核苷酸類物質(zhì)課件

一、概況

核酸由眾多的單體核苷酸通過3

,5

－磷酸二酯鍵聚合而成。核苷酸由堿基、核糖、磷酸組成。

脫去磷酸后的堿基稱為核苷。第二節(jié)核酸與核苷酸發(fā)酵一、概況第二節(jié)核酸與核苷酸發(fā)酵（一）呈味核苷酸

核苷酸類中的肌苷酸（IMP）、鳥苷酸（GMP）、黃苷酸（XMP）呈強(qiáng)鮮味。如：肌苷酸鈉比味精鮮40倍，鳥苷酸鈉比味精鮮160倍。

5

－鳥苷酸5

－肌苷酸5

－黃苷酸

（guanylicacid）（inosinicacid）（xanthylicacid）

5

-GMP>5

-IMP>5

-XMP堿基鳥嘌呤次黃嘌呤黃嘌呤（一）呈味核苷酸AMPGMPAMPGMP鮮味劑的協(xié)同效應(yīng)當(dāng)核苷酸與氨基酸類物質(zhì)混合使用時(shí)，鮮味不是簡單的疊加，而是成倍地提高。

增效：甜味、肉味

消除：咸、酸、苦味、腥味、焦味

鮮味劑的協(xié)同效應(yīng)歷史1960年，日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)5

-IMP具有強(qiáng)烈鮮味。60年代后期，日本成為用發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸類物質(zhì)的最大生產(chǎn)國。市場上的“強(qiáng)力味精”、“加鮮味精”是在普通的味精中加少量肌苷酸鈉組成。70年代以后，核酸類物質(zhì)及其衍生物以其具有抗病毒和抗腫瘤的作用，受到醫(yī)藥界的普遍重視。歷史（二）生產(chǎn)方法1.發(fā)酵法（1）一步法：直接發(fā)酵法（2）二步法（發(fā)酵轉(zhuǎn)化法）發(fā)酵法核苷核苷酸2.酶解法

酵母核糖核酸核苷酸提取酶解

磷酸化（二）生產(chǎn)方法提取酶解磷酸化二、核苷酸的生物合成途徑及其代謝調(diào)控（一）生物合成途徑從頭合成途徑：

利用氨基酸等作為原料合成。補(bǔ)救合成途徑：利用體內(nèi)游離的堿基或核苷合成。二、核苷酸的生物合成途徑及其代謝調(diào)控1.從頭合成途徑（denovosynthesis）

由氨基酸、磷酸戊糖、CO2和NH3合成核苷酸。嘌呤核苷酸：直接生成次黃嘌呤核苷酸（IMP）,然后轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌堰屎塑账帷?.從頭合成途徑（denovosynthesis）

葡萄糖

HMP5‘－磷酸核糖磷酸核糖焦磷酸（PRPP）

PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶

5

-IMPAMPSAMPXMPGMP葡萄糖①腺苷酸代琥珀酸合成酶③IMP脫氫酶②腺苷酸代琥珀酸裂解酶④GMP合成酶由IMP合成AMP及GMP①腺苷酸代琥珀酸合成酶③IMP脫氫酶由IMP合成AM

AMP-SAMPIMPXMPGMP

AspGlnNAD+AMPADPATPADPATP激酶ADPATP激酶GMPGDPGTPADPATP激酶ADPATP激酶AMP-SAMP核苷酸類物質(zhì)課件IMP合成途徑的代謝調(diào)控主要通過產(chǎn)物的負(fù)反饋調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)包括:2個(gè)長反饋和2個(gè)短反饋ATPGTPR-5-PATPPRPP合成酶PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶PRAIMPAMPSAMPADPXMPGMPGDP2個(gè)長反饋IMP合成途徑的代謝調(diào)控主要通過產(chǎn)物的負(fù)反饋調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)包括:2個(gè)短反饋IMPAMPSXMPAMPADPGMPGDPGTPATPATPGTP2個(gè)短反饋IMPAMPSXMPAMPADPGMPGDPGTP2.補(bǔ)救合成途徑（salvagesynthesis）

微生物從培養(yǎng)基中取得完整的嘌呤、戊糖、磷酸，直接合成單核苷酸。當(dāng)全生物合成途徑受阻時(shí)，微生物可通過此途徑合成核苷酸。有兩條合成途徑：2.補(bǔ)救合成途徑（salvagesynthesis）（1）嘌呤堿與PRPP直接合成嘌呤核苷酸次黃嘌呤次黃嘌呤核苷酸鳥嘌呤鳥嘌呤核苷酸次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)PRPPPPi腺嘌呤腺嘌呤核苷酸腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（APRT）HGPRT活性高APRT活性低90%嘌呤堿（1）嘌呤堿與PRPP直接合成嘌呤核苷酸次黃嘌呤次黃嘌呤核苷腺嘌呤+1-磷酸核糖腺苷+Pi核苷磷酸化酶（2）腺嘌呤與1-磷酸核糖生成腺苷,再生成腺嘌呤核苷酸。腺苷+ATP腺苷激酶腺苷酸+ADP腺嘌呤+1-磷酸核糖腺苷+Pi核苷磷酸化酶（2）腺嘌呤與1-三、肌苷酸的生產(chǎn)（一）一步法

