細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-免疫熒光觀察細(xì)胞骨架

細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)-免疫熒光觀看細(xì)胞骨架細(xì)胞骨架的免疫熒光標(biāo)記及定位觀看免疫熒光技術(shù)〔Immunofluorescencetechnique〕又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中進(jìn)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的根底上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反響進(jìn)展組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941年首次承受熒光素進(jìn)展標(biāo)記并獲得成功。依據(jù)抗原抗體反響的原理，先將的抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原。熒光素在肯定條件下可與抗體分子結(jié)合同時(shí)不影響抗體免疫活性的特性。用熒光抗體浸染可能含抗原的細(xì)胞或組織切片，如有相應(yīng)抗原存在，則抗原與標(biāo)記抗體特異性結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物固定于細(xì)胞上，不易洗脫，在熒光顯微鏡下可以觀看到發(fā)出熒光的可見物體，從而可以對(duì)抗原或抗體的性質(zhì)進(jìn)展定性、定量和定位分析。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素〔FITC〕和羅丹明〔Rhodamine〕等。免疫熒光的應(yīng)用范圍極其廣泛，可以用于內(nèi)分泌激素、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞外表抗原、腫瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)的爭(zhēng)論。免疫熒光技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：存在非特異性染色，結(jié)果判定的客觀性缺乏，步驟比較簡(jiǎn)單。免疫熒光分為直接法、間接法和補(bǔ)體結(jié)合法。直接法：將熒光素直接偶聯(lián)在一抗上，不需要二抗。檢查抗原法：這是最早的方法，用特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法很特異和簡(jiǎn)便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。檢查抗體法：將抗原標(biāo)記上熒光素，即為熒光抗原，用此熒光抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反響，而將抗體定位檢測(cè)出來(lái)。間接法:先用未標(biāo)記的特異抗體〔一抗〕與抗原結(jié)合，再用有熒光素標(biāo)記的抗抗體〔二抗，如抗IgG的抗體〕與標(biāo)本反響，樣品中假設(shè)有與一抗結(jié)合的抗原存在，則會(huì)形成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物從而到達(dá)染色的目的。檢查抗體法：此法是先用特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反響，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，由于抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。檢查抗體法：在樣品中加上待檢血清，假設(shè)血清含有樣品中某種抗原的抗體，抗體便沉淀結(jié)合在抗原上，再用間接熒光抗體〔如抗種屬特異性的IgG熒光抗體〕與結(jié)合在抗原上的抗體反響，在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反響部位呈現(xiàn)光明的特異性熒光。此法是檢驗(yàn)血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段。檢查抗原法：先用特異性抗體〔一抗〕與樣品反響，再用 PBS洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體〔二抗〕與結(jié)合在抗原上的抗體〔二抗的抗原〕結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了靈敏度。這是現(xiàn)在最廣泛應(yīng)用的技術(shù)。補(bǔ)體結(jié)合法：又稱抗補(bǔ)體染色法，是間接染色法的一種改進(jìn)，基于補(bǔ)體結(jié)合反響的原理，通過熒光標(biāo)記抗補(bǔ)體的抗體，用于鑒定未知抗原或未知抗體〔待檢測(cè)的血清〕。