免疫細(xì)胞的凋亡課件

第十三章免疫細(xì)胞的凋亡有核細(xì)胞一方面存在細(xì)胞分裂、增殖的功能，另一方面又有主動(dòng)發(fā)生死亡的機(jī)制，即細(xì)胞凋亡。這兩種功能均受遺傳嚴(yán)格控制并維持細(xì)胞死亡和增殖的平衡，是多細(xì)胞動(dòng)物借以存活的需要，因而這一對(duì)矛盾始終貫穿著動(dòng)物整個(gè)生命過程。細(xì)胞凋亡在免疫系統(tǒng)的發(fā)育、分化和成熟以及保持其功能穩(wěn)定性方面均發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞凋亡是免疫細(xì)胞進(jìn)化過程中的一種高度保守的基本生理功能。然而，宿主在與病毒相互作用中所發(fā)生的凋亡并不都一定有利于宿主。第十三章免疫細(xì)胞的凋亡有核細(xì)胞一方面存在細(xì)胞分裂、增殖的功1第一節(jié)

凋亡的生物學(xué)特征第一節(jié)

凋亡的生物學(xué)特征2一、凋亡的概念凋亡(apoptosis)是機(jī)體的正常細(xì)胞在受到生理性和病理性刺激后啟動(dòng)的自發(fā)的死亡過程，是一種主動(dòng)的、信號(hào)依賴的過程。其典型的特征是一種內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活和由此導(dǎo)致的細(xì)胞染色體DNA的降解。這種細(xì)胞死亡方式的另一個(gè)特點(diǎn)是，降解的胞漿及胞核成份被包裹于膜性成分中而形成凋亡小體。胞膜成分和結(jié)構(gòu)的改變可以被吞噬細(xì)胞表面的粘附分子及磷脂酰絲氨酸受體(phosphatidylserinereceptor)快速識(shí)別，凋亡細(xì)胞被吞噬并降解，因此不引起局部的炎癥反應(yīng)。一、凋亡的概念凋亡(apoptosis)是機(jī)體的正常細(xì)胞在受3凋亡的形態(tài)特征是，細(xì)胞首先皺縮，隨即與鄰近細(xì)胞脫離，失去微絨毛，胞漿濃縮，內(nèi)織網(wǎng)擴(kuò)張呈泡狀并與細(xì)胞膜融合，核染色質(zhì)密度增高呈半月形，并凝集在核膜周邊，核仁裂解，進(jìn)而胞膜內(nèi)陷將細(xì)胞自行分割為多個(gè)外有膜包裹、內(nèi)涵物不外溢的細(xì)胞小體—凋亡小體。凋亡的形態(tài)特征是，細(xì)胞首先皺縮，隨即與鄰近細(xì)胞脫離，失去微絨4免疫細(xì)胞的凋亡課件5二、凋亡與壞死、程序化死亡1．壞死(necrosis)是一種病理狀態(tài)下的細(xì)胞死亡。它是由于某些外界因素，比如局部缺血、高熱以及物理、化學(xué)損傷和生物的侵襲等，造成細(xì)胞急速死亡。細(xì)胞壞死首先是膜通透性增加，細(xì)胞外形發(fā)生不規(guī)則變化，內(nèi)織網(wǎng)擴(kuò)張，核染色質(zhì)不規(guī)則地移位，進(jìn)而線粒體及核腫脹，溶酶體破壞，細(xì)胞膜破裂，胞漿外溢。這種死亡過程常常引起炎癥反應(yīng)。2．程序化死亡(programmedcelldeath,PCD)與細(xì)胞凋亡在概念上是有區(qū)別的。細(xì)胞凋亡是形態(tài)學(xué)的概念，而PCD是功能性的概念，細(xì)胞凋亡是PCD的一種形式。二、凋亡與壞死、程序化死亡1．壞死(necrosis)是6免疫細(xì)胞的凋亡課件7第二節(jié)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)劑和抑制劑多種因素可參與誘導(dǎo)和抑制細(xì)胞凋亡。

誘導(dǎo)凋亡的因素眾多，可分為：（1）物理性，如放射線、紫外線、高溫；（2）化學(xué)性，如抗癌藥物、氧自由基、一氧化氮；（3）微生物，如HIV、EBV；（4）缺乏細(xì)胞生長(zhǎng)必需因子，如干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、雌激素、雄激素；（5）免疫性，指抗原和免疫應(yīng)答過程中所產(chǎn)生的細(xì)胞因子和細(xì)胞膜分子。

慢性缺血、營(yíng)養(yǎng)耗盡等也可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。第二節(jié)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)劑和抑制劑多種因素可參與誘導(dǎo)和抑制細(xì)胞8（一）Ca2+、Mg2+內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶為Ca2+/Mg2+依賴性，故胞內(nèi)Ca2+/Mg2+濃度升高可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。直接用含Ca2+/Mg2+的溶液與胸腺細(xì)胞孵育，90分鐘即可檢出DNA水解片段。Ca2+不僅是細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)劑，在其他因素誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)過程中，Ca2+也是重要的信號(hào)分子。Zn2+拮抗Ca2+/Mg2+的作用。（一）Ca2+、Mg2+內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶為Ca2+/Mg29（二）糖皮質(zhì)激素糖皮質(zhì)激素是常見的凋亡誘導(dǎo)劑。未成熟的胸腺細(xì)胞對(duì)激素誘導(dǎo)的凋亡敏感，而成熟的T細(xì)胞則不敏感。蛋白合成抑制劑（放線菌素D、放線菌酮）可拮抗糖皮質(zhì)激素的致凋亡作用，表明糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的凋亡與新蛋白質(zhì)的合成有關(guān)。（二）糖皮質(zhì)激素糖皮質(zhì)激素是常見的凋亡誘導(dǎo)劑。未成熟的胸腺細(xì)10（三）細(xì)胞因子（CK）某些CK有促進(jìn)凋亡的作用（如TNF等），某些CK則抑制凋亡（如IL-3、GM-CSF等）。另外一些CK，如IL-2、IFN-