1.肌苷酸生產(chǎn)菌選育（1）解除微生物自身的反饋調(diào)節(jié)a.解除AMP、GMP對PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的反饋抑制。b.切斷5

-IMP繼續(xù)代謝生成GMP和AMP的途徑。三、肌苷酸的生產(chǎn)

因此，選擇可能產(chǎn)生核苷酸的產(chǎn)氨短桿菌（Brevibacteriumammoniagene）為出發(fā)菌株，誘變?yōu)橄汆堰嗜毕菪屯蛔冎辏僬T變?yōu)轼B嘌呤缺陷型突變株。因此，選擇可能產(chǎn)生核苷酸的產(chǎn)氨短桿菌（Breviba

IMP的阻遏如何解決？（2）改變核苷酸對細(xì)胞膜的滲透性

核苷或堿基容易透過細(xì)胞膜，而核苷酸難于透過細(xì)胞膜。日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，Mn2+對于產(chǎn)氨短桿菌核苷酸的膜透性起著關(guān)鍵作用，Mn2+限量的情況下，菌體產(chǎn)生膨脹異常現(xiàn)象，細(xì)胞膜允許IMP滲透到胞外，積累IMP。IMP的阻遏如何解決？

Mn2+限量與生物素亞適量結(jié)果相同，但機(jī)制不同。Mn2+亞適量：培養(yǎng)后期，細(xì)胞形態(tài)異常（伸長、膨脹、不規(guī)則）生物素亞適量：為乙酰CoA羧化酶的輔基，影響脂肪酸生物合成，間接影響細(xì)胞膜磷脂合成，從而影響細(xì)胞膜透性。Mn2+限量與生物素亞適量結(jié)果相同，但機(jī)制不同。2.培養(yǎng)條件（1）因所用菌株為腺嘌呤缺陷型，所以添加適量腺嘌呤（加0.5%酵母膏或酵母水解液）。（2）Mn2+亞適量工業(yè)原料和工業(yè)用水含較多的Mn2+，難于控制Mn2+亞適量,有兩條途徑：

a.篩選對Mn2+不敏感的突變株

b.加抗生素或表面活性劑以解除過量Mn2+的影響。（3）添加較高濃度的磷鹽。2.培養(yǎng)條件（二）二步法（肌苷酸生產(chǎn)主要方法）

發(fā)酵法肌苷肌苷酸原因：IMP對細(xì)胞膜的透性很差。微生物中普遍存在使IMP脫磷酸化的酶類。

磷酸化（二）二步法（肌苷酸生產(chǎn)主要方法）磷酸化肌苷生產(chǎn)菌的選育

常用：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）的腺嘌呤缺陷型。原因：

該菌磷酸酯酶活性強(qiáng)，有利于將IMP脫磷酸化形成肌苷，分泌至胞外，而產(chǎn)氨短桿菌的磷酸酯酶活性較弱。因此，對B.subtilis

進(jìn)行菌種改良，可大量積累肌苷。肌苷生產(chǎn)菌的選育2.培養(yǎng)條件（1）培養(yǎng)基：碳源：淀粉水解糖或糖蜜氮源：要充分（因肌苷含氮量高，20.9％）無機(jī)鹽：可溶性磷鹽有抑制作用（胞外磷酸化）生長因子：加適量含腺嘌呤的物質(zhì)，如酵母膏。