直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物法：用抗補(bǔ)體的熒光抗體直接作用于組織切片，熒光抗體可以和結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補(bǔ)體反響，形成抗原抗體補(bǔ)體復(fù)合物－抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽(yáng)性熒光的部位就是免疫復(fù)合物的存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。間接檢查組織內(nèi)抗原法：常將穎補(bǔ)體與一抗混合后同時(shí)加在組織切片上37℃孵育，如發(fā)生抗原補(bǔ)體抗體反響，補(bǔ)體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補(bǔ)體熒光抗體與結(jié)合的補(bǔ)體反響，形成抗原－抗體－抗補(bǔ)體熒光抗體的復(fù)合物，此法優(yōu)點(diǎn)是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來(lái)源的一抗的標(biāo)記顯示。熒光素靶蛋白二抗一抗高特異性的抗體是免疫熒光試驗(yàn)的關(guān)鍵，但是很多的實(shí)際爭(zhēng)論沒有商品化的抗體，就需要制備免疫血清和純化免疫球蛋白，需要留意1.在抗體制備過程中，用于免疫的抗原必需是高度提純的，盡可能不含其它非特異的抗原物質(zhì)；2.從免疫血清中將特異性抗體提純必需保證抗體的高度純化，盡量削減非特異抗體的存在?！渤ノ唇Y(jié)合熒光素：透析法，凝膠過濾法；除去標(biāo)記不適當(dāng)?shù)目贵w：離子交換層析法，其中未結(jié)合熒光素的抗體所帶負(fù)電少，最先洗出。過量結(jié)合熒光素的抗體，所帶負(fù)電多，最終洗出；除去非特異反響物質(zhì)：將熒光抗體用同一正常組織或同種動(dòng)物其它組織的組織粉末預(yù)先吸取?！吵俗约褐苽淇贵w之外，還可以承受間接法免疫熒光技術(shù)，一抗一般是靶蛋白或者靶蛋白所耦聯(lián)Tag的抗體，二抗則是通用的抗IgG的抗體〔抗鼠、抗兔、抗羊等〕。如以下圖所示：免疫熒光中的抗原和抗體常用的熒光素異硫氰酸熒光素〔Fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC〕：黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸取光波長(zhǎng)為490－495nm，最大放射光波長(zhǎng)520－530nm，呈現(xiàn)光明的黃綠色熒光，構(gòu)造式如下：有兩種同分異構(gòu)造，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合力量等方面都更好，在冷暗枯燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。四乙基羅丹明〔Rhodamine〕：橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。構(gòu)造式如下：最大吸取光波長(zhǎng)為570nm595－600nm，呈橘紅色熒光。四甲基異硫氰酸羅丹明〔Tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC〕：最大吸引光波長(zhǎng)為550nm，最大放射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光比照鮮亮，可協(xié)作用于雙重標(biāo)記或比照染色。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。1、固定固定的目的：使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固；去除阻礙抗原抗體結(jié)合的類脂質(zhì)；終止或削減內(nèi)源性或外源性酶反響；防止細(xì)胞自溶并保持細(xì)胞固有形態(tài)和構(gòu)造；最重要的是保持細(xì)胞內(nèi)的抗原性，從而使抗體能有效特異識(shí)別胞內(nèi)抗原。固定的標(biāo)準(zhǔn)：不能損傷細(xì)胞內(nèi)的抗原；不能凝集蛋白質(zhì)；應(yīng)保持細(xì)胞和亞細(xì)胞構(gòu)造；固定后應(yīng)保持通透性，以保證抗體自由進(jìn)入全部細(xì)胞或亞細(xì)胞組分并與抗原結(jié)合。常用的固定劑：有機(jī)溶劑和交聯(lián)劑。有機(jī)溶劑如甲醇和丙酮等可去除類脂并使細(xì)胞脫水，同時(shí)將細(xì)胞構(gòu)造蛋白沉淀。交聯(lián)劑如多聚甲醛通過自由氨基酸基團(tuán)形成分子間橋連，從而產(chǎn)生一種抗原相互連接的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造。