、I-10等，對(duì)凋亡的發(fā)生有雙重效應(yīng)。IL-2一般可維持細(xì)胞生存和抑制凋亡。T細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)若去除IL-2，則會(huì)發(fā)生凋亡。但也有人發(fā)現(xiàn)，若先用IL-2處理T細(xì)胞再用抗原刺激，可引起凋亡；應(yīng)用IL-2抗體則可抑制T細(xì)胞凋亡。由此可見，CK受體的表達(dá)水平對(duì)于細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)具有重要意義。（三）細(xì)胞因子（CK）某些CK有促進(jìn)凋亡的作用（如TNF等）11（四）細(xì)胞表面受體和配體的相互作用T細(xì)胞的CD28與其它細(xì)胞上的B7的相互作用，以及B細(xì)胞的CD40與T細(xì)胞上的CD40L相互作用，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)抑制凋亡的基因的表達(dá)，從而不利于凋亡的發(fā)生。（四）細(xì)胞表面受體和配體的相互作用T細(xì)胞的CD28與其它細(xì)胞12（五）抗體針對(duì)多種細(xì)胞表面成分的抗體，如抗IgM、抗Fas、抗CD3／TCR、抗CD4、抗CD8、抗CD23抗體等，均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。不同的抗體可使表達(dá)相應(yīng)膜抗原的不同細(xì)胞發(fā)生凋亡，但相同的抗體-膜抗原系統(tǒng)在不同的細(xì)胞也可能產(chǎn)生不同的效應(yīng)。如抗CD3單抗可誘導(dǎo)未成熟T細(xì)胞凋亡，但可促進(jìn)成熟T細(xì)胞增殖。（五）抗體針對(duì)多種細(xì)胞表面成分的抗體，如抗IgM、抗Fas、13（六）細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子調(diào)節(jié)劑某些胞內(nèi)信號(hào)分子調(diào)節(jié)劑對(duì)不同靶細(xì)胞可分別具有誘導(dǎo)或抑制凋亡的作用。如蛋白激酶C（PKC）激活劑PMA可抑制鼠T、B細(xì)胞凋亡，但可誘導(dǎo)鼠胸腺細(xì)胞的凋亡。上述結(jié)果提示，PKC在成熟或未成熟淋巴細(xì)胞的凋亡信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮不同效應(yīng)。（六）細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子調(diào)節(jié)劑某些胞內(nèi)信號(hào)分子調(diào)節(jié)劑對(duì)不同靶細(xì)胞14（七）超抗原、絲裂原超抗原金色葡萄球菌腸毒素可誘導(dǎo)胸腺內(nèi)CD4+CD8+細(xì)胞凋亡絲裂原PWM可誘導(dǎo)成熟及未成熟T細(xì)胞凋亡。（七）超抗原、絲裂原超抗原金色葡萄球菌腸毒素可誘導(dǎo)胸腺內(nèi)CD15第三節(jié)細(xì)胞凋亡的生化改變第三節(jié)細(xì)胞凋亡的生化改變16一、胞內(nèi)Ca2+濃度增高在所有類型的細(xì)胞凋亡過程中，都觀察到胞內(nèi)Ca2+濃度增高，這可能是由于Ca2+內(nèi)流所致。已發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用鈣離子載體可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，提示Ca2+本身可能就是凋亡的啟動(dòng)因素之一。應(yīng)用類固醇激素誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，其條件是培養(yǎng)環(huán)境中必須有Ca2+存在，若去除培養(yǎng)基中的Ca2+，則凋亡不能發(fā)生。一、胞內(nèi)Ca2+濃度增高在所有類型的細(xì)胞凋亡過程中，都觀察17二、內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活

細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡時(shí)，DNA被從核小體連接處水解，因此形成180

200bp或其倍數(shù)的片段，這主要是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活的結(jié)果。該酶為Ca2+／Mg2+依賴性，而Zn2+則是該內(nèi)切酶的有效抑制劑。生理狀況下，核內(nèi)Zn2+濃度較高；發(fā)生凋亡時(shí)，可能由于胞漿Ca2+濃度增高，置換了核內(nèi)的Zn2+，從而激活內(nèi)切酶并水解DNA。二、內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡時(shí)，DNA被從核小體連18三、生物大分子的合成

凋亡過程的發(fā)生一般需要合成新的RNA和蛋白質(zhì)，如在激素、射線作用下，或由于去除生長(zhǎng)因子等所引起的細(xì)胞凋亡中，即為如此。蛋白質(zhì)或RNA合成抑制劑如吐根堿、放線菌素等可抑制這種類型凋亡的發(fā)生。已發(fā)現(xiàn)，凋亡細(xì)胞中許多酶的含量增加，如轉(zhuǎn)氨酶、核糖核酸酶、組織蛋白酶、

-谷酰轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)肽酶等。另外，某些細(xì)胞凋亡的誘因可激活與凋亡發(fā)生有關(guān)的基因（詳后），后者編碼相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物，也使蛋白質(zhì)合成增加。三、生物大分子的合成凋亡過程的發(fā)生一般需要合成新的RNA和19第四節(jié)

凋亡的啟動(dòng)細(xì)胞存活除了受生長(zhǎng)因子和細(xì)胞死亡受體的外在調(diào)節(jié)外，胞內(nèi)事件也能啟動(dòng)凋亡。DNA的損傷能夠誘導(dǎo)凋亡，其中的大部分信號(hào)傳導(dǎo)途徑都由p53介導(dǎo)。對(duì)程序性細(xì)胞死亡的耐受有助于腫瘤的發(fā)生，由此可以解釋為什么如此眾多的人類癌癥中都存在p53的突變。事實(shí)上，任何持續(xù)存在的細(xì)胞新陳代謝或細(xì)胞周期的混亂都能誘導(dǎo)凋亡。這些現(xiàn)象提示，凋亡的調(diào)控可能不僅僅是通過單一信號(hào)途徑來實(shí)現(xiàn)的，而是由各種信號(hào)通路的相互協(xié)調(diào)來調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡的易感性。第四節(jié)

凋亡的啟動(dòng)細(xì)胞存活除了受生長(zhǎng)因子和細(xì)胞死亡受體的外在20

雖然這些細(xì)胞新陳代謝或周期干擾調(diào)控程序性細(xì)胞死亡的特定結(jié)合點(diǎn)尚未確定，但已發(fā)現(xiàn)一些涉及細(xì)胞存活調(diào)控的胞內(nèi)干擾控現(xiàn)象。在眾多不同的細(xì)胞系統(tǒng)中，胞內(nèi)鈣的升高、胞內(nèi)pH值的下降以及細(xì)胞氧化還原電位的改變都可以增加細(xì)胞對(duì)PCD的敏感性。與其他凋亡通路不同，通過細(xì)胞表面受體啟動(dòng)凋亡的信號(hào)通路已逐漸被確定。例如，TNF相關(guān)受體啟動(dòng)的信號(hào)通路都涉及蛋白酶的激活。在細(xì)胞死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路中，最典型的蛋白酶即是caspase家族的成員。

雖然這些細(xì)胞新陳代謝或周期干擾調(diào)控程序性細(xì)胞死亡的特定結(jié)合21第五節(jié)死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡第五節(jié)死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡22一、腫瘤壞死因子受體超家族死亡受體是一組膜表面受體，與相應(yīng)的配體結(jié)合后，可以引起受體表達(dá)細(xì)胞的凋亡。死亡受體都屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族，該家族也被稱為神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)超家族。TNFR超家族成員都是I型膜表面受體，除死亡受體外，還包括一些能引起細(xì)胞增殖、活化等反應(yīng)的分子。TNFR超家族成員的膜配體都是II型膜蛋白，這些配體構(gòu)成了TNF超家族。一、腫瘤壞死因子受體超家族死亡受體是一組膜表面受體，與相應(yīng)的23（一）TNFR超家族的結(jié)構(gòu)特征TNFR超家族和TNF超家族是以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的，各成員間不僅在氨基酸序列上具有不同程度的同源性，而且在空間結(jié)構(gòu)上也很相似。TNFR超家族成員均為I型跨膜糖蛋白，它們?cè)诎ね鈪^(qū)含有2-6個(gè)約由40個(gè)氨基酸殘基組成的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(cysteine-richdomain,CRD)。（一）TNFR超家族的結(jié)構(gòu)特征TNFR超家族和TNF超家族24TNFR超家族成員的胞漿區(qū)變化比較大，最短的只有21aa，最長(zhǎng)的如TNFRI，有233aa。各成員間胞漿區(qū)沒有明顯的同源性，但介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)的成員，如TNFRI和Fas的胞漿區(qū)均含有約一個(gè)60

80aa的同源序列，稱為死亡結(jié)構(gòu)域(deathdomain，DD)，該結(jié)構(gòu)域與這些受體的凋亡信號(hào)及其它信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。TNFR超家族成員的胞漿區(qū)變化比較大，最短的只有21aa，最25（二）TNFR超家族的成員死亡受體包括TNFRI、Fas、DR3、DR4、DR5、CAR1等，它們的共同特征是胞漿區(qū)都有DD，死亡受體通過這個(gè)結(jié)構(gòu)域與胞漿中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)的蛋白質(zhì)結(jié)合，通過后者啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)部的凋亡程序，引起細(xì)胞凋亡，所以這個(gè)結(jié)構(gòu)域被稱為死亡結(jié)構(gòu)域。（二）TNFR超家族的成員死亡受體包括TNFRI、Fas、26

