-1278Figure6G*CRISPR-Cas9技術的應用進展通過點突12CRISPR-Cas9技術的應用進展

CRISPR/Cas蛋白亞型（Ⅲ型）被證明可以靶向消化RNA底物。預示著該技術的發(fā)展將會代替shRNA/siRNA等傳統(tǒng)RNAi技術成為一種新型的RNA干擾物而對不同種類的細胞及動物模型中特定的基因的下游產物進行RNA干擾。Cell2014157,1262-1278Figure4截圖

*CRISPR-Cas9技術的應用進展CRI13CRISPR-Cas9技術的應用進展

Cell2014157,1262-1278Figure6F*CRISPR-Cas9技術的應用進展Cel14CRISPR-Cas9技術的應用進展

Cell2014157,1262-1278Figure6HCas9和GFP融合表達，可動態(tài)記錄胞內DNA特定位點的染色體結構狀態(tài)

。*CRISPR-Cas9技術的應用進展Cel15CRISPR-Cas9技術的應用進展

Cell2014157,1262-1278Figure6I

通過化學或可控因素誘導Cas9肽片段的重建，實現(xiàn)對基因的誘導調控。*CRISPR-Cas9技術的應用進展Cel16展望到目前為止對CRISPR/Cas9技術的開發(fā)尚屬初步。雖然Cas9系統(tǒng)會被sgRNA引導從而識別出靶序列，但脫靶效應依然存在，特異性仍待提高。與成熟的ZFN和TALEN