腺嘌呤的最適濃度：不影響菌體生長使肌苷大量積累2.培養(yǎng)條件（2）發(fā)酵條件

通氣攪拌：供氧充足，促進(jìn)肌苷生成，并可減少CO2對肌苷生成的抑制。（3）肌苷的提取

先過陽離子交換柱，再過活性炭柱（吸附），結(jié)晶。（2）發(fā)酵條件3.肌苷的磷酸化（1）酶法：

酶：核苷磷酸化酶（三葉草假單胞菌）磷酸的供體：對硝基苯磷酸難點(diǎn)：除5

－磷酸化產(chǎn)物外，還有3

-、2

-位異構(gòu)體，收率85％。（2）化學(xué)法：用不同的磷酸化試劑。3.肌苷的磷酸化4.肌苷酸的提取

離子交換法除菌體除對硝基酚柱層析（過濾、離心）活性炭吸附加乙醇沉淀

精制（結(jié)晶）粗制品肌苷酸4.肌苷酸的提取四、鳥苷酸的生產(chǎn)鳥苷酸由鳥嘌呤、核糖和磷酸三部分組成。1960年，日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)5‘－鳥苷酸鈉具有強(qiáng)烈的鮮味。1961年又證實(shí)了香味極濃的著名菇類－香菇含有大量的鳥苷酸，從此開始研究GMP的生產(chǎn)方法。四、鳥苷酸的生產(chǎn)鳥苷酸的生產(chǎn)方法：（1）由酵母細(xì)胞提取出核酸，再以酶法降解；（2）直接發(fā)酵法生產(chǎn)鳥苷酸；（3）以化學(xué)法磷酸化發(fā)酵生產(chǎn)的鳥苷；（4）雙菌混合發(fā)酵法。利用5

一黃苷酸或黃苷酸生產(chǎn)菌與能將黃苷酸或黃苷轉(zhuǎn)化為鳥苷酸的菌株混合培養(yǎng)。鳥苷酸的生產(chǎn)方法：（一）二步法（常用）

1.選用二步法的原因：（1）GMP的細(xì)胞膜透性很差（限Mn2+）微生物中普遍存在鳥苷酸的降解酶系（加高濃度磷鹽）,培養(yǎng)條件較復(fù)雜。（2）直接發(fā)酵法產(chǎn)酸率不高，因GMP是嘌呤核苷酸生物合成的終產(chǎn)物，使鳥苷酸的自身合成受阻。（3）鳥苷的溶解度低，容易析出，相對減弱了反饋調(diào)節(jié)的強(qiáng)度，使積累鳥苷成為可能。（一）二步法（常用）

2.鳥苷生產(chǎn)菌的選育（鳥苷高產(chǎn)菌株應(yīng)具備的條件）（1）喪失腺苷酸琥珀酸合成酶活性，即切斷肌苷酸到腺苷酸的通路。（2）鳥苷分解酶的活性微弱。（3）解除鳥苷酸的反饋抑制與阻遏。（4）由肌苷酸脫氫酶、鳥苷酸合成酶催化的反應(yīng)，比核苷酸酶催化的反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行，從而抑制肌苷的產(chǎn)生。按上述要求，利用枯草芽孢桿菌腺嘌呤缺陷型加以誘變獲得。2.鳥苷生產(chǎn)菌的選育（鳥苷高產(chǎn)菌株應(yīng)具備的條件）3.鳥苷發(fā)酵條件（1）培養(yǎng)基

碳源：葡萄糖或麥芽糖

氮源：硫酸銨（氯化銨、大豆蛋白水

解液）、流加氨水

無機(jī)鹽：磷、鎂、鐵、錳

嘌呤前體物：L-谷氨酸鈉

營養(yǎng)缺陷型菌株的營養(yǎng)物質(zhì)3.鳥苷發(fā)酵條件（2）發(fā)酵條件

溫度：36℃（0~24h）36.5~37.5℃（24h后）

pH值：pH值下降，流加氨水。

溶氧：

發(fā)酵周期：48h左右（2）發(fā)酵條件（3）鳥苷的分離提取滅菌后發(fā)酵液→除菌體→一次結(jié)晶→過濾→鳥苷粗品→脫色→過濾→二次結(jié)晶→過濾→鳥苷→烘干→磨粉→包裝

（3）鳥苷的分離提?。ǘ┟阜ǎㄓ址Q核酸水解法）

起始于日本，50－60年代研制成功，技術(shù)關(guān)鍵是篩選到產(chǎn)生5

－磷酸二酯酶（核酸外切酶）的菌株。（二）酶法（又稱核酸水解法）1.原理

5

－磷酸二酯酶能水解核糖上3

－碳原子羥基與磷酸形成的二酯鍵，生成4種5

－單核苷酸，即：從游離3

－羥基端開始，逐個(gè)水解下5

－單核苷酸。特點(diǎn)：工藝簡單，得率高，副產(chǎn)物也為醫(yī)藥產(chǎn)品。1.原理核酸的降解過程核酸的降解過程某些核酸外切酶對RNA、DNA均有作用：牛脾磷酸二酯酶3-核苷酸蛇毒磷酸二酯酶5-核苷酸某些核酸外切酶對RNA、DNA均有作用：牛脾磷酸二酯酶蛇毒磷

2.磷酸二酯酶的制備（1）桔青霉（Penicilliumcitrinum）可用固體發(fā)酵（制曲、浸泡、抽提）（2）金色鏈霉菌（Streptomycesaureus）液體深層發(fā)酵，該菌不僅含有5

－磷酸二酯酶，同時(shí)含有脫氨酶，使其中的5

－AMP脫氨后生成5

-IMP。因此，使用該菌產(chǎn)生助鮮劑時(shí)，由于含