271．Fas/FasL（1）Fas與FasL的結(jié)構(gòu)與分布Fas（CD95）也稱Apo-1，F(xiàn)as基因定位于人染色體10q24.1。其編碼產(chǎn)物分子量為45kDa的I型跨膜蛋白，由胞外區(qū)（157aa）、跨膜區(qū)（17aa）及胞漿區(qū)（145aa）組成。

1．Fas/FasL28對(duì)Fas胞漿區(qū)氨基酸序列的比較發(fā)現(xiàn)，它與TNFRI有一段68aa的同源序列，這段序列對(duì)Fas和TNFRI所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起著決定性的作用，用基因突變的方法將同源區(qū)進(jìn)行改造后，它們就喪失了致凋亡的能力，所以這一同源區(qū)被命名為死亡結(jié)構(gòu)域（deathdomain，DD）。以后的研究發(fā)現(xiàn)，死亡結(jié)構(gòu)域也存在于其它死亡受體以及一些胞漿內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，受體的死亡結(jié)構(gòu)域可以與胞漿信號(hào)蛋白的死亡結(jié)構(gòu)域發(fā)生同源或異源結(jié)合，所以這個(gè)結(jié)構(gòu)域的作用是作為一個(gè)接頭將死亡受體與胞漿信號(hào)通路聯(lián)系起來。

對(duì)Fas胞漿區(qū)氨基酸序列的比較發(fā)現(xiàn)，它與TNFRI有一段6829Fas主要以膜受體形式存在，還可通過在轉(zhuǎn)錄水平的不同拼接產(chǎn)生可溶性Fas分子（sFas），后者在細(xì)胞凋亡中起調(diào)節(jié)作用。Fas較廣泛地分布于多種類型的細(xì)胞，包括外周活化T、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝膽管細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞及皮膚組織細(xì)胞等。某些組織細(xì)胞經(jīng)活化后也可誘導(dǎo)Fas表達(dá)。Fas主要以膜受體形式存在，還可通過在轉(zhuǎn)錄水平的不同拼接產(chǎn)生30

FasL（CD95L）為TNF相關(guān)的II型膜分子，基因位于1號(hào)染色體，長(zhǎng)278aa，分子量40kDa，其N端在胞漿內(nèi)，跨膜部有一疏水域，其C端位于胞膜外，胞外區(qū)約150個(gè)氨基酸與TNF家族成員高度同源。因FasL能與Fas結(jié)合誘發(fā)凋亡，故把FasL稱死亡因子。FasL亦可分泌或脫落至細(xì)胞外，成為可溶性的功能活性分子。FasL主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞。

FasL（CD95L）為TNF相關(guān)的II型膜分子，基因位于31

（2）Fas和FasL的生物學(xué)效應(yīng)TNFR/NGFR超家族中，只有Fas和TNFRI型可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且Fas介導(dǎo)細(xì)胞凋亡必須具備3個(gè)條件：①細(xì)胞表達(dá)足夠密度的Fas；②Fas與其配體或單抗作用形成三聚體；③細(xì)胞關(guān)閉抗凋亡程序而成為凋亡敏感型細(xì)胞。雖然許多組織均可表達(dá)Fas，但免疫系統(tǒng)對(duì)Fas系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡最為敏感。

（2）Fas和FasL的生物學(xué)效應(yīng)TNFR/NGFR超32（3）Fas和FasL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制Fas一旦和配體FasL結(jié)合，可通過Fas分子啟動(dòng)致死性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終引起細(xì)胞一系列特征性變化，使細(xì)胞死亡。Fas作為一種普遍表達(dá)的受體分子，可以出現(xiàn)在多種細(xì)胞表面，包括淋巴細(xì)胞。但FasL的表達(dá)卻有其特點(diǎn)，通常只出現(xiàn)于活化的T細(xì)胞(特別是活化的CTL)和NK細(xì)胞，因而已被活化的殺傷性免疫細(xì)胞，往往能夠最有效地以凋亡途徑置靶細(xì)胞于死地。表達(dá)FasL的效應(yīng)殺傷細(xì)胞會(huì)與自身表達(dá)的Fas結(jié)合，誘導(dǎo)自身的凋亡過程（AICD）。（3）Fas和FasL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制33Fas分子胞內(nèi)段帶有特殊的死亡結(jié)構(gòu)域(DD,deathdomain)。三聚化的Fas和FasL結(jié)合后，使三個(gè)Fas分子的死亡結(jié)構(gòu)域相聚成簇，吸引了胞漿中另一種帶有相同死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白FADD。FADD由兩部分組成：DD和DED。DED指死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，因而FADD是死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的一個(gè)連接蛋白。該蛋白再以其DED連接另一個(gè)帶有DED的后續(xù)成分，即caspase8，后者作為酶原而被激活，引發(fā)一組caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Fas分子胞內(nèi)段帶有特殊的死亡結(jié)構(gòu)域(DD,deathdo34

35（4）Fas/FasL異常所引起的疾病小鼠天然突變性疾病(lymphoproliferation，lpr)的突變發(fā)生于小鼠19號(hào)常染色體。對(duì)lpr小鼠Fas基因的分析發(fā)現(xiàn)，一個(gè)長(zhǎng)約5.7kb的反轉(zhuǎn)座子ETn插入到Fas基因的第二個(gè)內(nèi)含子。這個(gè)ETn在長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)中帶有一個(gè)多聚腺苷酸信號(hào)(AATAAA)，引起Fas基因的異常剪接和提前終止。在lpr小鼠肝臟和胸腺只有非常少的FasmRNA，而且往往成熟mRNA中只有外顯子1和2，不能編碼正常Fas。lpr小鼠明顯的特征是出現(xiàn)大量自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞，能輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，而不出現(xiàn)AICD。（4）Fas/FasL異常所引起的疾病362．TNFRI（1）TNFRI的結(jié)構(gòu)

腫瘤壞死因子受體I(TNFRI)，CD編號(hào)為CD120a，是55

60kDI型跨膜糖蛋白，成熟膜蛋白長(zhǎng)426aa。胞膜外區(qū)(182aa)有4個(gè)CRD，其中有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)?？缒^(qū)有21aa，胞漿區(qū)較長(zhǎng)，有223aa，有3個(gè)蛋白激酶C(PKC)作用位點(diǎn)，1個(gè)蛋白酪氨酸激酶(PTK)的作用位點(diǎn)。TNFRI在胞漿區(qū)有一個(gè)約80aa的死亡結(jié)構(gòu)域。2．TNFRI37

（2）TNFRI的生物學(xué)功能

TNFRI與配體TNF結(jié)合后，主要介導(dǎo)凋亡信號(hào)，引起細(xì)胞凋亡，在抗腫瘤和抗病毒感染中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)也參與自身免疫性疾病和敗血癥中對(duì)自身組織細(xì)胞的損傷。TNFRI也可以介導(dǎo)活化信號(hào)和增殖信號(hào)，誘導(dǎo)一氧化氮合成酶和IL-8的活性，活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-

