酵母雙雜交系統(tǒng)課件

酵母雙雜交系統(tǒng)

（yeasttwo-hybridsystem）酵母雙雜交系統(tǒng)

（yeasttwo-hybridsyst1定義(Defination)1

背景（Background）2原理（Principle）3

特征（Character）5過(guò)程（Process）4應(yīng)用（Application）6定義(Defination)1背景（Background2定義（Defination）

將待研究的兩種蛋白質(zhì)的基因分別克隆到酵母表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子(如GAL4等)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因和激活結(jié)構(gòu)域基因，構(gòu)建成融合表達(dá)載體，從表達(dá)產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)。BACK定義（Defination）將待研究的兩種蛋白質(zhì)的基因分3背景（Background）真核生物基因轉(zhuǎn)錄需要反式轉(zhuǎn)錄激活因子（如Gal4等）的參與，真核生物轉(zhuǎn)錄因子含有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-bindingdomain）及轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain）。前者可識(shí)別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，后者可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。Fig.Gal4boundtoitssiteonDNABACK背景（Background）真核生物基因轉(zhuǎn)錄需要反式轉(zhuǎn)錄激活4原理（Principle）酵母轉(zhuǎn)錄因子（1）誘餌蛋白（Bait,與BD融合）（2）靶蛋白（TargetproteinorPrey,與AD融合）報(bào)告基因LacZ、HIS、GFP、RFP、GUS、NOS等均可作為報(bào)告基因酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立。原理（Principle）酵母轉(zhuǎn)錄因子報(bào)告基因酵母雙雜交系統(tǒng)5原理（Principle）ADPreyADPreyBaitDNA-BDGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneBaitDNA-BDBACK原理（Principle）ADPreyADPreyBaitD61、將蛋白X的cDNA序列與BD序列融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒。2、將蛋白Y的cDNA序列與AD序列融合，構(gòu)建成文庫(kù)質(zhì)粒。過(guò)程（Process）1、將蛋白X的cDNA序列與BD序列融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒。過(guò)7過(guò)程（Process）3、將這兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞（缺乏報(bào)告基因啟動(dòng)子）中。4、利用報(bào)告基因的表達(dá)篩選相互作用的蛋白（文庫(kù)篩選）。BACK過(guò)程（Process）3、將這兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞（缺乏報(bào)8優(yōu)點(diǎn)高敏感性真實(shí)性簡(jiǎn)潔性廣泛性特征（Character）缺點(diǎn)假陽(yáng)性較多轉(zhuǎn)化效率低陰性干擾BACK優(yōu)點(diǎn)高敏感性真實(shí)性簡(jiǎn)潔性廣泛性特征（Character）缺點(diǎn)9應(yīng)用（Application）分析已知蛋白之間的相互作用對(duì)蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行點(diǎn)突變或缺失突變?cè)龠M(jìn)行雙雜交。用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫(kù)，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫(kù)，再根據(jù)篩的已知基因推測(cè)新基因功能。繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用應(yīng)用（Application）分析已知蛋白之間的相互作用10利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的新功能

將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫(kù)中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽(yáng)性酵母菌株中可以分離得到AD-文庫(kù)載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對(duì)該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。應(yīng)用（Application）利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的新功能

將已知基11利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用

應(yīng)用（Application）利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可研究抗原和抗體之間的相互作用，但它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過(guò)酵母雙雜交進(jìn)行檢測(cè)。利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用應(yīng)用（A12利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響

應(yīng)用（Application）對(duì)于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白相互作用可采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用13利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（GenomeProteinLinkageMap）

應(yīng)用（Application）基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過(guò)基因組的測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列。利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達(dá)文庫(kù)中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對(duì)于認(rèn)識(shí)一些重要的生命活動(dòng)：如信號(hào)傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義。利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（GenomeProte14利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（GenomeProteinLinkageMap）

應(yīng)用（Application）基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過(guò)基因組的測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列。利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表