交聯(lián)劑比有機(jī)溶劑更易于保持細(xì)胞的構(gòu)造，但由于交聯(lián)阻礙抗體結(jié)合，可能會(huì)降低一些細(xì)胞組分的抗原性，因此需要通透處理使抗體進(jìn)入標(biāo)本。兩種固定方法都可能使蛋白抗原變性，因此使用變性蛋白為抗原制備的抗體在免疫熒光中效果更好，樣品中有熒光蛋白時(shí)，固定時(shí)間不宜過久〔5〕。細(xì)胞構(gòu)造抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙醇或甲醛固定可得到較好的結(jié)果；細(xì)胞膜相關(guān)組分抗原一般用甲醛或多聚甲醛固定；細(xì)胞器和細(xì)胞顆粒內(nèi)的抗原一般用甲醛或多聚甲醛固定，并需要進(jìn)展通透以使抗體能到達(dá)抗原表位。2、通透通透的目的：在細(xì)胞膜上打孔便利抗體進(jìn)入，只在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原表位的時(shí)候才需要，由于抗體需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部去檢測(cè)蛋白。假設(shè)待檢測(cè)的是跨膜蛋白，且其抗原表位處于胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域，則同樣需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)展通透。假設(shè)所檢測(cè)的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，則不需要進(jìn)展通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作為固定劑時(shí)不需要通透處理。甲醇同樣具有通透作用，但有些抗原對(duì)甲醇格外敏感，所以選擇通透劑必需充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min。常用的通透劑多為去污劑，如Triton、NP-40以及Tween20、Saponin、DigitoninLeucopermTriton和NP-40屬于烈性去垢劑，可局部溶解細(xì)胞核膜，因此格外適合核抗原檢測(cè)。但是假設(shè)在高濃度下使用或者作用時(shí)間過長(zhǎng)，也會(huì)破壞蛋白。TritonX-100作為最常用的通透劑可以破壞細(xì)胞膜，因此不適用于細(xì)胞膜相關(guān)抗原的通透處理。Tween-20、Saponin、Digitonin和Leucoperm要溫順得多，它們可以在細(xì)胞質(zhì)膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過，但是不會(huì)溶解細(xì)胞質(zhì)膜。適于胞質(zhì)抗原或者質(zhì)膜上靠近胞質(zhì)一面的抗原，也適于可溶性的核抗原。一般的操作程序是先固定后通透，但針對(duì)有些水不溶性抗原的檢測(cè)需要先通透再固定，這樣可以通過通透去除很多水溶性的蛋白，大大削減免疫熒光的非特異性結(jié)合和背景噪音。3、封閉封閉的目的是削減抗體的非特異性結(jié)合，最常用的封閉劑為1%BSA，其它可選擇的封閉劑還有1%gelatin、1%bovine或與二抗種屬一樣的血清〔3-10%〕等。4、抗原抗體孵育熒光蛋白抗原、直接免疫熒光法中耦聯(lián)有熒光素的一抗和間接免疫熒光法中的耦聯(lián)有熒光素的二抗在孵育的時(shí)候必需留意避光。為了保證抗原抗體結(jié)合的質(zhì)量和防止枯燥，抗體孵育應(yīng)盡量在濕盒中進(jìn)展。溫度高可以加快抗原抗體結(jié)合速度，但也會(huì)增加非特異性結(jié)合，通常4℃過夜，以盡可能削減背景噪音。5、封片常規(guī)的方法是承受指甲油、甘油或中性樹脂封片，為了增加熒光信號(hào)和延長(zhǎng)熒光素的壽命需要在封片時(shí)添加特別的抗淬滅劑。6、樣品保存由于熒光色素和蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性都是相對(duì)的，因此樣品免疫熒光染色之后應(yīng)馬上觀看，加有抗淬滅劑的樣品在4℃存放一個(gè)星期左右，熒光信號(hào)沒有太多衰減。也可以在樣品固定后低溫保存，需要時(shí)再進(jìn)展免疫熒光。試驗(yàn)?zāi)康模毫私獠盐彰庖邿晒獾母驹砗筒僮鞣椒ò盐諢晒怙@微鏡的操作方法試驗(yàn)器材：熒光顯微鏡、鑷子、載玻片、蓋玻片、吸水紙、Hela細(xì)胞、耦聯(lián)有熒光素的鬼筆環(huán)肽〔6.0μM〕、DAPI〔0.1μM〕、PBS、2％的甲inPBS、0.1%TritonX-100inPBS、抗淬滅劑、指甲油Hela70%PBS35min3.2%inPBS104.PBS35min5.0.1%TritonX-100inPBS〔TPBS〕76.PBS35min7.1%BSAinTPBS30minPBS35min參加耦聯(lián)了Rhodamine的鬼筆環(huán)肽，37℃30min10