B和AP-1。

（2）TNFRI的生物學(xué)功能38免疫細(xì)胞的凋亡課件39二、腫瘤壞死因子受體超家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白含有死亡結(jié)構(gòu)域的胞漿蛋白包括TRADD、FADD、RIP，以及新發(fā)現(xiàn)的CRADD、MADD等，它們?cè)陔逆湹聂然硕加幸欢瓮吹乃劳鼋Y(jié)構(gòu)域。這些蛋白質(zhì)通過死亡結(jié)構(gòu)域與死亡受體的胞漿區(qū)相作用，并傳遞死亡受體活化后引起的種信號(hào)。死亡結(jié)構(gòu)域不具有蛋白激酶或磷酸酯酶活性，但同一種蛋白或不同蛋白中的死亡結(jié)構(gòu)域可以互相結(jié)合，通過這種結(jié)合將信號(hào)下傳，從而將死亡受體與配體結(jié)合所產(chǎn)生的信號(hào)與胞漿事件聯(lián)系起來。二、腫瘤壞死因子受體超家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白含有死亡結(jié)構(gòu)域的胞漿40（一）死亡結(jié)構(gòu)域信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能1．TRADD

TRADD(TNFreceptor-associateddeathdomainprotein)是一種34kDa的與TNFRI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的蛋白質(zhì)，當(dāng)TNFRI與配體結(jié)合后，受體發(fā)生多聚化，受體胞漿區(qū)的死亡結(jié)構(gòu)域就可以結(jié)合TRADD羧基端的死亡結(jié)構(gòu)域，通過TRADD向下游傳遞信號(hào)。（一）死亡結(jié)構(gòu)域信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能1．TRADD41

2．FADD

FADD(Fas-associateddeathdomainprotein)是一種23kDa的蛋白，通過其羧基端的死亡結(jié)構(gòu)域（DD）與活化Fas的胞漿區(qū)結(jié)合。FADD的氨基端的序列被稱為死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(deatheffectordomain,DED)。DED象死亡結(jié)構(gòu)域一樣也是一種介導(dǎo)蛋白之間相互作用的接頭結(jié)構(gòu)域，具有DED結(jié)構(gòu)的蛋白之間可以互相結(jié)合起來?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一系列具有DED結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，它們?cè)诩?xì)胞凋亡的信號(hào)傳遞及調(diào)節(jié)過程中也都具有一定的作用。

2．FADD

FADD(Fas-associatedde42

3．RIP

RIP(receptor-interactingprotein)，RIP的分子量為74kDa，它不但可以和Fas結(jié)合，還可以通過TRADD間接與TNFRI結(jié)合。RIP除了羧基端的死亡結(jié)構(gòu)域外，其氨基端還有一個(gè)蛋白激酶同源區(qū)(proteinkinasehomolog,PKH)。RIP的作用還不是很清楚。

3．RIP

RIP(receptor-interactin43

4．CRADD

CRADD(caspaseandRIPadaptorwithdeathdomain)是一種分布很廣泛的胞漿信號(hào)蛋白，它的結(jié)構(gòu)很獨(dú)特，在羧基端有一個(gè)可以與RIP結(jié)合的死亡結(jié)構(gòu)域，在氨基端則有一個(gè)與caspase蛋白酶同源并能與caspase-2作用的結(jié)構(gòu)域。CRADD在細(xì)胞中過量表達(dá)也可以引起細(xì)胞凋亡。

4．CRADD

CRADD(caspaseandRIP445．MADD

MADD(MAPkinase-activatingdeathdomainprotein)是一個(gè)與TNFRI胞漿區(qū)有關(guān)的信號(hào)蛋白，它是最長(zhǎng)的含有死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白，有1588個(gè)氨基酸殘基，在羧基端也有一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域，通過這個(gè)結(jié)構(gòu)域與活化的TNFRI結(jié)合，并激活胞漿中MAPK和JNK等蛋白激酶，進(jìn)而活化AP-1、ATF2和ELK-1等轉(zhuǎn)錄因子。5．MADD

MADD(MAPkinase-activat45（二）死亡結(jié)構(gòu)域信號(hào)蛋白在死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用1．死亡結(jié)構(gòu)域信號(hào)蛋白介導(dǎo)死亡受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)死亡結(jié)構(gòu)域信號(hào)蛋白是死亡受體與胞漿成分之間聯(lián)系的紐帶，F(xiàn)ADD蛋白一方面通過DD結(jié)構(gòu)域結(jié)合Fas胞漿區(qū)，另一方面通過DED結(jié)構(gòu)域與下游的caspase蛋白酶結(jié)合，從而將膜表面受體與胞漿中細(xì)胞凋亡的終末酶聯(lián)系起來。TNFRI的凋亡信號(hào)也是由FADD介導(dǎo)的，但TNFRI不能直接結(jié)合FADD，通過TRADD來與FADD發(fā)生聯(lián)系。（二）死亡結(jié)構(gòu)域信號(hào)蛋白在死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用1．死亡結(jié)46

2．死亡結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

死亡結(jié)構(gòu)域的相互結(jié)合是死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵。對(duì)TRADD死亡結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)突變研究分析表明，死亡結(jié)構(gòu)域是作為一個(gè)整體介導(dǎo)TRADD與TNFRI的結(jié)合的，不能再劃分為小的結(jié)構(gòu)單元或基序，所以推測(cè)死亡結(jié)構(gòu)域可能具有特定的空間構(gòu)形。

2．死亡結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

死亡結(jié)構(gòu)域的相互結(jié)合是死47三、caspase蛋白酶家族最初有關(guān)凋亡基因的研究來自一種線蟲CE（Caenorhabditiselegans），在其發(fā)育過程中，14個(gè)基因與CE的體細(xì)胞凋亡有關(guān)，其中ced-3、ced-4基因參與所有細(xì)胞的凋亡。而CED-9可使胚胎發(fā)育避免PCD。在哺乳動(dòng)物，原癌基因BcL-2和CED-9相關(guān)；CED-3與IL-1轉(zhuǎn)化酶（ICE）序列具有相似性；凋亡蛋白酶活化因子1（apoptoticproteaseactivatingfactor1,Apaf-1）是CED-4的同源蛋白。Apaf-1是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一種蛋白。CED-4可活化CED-3。三、caspase蛋白酶家族最初有關(guān)凋亡基因的研究來自一種線48ICE/CED-3蛋白酶的活性是由活性中心的半胱氨酸上的巰基發(fā)揮的，所以屬于半胱氨酸酶類。這個(gè)家族的蛋白酶具有特異性地在特定的氨基酸序列中將肽鏈從天門冬氨酸(Asp)之后切斷的活性。經(jīng)過近幾年的工作，目前已經(jīng)從人和動(dòng)物細(xì)胞中克隆到十幾種這樣的蛋白酶。1996年Alnemri等提出將人源性的ICE/CED-3蛋白酶統(tǒng)一命名為“天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶”(cysteinylaspartate-specificprotease,caspase)，并將已經(jīng)克隆出來的人的ICE蛋白酶依次命名為caspase-1

14，其中ICE為caspase-1。ICE/CED-3蛋白酶的活性是由活性中心的半胱氨酸上的巰基49（一）caspase家族的結(jié)構(gòu)與分類1．Caspase分子結(jié)構(gòu)未活化的caspase家族蛋白酶是以酶原形式存在的，酶原的氨基端有一段被稱為“原結(jié)構(gòu)域”(pro-domain)的序列。酶原活化時(shí)不但要將原結(jié)構(gòu)域切除，并且要將剩余部分剪切成一大一小兩個(gè)亞基，分別稱為p20和p10，活性酶就是由這兩種亞基以(p20/p10)2的形式組成的。這種活化反應(yīng)也是Asp特異的，剪切發(fā)生在Asp與其后的氨基酸殘基之間。這種剪切可以是酶原及中間活性酶自我催化，也可以是其它ICE家族蛋白酶的作用，還有其它酶類如顆粒酶B參與。（一）caspase家族的結(jié)構(gòu)與分類1．Caspase分子50

2．Caspase蛋白酶的分類

根據(jù)Caspase蛋白酶在機(jī)體中的作用可分為啟動(dòng)酶（包括Caspase2、Caspase8、Caspase9、Caspase10）、效應(yīng)酶（包括Caspase3、Caspase6、Caspase7）和ICE（包括Caspase1、Caspase4、Caspase5、Caspase11、Caspase12、Caspase13、Caspase14）三個(gè)亞類。

2．Caspase蛋白酶的分類51（二）ICE亞類caspase蛋白酶1．caspase-1(ICE)ICE即IL-1

轉(zhuǎn)化酶(IL-1

convertingenzyme)，是單核細(xì)胞合成的一種蛋白酶，可以將34kD的IL-1

前體剪切為17kD的成熟IL-1

，這種剪切對(duì)于IL-1

活性的發(fā)揮是必須的。ICE屬于半胱氨酸蛋白酶，活性中心有高活性的巰基，對(duì)氧化劑很敏感，但對(duì)絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶的抑制劑不敏感。

（二）ICE亞類caspase蛋白酶1．caspase-1(522．caspase-4caspase-4基因定位于人染色體11q22.2-22.3，所編碼的蛋白包含377aa，分子量約43kD，一級(jí)結(jié)構(gòu)與ICE有53%的同源性，在切除104aa的原結(jié)構(gòu)域后同源性更高達(dá)60%，所有與酶活性中心(QACRG)和與結(jié)合底物有關(guān)的氨基酸殘基都得到了保留。caspase-4分布較廣，除腦組織外在所有檢測(cè)的組織中都有表達(dá)。caspase-4的活性形式也是由P20和P10兩種亞基組成。將caspase-4基因轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞系可以引起典型的凋亡變化，提示caspase-4在細(xì)胞凋亡中起一定的作用。2．caspase-453

3．caspase-5

caspase-5包含418aa，分子量47.7kD，與ICE有51%的同源性，并具有保守的活性中心QACRG。但caspase-5不能剪切pro-IL-1b，在過量表達(dá)時(shí)可以誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。

3．caspase-5

caspase-5包含418aa，54

4．caspase-11caspase-11表達(dá)于許多組織，與ICE表達(dá)模式相似，并可以被LPS所誘導(dǎo)。在Rat-1細(xì)胞中過量表達(dá)caspase-11可以引起細(xì)胞凋亡，CrmA和BcL-2可以阻斷這種凋亡。caspase-11可以被顆粒酶B剪切并活化。caspase-11雖不能剪切IL-1

前體，但可以活化ICE，通過ICE再活化IL-1

。所以在細(xì)胞凋亡中，caspase-11可能作用于ICE上游，在受LPS刺激后首先活化，然后再通過活化ICE，一方面剪切IL-1

，引起炎癥反應(yīng)，另一方面還可以在有些細(xì)胞中引起細(xì)胞凋亡。

4．caspase-1155（三）啟動(dòng)亞類caspase蛋白酶起始Caspase(Caspase—2、8、10、9)含蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的長(zhǎng)N末端結(jié)構(gòu)域，即死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)或CARD(caspaserecruitmentdomain)，可分別與接頭蛋白的同源結(jié)構(gòu)域作用，例如，Caspase－9的CARD與Apaf－1的CARD結(jié)合；Caspase－8的DED可與FADD的DED結(jié)合。起始Caspase與接頭蛋白結(jié)合而聚集，被募集的起始Caspase前體發(fā)生構(gòu)象改變而被激活。激活的起始Caspase隨即進(jìn)行自身切割，并剪切和激活效應(yīng)Caspase，或通過剪切其他底物(如Bid)而激活線粒體途徑。（三）啟動(dòng)亞類caspase蛋白酶起始Caspase(Cas56

1．caspase-8（1）caspase-8的結(jié)構(gòu)和分布

Caspase-8前體共有479aa，分子量為55kD，其顯著的特點(diǎn)是在N端有2個(gè)70aa左右的結(jié)構(gòu)域，與FADD的N端的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(deatheffectordomain,DED)同源，這種同源的結(jié)構(gòu)域可以發(fā)生相互聚合，提供了caspase-8與FADD相互結(jié)合的一個(gè)部位。caspase-8分布于胎兒和成人的各種組織中，但在胎腦中沒有分布。在外周血白細(xì)胞中水平較高，可能與白細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

1．caspase-857

（2）caspase-8的活化和參與細(xì)胞凋亡caspase-8可以自我活化，也可以在顆粒酶B的剪切下活化。caspase8特異性識(shí)別的序列是DEVD，活化的caspase-8不但可以剪切PARP，而且還參與其它ICE家族蛋白酶，如caspase-3和caspase-7的活化過程。

（2）caspase-8的活化和參與細(xì)胞凋亡caspa58

（3）caspase-8參與細(xì)胞凋亡的機(jī)制

caspase-8具有DED結(jié)構(gòu)域，與FADD結(jié)合。在非活化情況下caspase-8的兩個(gè)DED結(jié)構(gòu)是互相結(jié)合在一起的。當(dāng)細(xì)胞膜表面的Fas與FasL結(jié)合后，受體發(fā)生多聚化，引起FADD與受體胞漿區(qū)死亡結(jié)構(gòu)域互相結(jié)合。這種結(jié)合使FADD的DED結(jié)構(gòu)域發(fā)生變構(gòu)，變構(gòu)后的DED可以與胞漿中caspase-8的一個(gè)DED結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使caspase-8的兩個(gè)DED結(jié)構(gòu)域分開，同時(shí)使caspase-8的ICE同源區(qū)解放出來，恢復(fù)蛋白酶活性，通過自我催化生成活性形式的caspase-8蛋白酶，后者再作用于胞漿中其它ICE家族蛋白酶，使它們發(fā)生逐級(jí)活化。

（3）caspase-8參與細(xì)胞凋亡的機(jī)制59

2．caspase-2在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，caspase-2可通過其原結(jié)構(gòu)域與CRADD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并被活化。48kDa的caspase-2首先被一種caspase-3樣蛋白酶在Asp316剪切成p33和p14，然后再緩慢地在Asp152和Asp330處剪切為p18和p12組成的活性蛋白酶，后一過程要在2

3h后才能完成。caspase-2可能參與CTL細(xì)胞的殺傷作用，但它并不能被顆粒酶B直接活化，必須被一種caspase-3樣蛋白酶活化。

2．caspase-260

3．caspase-9

caspase-9與其它成員有30%左右的同源性，它的原結(jié)構(gòu)域很長(zhǎng)，與caspase-3相似。

3．caspase-9

caspase-9與其它成員有30614．caspase-10caspase-10含有497aa，分子量55kD，與其它成員有30

50%的同源性。caspase-10分子結(jié)構(gòu)的顯著特點(diǎn)是其N端也有兩個(gè)FADD氨基端樣結(jié)構(gòu)域，所以它也可能與caspase-8一樣是將細(xì)胞膜事件轉(zhuǎn)化為細(xì)胞漿事件的一個(gè)環(huán)節(jié)。caspase-10分布廣泛，基因定位于2p12。4．caspase-1062（三）效應(yīng)亞類的caspase蛋白酶效應(yīng)Caspase(Casase—3、6、7)含較短或不含結(jié)構(gòu)域,，以無活性的二聚體形式主要存在于胞質(zhì)中，通過剪切其大、小亞單位間的特異位點(diǎn)被而激活。一旦起始Caspase被激活，隨即剪切并激活效應(yīng)Caspase，后者又可互相進(jìn)行剪切，以級(jí)聯(lián)反應(yīng)的方式被激活。最終，激活的效應(yīng)Caspase切割胞內(nèi)底物，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及細(xì)胞代謝，導(dǎo)致凋亡的典型生化和形態(tài)學(xué)變化。（三）效應(yīng)亞類的caspase蛋白酶效應(yīng)Caspase(Ca63

切割核纖層蛋白(lamins)與凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃集、胞核縮小有關(guān)；剪切Caspase激活的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶CAD(Caspase—activateddeoxyribonuclease)的抑制物ICAD，導(dǎo)致核酸內(nèi)切酶釋放并進(jìn)入核內(nèi)致DNA片段化；剪切細(xì)胞骨架蛋白(如肌動(dòng)蛋白actin)可致細(xì)胞片段化，形成小泡樣結(jié)構(gòu)及凋亡小體。凋亡細(xì)胞暴露某些吞噬信號(hào)（如磷脂酰絲氨酸/或細(xì)胞表面糖類變化），即被吞噬細(xì)胞所吞噬。

切割核纖層蛋白(lamins)與凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃集、胞核縮641．caspase-3

現(xiàn)在一般認(rèn)為caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分。1．caspase-3

現(xiàn)在一般認(rèn)為caspase-3是細(xì)胞65

（1）caspase-3的結(jié)構(gòu)

pro-caspase-3含有277個(gè)氨基酸殘基，分子量約32kD，與ICE有30%同源性，與CED-3有35%同源，是caspase家族中與CED-3同源性最高的，不論從結(jié)構(gòu)同源性還是從底物特異性來看都與CED-3很相似，所以有人認(rèn)為它是CED-3在哺乳動(dòng)物中的同源蛋白。pro-caspase-3在活化過程中從Asp28

Ser29和Asp175

Ser176兩處被剪切，形成p17和p10兩個(gè)片段，相當(dāng)于ICE的p20和p10，兩種亞基再組成活性形式的caspase-3。

（1）caspase-3的結(jié)構(gòu)66

（2）caspase-3的活化和參與細(xì)胞凋亡caspase-3可以被多種因素活化，在CTL細(xì)胞的殺傷作用中，它既可被Fas/FasL途徑活化，也可以通過顆粒酶B途徑活化。顆粒酶B是CTL細(xì)胞顆粒中的一種絲氨酸酯酶，是哺乳動(dòng)物中caspase蛋白酶外唯一的在Asp后剪切的蛋白酶。

（2）caspase-3的活化和參與細(xì)胞凋亡67

（3）caspase-3引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制caspase-3最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP[poly(ADP-ribose)polymerase]，該酶與DNA修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)有關(guān)。在細(xì)胞凋亡啟動(dòng)時(shí)，116kD的PARP在Asp216-Gly217之間被caspase-3剪切成31kD和85kD兩個(gè)片段，使PARP中與DNA結(jié)合的兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)與羧基端的催化區(qū)域分離，不能發(fā)揮正常功能。結(jié)果使受PARP負(fù)調(diào)控影響的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，引起細(xì)胞凋亡。

（3）caspase-3引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制68

2.caspase-6caspase6與caspase-3有38%同源性，可以在昆蟲細(xì)胞中引起細(xì)胞凋亡。caspase6可以剪切層蛋白B，而且其活性對(duì)Zn2+敏感，這是唯一一個(gè)可以剪切層蛋白的caspase。caspase識(shí)別的序列也是VEID。它不能剪切U1-70K和DNA-PK，但可以部分剪切PARP，并可活化caspase3。

2.caspase-6693.caspase-7caspase-7包含304aa，分子量35kDacaspase-7是與caspase-3同源性最高的成員，有58%的同源性，與其它c(diǎn)aspase有35%的同源性。caspase-7可以分別在Asp23

Ala24、Asp198

Ser199和Asp206

Ala207之間被剪切，形成P20/P12形式的caspase-7。caspase-7分布很廣泛，在腦中也有少量存在。當(dāng)Fas和TNF引起的細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞內(nèi)caspase-7也被活化。caspase7不能剪切pro-IL-1

，但它可以剪切PARP和固醇調(diào)節(jié)元件。3.caspase-770

（四）效應(yīng)caspase酶引起凋亡的機(jī)制細(xì)胞在受到凋亡刺激后數(shù)秒鐘內(nèi)即發(fā)生caspase蛋白酶的話化，在30

60分鐘內(nèi)即可完成整個(gè)細(xì)胞凋亡和清除過程，其中包括DNA的片段化、染色質(zhì)固縮、細(xì)胞膜水泡樣變、細(xì)胞皺縮并向內(nèi)包裹形成凋亡小體等。caspase蛋白酶是引起這些變化的主要直接因素。

（四）效應(yīng)caspase酶引起凋亡的機(jī)制細(xì)胞在受到凋亡刺激71

1．破壞細(xì)胞抗凋亡因素

caspase活化后可以激活一種可以剪切DNA的酶，即DNA片段化因子(DNAfragmentationfactor，DFF)。DFF也稱為caspase激活的DNA酶(caspase—activatedDNase，CAD)，由40kDa和45kDa兩條肽鏈組成。其中45ka肽鏈，即DFF45，也稱ICAD(inhibitorofCAD，CAD抑制物)；而DFF40則是具有DNA酶活性的肽鏈。正常情況下DFF40通過其N端的調(diào)節(jié)性結(jié)構(gòu)域與DFF45結(jié)合在一起，并處于失活狀態(tài)。Caspase－3可以在兩個(gè)部位剪切和滅活DFF45，并使DFF40釋放和活化，通過其破壞DNA的結(jié)構(gòu)。caspase還可以剪切凋亡抑制因子bcl—2家族的分子，影響抗凋亡作用。

1．破壞細(xì)胞抗凋亡因素72

2．破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)

caspase活化后可以通過剪切核纖層蛋白而破壞核膜的結(jié)構(gòu)。Caspase-6是目前發(fā)現(xiàn)的惟一可以剪切核纖層蛋白的caspase蛋白酶。在細(xì)胞凋亡過程中caspase還可以剪切其他與細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)的蛋白質(zhì)，如凝溶膠蛋白、FAK(focaladhesionkinase)、PAK2(p21-activatedkinase2)等。凝溶膠蛋白是一種專門剪切肌動(dòng)蛋白的蛋白酶，在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的排列，從而影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)。在正常情況下凝溶膠蛋白的活性受到溶血磷脂酸的負(fù)調(diào)控，當(dāng)被caspase剪切后可以產(chǎn)生一個(gè)組成性活化的蛋白酶片段，其活性不受控制，因而可以破壞細(xì)胞膜的肌動(dòng)纖維，影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。

2．破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)73FAK是一種分布十分廣泛的非受體型蛋白酪氨酸激酶，可以結(jié)合細(xì)胞膜表面的整合素分子，并與整合素分子與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附有關(guān)。FAK分子中具有caspase-3、caspase-6和顆粒酶B的酶切位點(diǎn)，當(dāng)被剪切后，就會(huì)通過影響細(xì)胞的黏附及其他功能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PAK2的剪切與凋亡小體的形成有關(guān)。FAK是一種分布十分廣泛的非受體型蛋白酪氨酸激酶，可以結(jié)合細(xì)743．影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能

caspase活化后還剪切和滅活多種與DNA和RNA功能有關(guān)的蛋白質(zhì)，包括PARP、DNA-PK、U1-70K等。PARP即多聚(ADP-核糖)聚合酶[po1y(ADP-ribose)polymerase]是一種與DNA修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)有關(guān)的聚合酶。Caspase-3可以將116kDa的PARP在Asp216-G1y217之間剪切成3lkDa和85kDa兩個(gè)片段，使PARP分子中DNA結(jié)合域與N端的催化區(qū)域分離，不能發(fā)揮正常功能。結(jié)果使受PARP負(fù)調(diào)控影響的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，引起DNA斷裂。3．影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能75DNA-PK即DNA依賴的蛋白激酶(DNA-dependentProteinkinase)，是一種在真核細(xì)胞中廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由一個(gè)異源二聚體的DNA結(jié)合亞基和一個(gè)較大催化亞基組成?？梢源呋喾N轉(zhuǎn)錄因子和核內(nèi)蛋白的磷酸化。Caspase-3可以催化DNA-PK催化亞基的磷酸化，并使之活性增強(qiáng)?；罨腄NA-PK可能通過其催化活性促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。凋亡效應(yīng)亞類的caspase還可以催化多種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的裂解，如連鎖蛋白、波形纖維蛋白、MEKKl、PKC、PP2A、NF-

B、Rb等，這些蛋白質(zhì)可能都直接或間接地參與了細(xì)胞的凋亡以及凋亡細(xì)胞的清除。DNA-PK即DNA依賴的蛋白激酶(DNA-dependen76第六節(jié)與凋亡相關(guān)的基因細(xì)胞凋亡受遺傳的控制。一類為促進(jìn)凋亡基因或稱細(xì)胞死亡基因（celldeathgenes,Ced），如白細(xì)胞介素-1

轉(zhuǎn)換酶（IL-1

convertingenzyme,ICE）、p53、Fas和c-myc等基因；另一類為抑制凋亡基因或稱細(xì)胞死亡抑制基因，如Bcl-2（B-celllymphoma/leukemia-2）等基因。bcl-2基因的缺失突變將促進(jìn)PCD的發(fā)生。第六節(jié)與凋亡相關(guān)的基因細(xì)胞凋亡受遺傳的控制。77一、BcL-2家族Bcl-2因首先發(fā)現(xiàn)于人類B細(xì)胞淋巴瘤（Bcelllymphoma/leukemia2）而得名，隨后發(fā)現(xiàn)bcl-2可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族與CED-9同源的蛋白質(zhì)，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上具有同源性。Bcl-2家族的蛋白在羧基端具有疏水序列，可以以多聚體形式與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)定位證明它們常位于線粒體和核孔復(fù)合體。Bcl-2家族蛋白質(zhì)的活性形式一般是二聚體。雖然Bcl-2家族蛋白質(zhì)具有同源性，但它們的功能并不完全相同，如Bcl-2、Bcl-x可以抑制凋亡，而Bax、Bad可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。一、BcL-2家族Bcl-2因首先發(fā)現(xiàn)于人類B細(xì)胞淋巴瘤（B78(一)BcL-2與Bax調(diào)控細(xì)胞凋亡1.Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡Bcl-2是在B細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)一種原癌基因，腫瘤的發(fā)生是由于Bcl-2的高表達(dá)抑制了細(xì)胞的凋亡過程。Bcl-2可以抑制多種形式的細(xì)胞凋亡，包括糖皮質(zhì)激素、

-射線照射、佛波酯、離子霉素、CD3單抗交聯(lián)等各種因素引起的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞因子依賴性細(xì)胞在細(xì)胞因子撤除時(shí)發(fā)生的凋亡也可以被Bcl-2阻斷。Bcl-2也可以作用于IL-4、IL-2、GM-CSF依賴的細(xì)胞系以及對(duì)NGF依賴的神經(jīng)元。BCL-2還可以阻斷病毒引起的細(xì)胞凋亡。(一)BcL-2與Bax調(diào)控細(xì)胞凋亡1.Bcl-2抑制細(xì)79Bcl-2通過羧基端19aa的疏水區(qū)定位于線粒體膜、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上，其余大部分的肽段暴露于胞漿中。Bcl-2的胞漿中膜定位對(duì)其功能的發(fā)揮具有重要的作用，失去疏水信號(hào)序列的Bcl-2只能部分阻斷細(xì)胞凋亡。用酵母外膜蛋白Mas70p代替Bcl-2的疏水區(qū)，可以使它重新分布于膜上，并恢復(fù)其原有的活性。Bcl-2通過羧基端19aa的疏水區(qū)定位于線粒體膜、滑面內(nèi)質(zhì)80

2.Bax對(duì)BcL-2的調(diào)節(jié)作用

Bax(Bcl-2associatedXprotein)是一種分布很廣泛的Bcl-2家族成員，分子量為21kDa。Bax與Bcl-2一樣也具有一個(gè)疏水的羧基端，可以與Bcl-2結(jié)合成異源二聚體并定位于質(zhì)膜上。Bax不但可以與Bcl-2形成異源二聚體，也可以自身形成同源二聚體。與Bax分離的Bcl-2就失去了抗凋亡能力，說明Bcl-2與Bax的結(jié)合是Bcl-2發(fā)揮作用的前提。而當(dāng)Bax在細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)，并形成同源二聚體時(shí)，細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的反應(yīng)增強(qiáng)。所以Bcl-2與Bax的比例，決定了細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的反應(yīng)。

2.Bax對(duì)BcL-2的調(diào)節(jié)作用

Bax(Bcl-281(二)Bcl-2家族其它成員1.BcL-X

BcL-X與BcL-2在氨基酸水平上有44%的同源性，也具有疏水的羧基端跨膜結(jié)構(gòu)域，并可與Bax形成二聚體。Bcl-X有兩種形式：一種是BcL-XL，長(zhǎng)233aa，含有高度保守的BH1和BH2；BcL-XS則缺少組成BH1和BH2的63aa。Bcl-XL作用與Bcl-2相似，抑制凋亡的發(fā)生，而Bcl-XS則可以促進(jìn)凋亡。(二)Bcl-2家族其它成員1.BcL-X82

2.BAKBAK(Bcl-2homologousantagonist/killer)也具有BH1和BH2同源序列，作用與Bax相似，可以與Bcl-2和Bcl-XL作用，拮抗它們的作用，并促進(jìn)凋亡進(jìn)程。BAK與Bax不同的是它更易于與Bcl-XL結(jié)合，而與Bcl-2的結(jié)合能力稍差。

2.BAK83

3.BADBAD(Bcl-2/Bcl-XL-associateddeathpromoter)與其它成員的同源性很低，只在BH1和BH2的關(guān)鍵性氨基酸殘基上存在保守性，而且缺乏羧基端疏水性跨膜區(qū)，所以它可能不是一個(gè)膜鑲嵌蛋白。BAD與Bcl-XL的結(jié)合能力強(qiáng)于與Bcl-2的結(jié)合。它可以通過與Bcl-XL的結(jié)合，釋放BAX/Bcl-XL異源二聚體中的BAX，使BAX/BAX同源二聚體增多，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

3.BAD84(三)Bcl-2家族參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制由于大部分Bcl-2家族成員都具有疏水序列，并與質(zhì)膜結(jié)合，所以它們?cè)谀ど闲纬啥嗑垠w后影響質(zhì)膜的電化學(xué)特性，通過電化學(xué)變化來調(diào)節(jié)凋亡過程。在細(xì)胞受到凋亡因素作用后，最早能記錄到的變化是線粒體跨膜電位的降低，這是由于線粒體膜上通透性孔道的開放導(dǎo)致的。Bcl-2等可以阻止膜上通透性孔道的開放，從而抑制凋亡的進(jìn)行。另外Bcl-2可以阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+流的釋放，使胞漿中Ca2+水平維持穩(wěn)定。(三)Bcl-2家族參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制由于大部分Bcl85二、ICE基因ICE即白細(xì)胞介素-1

轉(zhuǎn)換酶，在體內(nèi)是以非活性形式存在，在顆粒酶（來自殺傷細(xì)胞）的作用下可形成活性ICE。ICE是半胱氨酸蛋白酶，能使無活性IL-1

前體轉(zhuǎn)變成有活性的IL-1

，后者可誘導(dǎo)Fas基因表達(dá)。已知bcl-2和p53基因可拮抗ICE誘導(dǎo)凋亡作用，故bcl-2失活或ICE基因過度表達(dá)時(shí)，易誘發(fā)細(xì)胞凋亡。二、ICE基因ICE即白細(xì)胞介素-1轉(zhuǎn)換酶，在體內(nèi)是以非活86三、c-myc癌基因目前已知c-myc分子有誘導(dǎo)凋亡活性的結(jié)構(gòu)域，但c-myc分子的正常功能是使G0/G1期細(xì)胞進(jìn)S期，是細(xì)胞增殖的促進(jìn)子。進(jìn)入S期的細(xì)胞在生長(zhǎng)因子作用下，細(xì)胞才能進(jìn)入有絲分裂期，如缺乏生長(zhǎng)因子時(shí)，則c-myc激活Fas基因而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，c-myc具有既可引起細(xì)胞增殖，又可引起凋亡的雙向作用，主要決定于其他因子對(duì)它的影響。三、c-myc癌基因目前已知c-myc分子有誘導(dǎo)凋亡活性的結(jié)87四、p53抑癌基因抑癌基因p53在細(xì)胞凋亡中起重要作用。射線或化療藥物引起淋巴細(xì)胞DNA損傷時(shí)，p53蛋白大量增加，同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。DNA損傷引起的細(xì)胞凋亡絕對(duì)需要p53蛋白的存在，而糖皮質(zhì)激素、鈣離子載體和衰老引起的細(xì)胞凋亡卻無需p53蛋白參與。四、p53抑癌基因抑癌基因p53在細(xì)胞凋亡中起重要作用。88p53蛋白的功能是多方面的：（1）與特定序列DNA結(jié)合，使細(xì)胞停滯于G1期；（2）與復(fù)制蛋白A（repeatproteinA）結(jié)合，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期；（3）是WAF/Cipl基因的轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)產(chǎn)生p21，而后者又與周期素依賴的激酶（cek）相結(jié)合，從而抑制細(xì)胞增殖；（4）如果損傷的DNA在G1期未能修復(fù)，則p53直接誘發(fā)細(xì)胞凋亡，以防止受損的DNA進(jìn)入S期，產(chǎn)生突變細(xì)胞。臨床上許多腫瘤如結(jié)腸癌、肺癌常伴有p53突變。這樣就使腫瘤細(xì)胞不但增殖顯著，而且凋亡又明顯減弱，故腫瘤多呈惡性生長(zhǎng)。p53蛋白的功能是多方面的：（1）與特定序列DNA結(jié)合，使細(xì)89五、病毒來源的凋亡調(diào)節(jié)劑細(xì)胞凋亡被機(jī)體用來作為抵抗病毒感染的一種方式，為了抵消這種作用，一些病毒帶有可抑制細(xì)胞凋亡的基因，可以保護(hù)受感染細(xì)胞不發(fā)生凋亡，使病毒得以復(fù)制。五、病毒來源的凋亡調(diào)節(jié)劑細(xì)胞凋亡被機(jī)體用來作為抵抗病毒感染的90

1.CrmA痘病毒編碼的蛋白質(zhì)CrmA(cytokineresponsemodifierA)是一種絲氨酸蛋白酶抑制，可以抑制caspase-1和caspase-8的活性，由于caspase-8在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要作用，被CrmA抑制后就會(huì)阻斷凋亡信號(hào)的傳遞，使細(xì)胞不發(fā)生死亡。

1.CrmA91

2.p35p35是桿狀病毒合成的一種蛋白質(zhì)，可以在感染的昆蟲細(xì)胞中阻止凋亡的進(jìn)行。p35主要是通過抑制效應(yīng)性caspase蛋白酶的活性而抑制凋亡過程的。P35可以與ICE結(jié)合，作為一種假底物阻止其繼續(xù)發(fā)揮作用，也可以阻斷其它ICE家族蛋白酶特別是caspase-3的作用。P35不但參與死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，也參與離子照射、糖皮質(zhì)激素引起的凋亡。

2.p35923.IAPIAP(inhibitorofapoptosisprotein)也是首先在桿狀病毒中發(fā)現(xiàn)的一類凋亡抑制蛋白，它們含有兩個(gè)80aa的重復(fù)序列，還有一個(gè)對(duì)抗凋亡作用非常重要的鋅指結(jié)構(gòu)域。哺乳動(dòng)物中的IAP已發(fā)現(xiàn)有兩種：c-IAP1和c-IAP2，它們與TRAF2和TRAF1結(jié)合被活化，可以阻斷ICE家族蛋白酶的作用。3.IAP93第七節(jié)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞凋亡各種免疫細(xì)胞都存在有凋亡的現(xiàn)象，這對(duì)保持免疫系統(tǒng)的平衡十分重要。誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)PCD的因素有生理性和非生理性的。生理性因素如細(xì)胞因子濃度的改變、B細(xì)胞發(fā)育過程中Ig基因的重排等。非生理因素如電離輻射、加熱、藥物等。第七節(jié)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞凋亡各種免疫細(xì)胞都存在有凋亡的現(xiàn)象，這94一、干細(xì)胞干細(xì)胞在骨髓的造血微環(huán)境中受到基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、生長(zhǎng)因子和抑制因子的作用。這些因素共同作用，控制造血干細(xì)胞的自我更新和分化。細(xì)胞因子在造血干細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮重要的作用，IL-3、GM-CSF、IL-6等不僅對(duì)于造血干細(xì)胞的增殖分化是必須的，而且對(duì)保持干細(xì)胞的存活也是必不可少的。一、干細(xì)胞干細(xì)胞在骨髓的造血微環(huán)境中受到基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)95二、T細(xì)胞1．胸腺細(xì)胞的發(fā)育與凋亡胸腺細(xì)胞在胸腺中的陽性選擇和陰性選擇是通過凋亡機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的，其機(jī)制與胸腺細(xì)胞和胸腺基質(zhì)細(xì)胞間的相互作用有關(guān)。大部分的胸腺細(xì)胞是未經(jīng)陽性選擇或陰性選擇過的，因此其平均壽命很短，只有3

4天，代表了胸腺中凋亡的整體水平。在胸腺細(xì)胞中，凋亡與內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素有關(guān)，未成熟胸腺細(xì)胞對(duì)糖皮質(zhì)激素是敏感的，而成熟T細(xì)胞對(duì)糖皮質(zhì)激素則是抵抗的。二、T細(xì)胞1．胸腺細(xì)胞的發(fā)育與凋亡96

972．活化T細(xì)胞與凋亡抗原或抗CD3抗體對(duì)外周T細(xì)胞既可誘導(dǎo)增殖反應(yīng)又可誘導(dǎo)凋亡，主要取決于抑制凋亡因素（如CD28-B7、CD40L-CD40）和促進(jìn)凋亡因素（如Fas-FasL）之間的力量對(duì)比。通過抗原受體激活的T細(xì)胞可發(fā)生凋亡，稱之為活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（activationinducedcelldeath，AICD）。T淋巴細(xì)胞被活化并發(fā)揮效應(yīng)功能后，可藉助