生物工藝原理-發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基及其制備

第三章Chapter3發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基及其制備

培養(yǎng)基：廣義上講培養(yǎng)基是指一切可供微生物細胞生長繁殖所需的一組營養(yǎng)物質(zhì)和原料。同時培養(yǎng)基也為微生物培養(yǎng)提供除營養(yǎng)外的其它所必須的條件。

發(fā)酵培養(yǎng)基的要求①培養(yǎng)基能夠滿足產(chǎn)物最經(jīng)濟的合成。②發(fā)酵后所形成的副產(chǎn)物盡可能的少。③培養(yǎng)基的原料應(yīng)因地制宜，價格低廉；且性能穩(wěn)定，資源豐富，便于采購運輸，適合大規(guī)模儲藏，能保證生產(chǎn)上的供應(yīng)。④所選用的培養(yǎng)基應(yīng)能滿足總體工藝的要求，如不應(yīng)該影響通氣、提取、純化及廢物處理等。培養(yǎng)基按其組成物質(zhì)的純度、狀態(tài)、用途可分為三大類型

一、按純度

合成培養(yǎng)基

:原料其化學成分明確、穩(wěn)定

適合于研究菌種基本代謝和過程的物質(zhì)變化規(guī)律

培養(yǎng)基營養(yǎng)單一，價格較高，不適合用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)

天然培養(yǎng)基:采用天然原料

原料來源豐富(大多為農(nóng)副產(chǎn)品)、價格低廉、適于工業(yè)化生產(chǎn)

原料質(zhì)量等方面不加控制會影響生產(chǎn)穩(wěn)定性

培養(yǎng)基的類型及功能M培養(yǎng)基(1L)：

Na2HPO46g，KH2PO43g，

NaCl0.5g，NH4Cl1g，

MgSO4.7H2O0.5g，CaCl20.011g，葡萄糖2～10g,pH7.0YPS培養(yǎng)基：酪蛋白胨10g，酵母提取物（英國Oxoid）5g,NaCl10g，pH7.2培養(yǎng)大腸桿菌常用兩種培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基

:適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保存，也廣泛應(yīng)用于有子實體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產(chǎn)

半固體培養(yǎng)基:即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊脂，一般用量為0.5%～0.8%,主要用于微生物的鑒定。液體培養(yǎng)基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。二、按狀態(tài)

孢子（斜面）培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基

三、按用途（從生物工藝角度考慮）培養(yǎng)基按其用途可分為：

含有細胞生長必須的原料滿足生化反應(yīng)的基本條件一定的pH值、一定的滲透壓促進產(chǎn)物合成的物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基必須滿足的條件工業(yè)發(fā)酵常用的碳、氮源發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來源一、碳源1、作用

提供微生物菌種的生長繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分

提供合成目的產(chǎn)物所必須的碳成分2、來源

糖類、油脂、有機酸、正烷烴3、工業(yè)上常用的糖類①葡萄糖

所有的微生物都能利用葡萄糖但是會引起葡萄糖效應(yīng)

工業(yè)上常用淀粉水解糖，但是糖液必須達到一定的質(zhì)量指標淀粉水解糖的制備方法：酸水解法（acidhydrolysismethod）酶解法（enzymehydrolysismethod）淀粉酶及糖化酶酸酶結(jié)合法（acid—enzymehydrolysismethod

）酸酶法和酶酸法淀粉水解糖的制備能夠作為谷氨酸發(fā)酵工業(yè)原料的水解糖液，質(zhì)量要求：淀粉水解糖質(zhì)量對發(fā)酵的影響水解不完全——糊精水解過渡——葡萄糖發(fā)生復合反應(yīng)或分解原料中蛋白過多——發(fā)酵產(chǎn)生泡沫淀粉制糖過程考察指標

葡萄糖理論轉(zhuǎn)化率

（C6H10O5）n＋nH2OnC6H12O6

實際收率

淀粉轉(zhuǎn)化率

葡萄糖值（DE值）（dextroseequivalentvalue）

淀粉糖的含糖量，液化液或糖化液中的還原糖含量（所測得的糖以葡萄糖計算）占干物質(zhì)的百分率為DE值DX值：糖化液中葡萄糖含量占干物質(zhì)的百分率不同的制糖工藝生產(chǎn)的糖液質(zhì)量差別很大

淀粉水解糖化的程度以糖化率(葡萄糖值，DextroseEquivalent，DE)表示：

DE=直接還原糖(以葡萄糖表示)/固體成分×100%。②糖蜜原料糖蜜是制糖生產(chǎn)時的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物。

糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達50%～75%。糖蜜原料的分類廢糖蜜（wastemolasses）：非結(jié)晶糖分，含相當數(shù)量的發(fā)酵性糖。甘蔗糖蜜（canemolasses）：產(chǎn)量約為原料甘蔗的2.5%～

3%，含有30%～36%的蔗糖和20%轉(zhuǎn)化糖。甜菜糖蜜：約占甜菜量的3%～4%，含蔗糖5%，轉(zhuǎn)化糖

1%。高級糖蜜：甘蔗榨汁（糖漿）加硫酸或酵母轉(zhuǎn)化酶（invertase）處理，制成轉(zhuǎn)化糖，糖濃度提高70%～85%

糖蜜的性質(zhì)：外觀為粘稠、黑褐色、半流動狀，

pH為5.5左右。，相對密度1.43。糖蜜的預處理(澄清與脫鈣):

目的：去除灰分和膠體方法：加酸法、加熱加酸法和添加絮凝劑澄清。

不用加工方法對甘蔗糖蜜的影響糖蜜使用的注意點：除糖份外，含有較多的雜質(zhì)，其中有些是有用的，但是許多都會對發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需要進行預處理。例：谷氨酸發(fā)酵有害物資：膠體成分（起泡、結(jié)晶）、鈣鹽（結(jié)晶）生物素（發(fā)酵控制）預處理：澄清→脫鈣→脫除生物素例：檸檬酸發(fā)酵有害物質(zhì)：鐵離子含量高（導致異檸檬酸的生成）預處理：→黃血鹽②淀粉、糊精使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類缺點：難利用、發(fā)酵液比較稠、一般>2.0%時加入一定的α-淀粉酶成分比較復雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。優(yōu)點：來源廣泛、價格低，難利用，可以解除葡萄糖效應(yīng)例：地衣牙孢桿菌生產(chǎn)α-淀粉酶碳源對生長和產(chǎn)酶的影響碳源細胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2李江華，無錫輕工大學學報，2004(半纖維素酶)(1.5g麩皮)嗜堿芽胞桿菌(AC-2)中碳源對堿性纖維素酶分泌的影響結(jié)果：各種碳源相差不大推論：該菌種的堿性纖維素酶為組成型蘇勤，林業(yè)化學與工業(yè)，2004石油代糧發(fā)酵的原料石油代糧發(fā)酵的特點：不需要高溫、高壓、耐酸、耐腐蝕的設(shè)備石油代糧發(fā)酵原料的選擇二、氮源

氮源主要用于構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)（氨基酸，蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。

1、無機氮源種類：氨鹽、硝酸鹽和氨水特點：微生物對它們的吸收快，所以也稱之謂迅速利用的氮源。但無機氮源的迅速利用常會引起pH的變化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH

無機氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，這種經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無機氮源叫生理酸性物質(zhì)，如硫酸胺，若菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的則此種無機氮源稱為生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉。正確使用生理酸堿性物質(zhì)，對穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pH有積極作用。所以選擇合適的無機氮源有兩層意義：

滿足菌體生長穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH毛霉產(chǎn)蛋白酶的研究陳濤，中國釀造，2004初始pH的影響:pH偏酸比較好，中性蛋白酶影響大無機氮源的影響：硫酸銨>硝酸銨>硝酸鈉>尿素2、有機氮源來源：工業(yè)上常用的有機氮源都是一些廉價的原料，花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒糟。成分復雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機鹽及生長因子。例玉米漿：①可溶性蛋白、生長因子（生物素）、苯乙酸②較多的乳酸③硫、磷、微量元素等

有機氮源成分復雜可以從多個方面對發(fā)酵過程進行影響，而另一方面有機氮源的來源具有不穩(wěn)定性。所以在有機氮源選取時和使用過程中，必須考慮原料的波動對發(fā)酵的影響氮源使用的一些相關(guān)問題：

有機氮源和無機氮源應(yīng)當混合使用早期：容易利用易同化的氮源—無機氮源中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質(zhì)

有些產(chǎn)物會受氮源的誘導和阻遏例：蛋白酶的生產(chǎn)

有機氮源選取時也要考慮微生物的同化能力

開發(fā)效果好、有針對性的有機氮源仍然是令人感興趣的課題三、無機鹽的微量元素1、作用：各種不一樣2、來源：C、N源，以鹽的形式補充3、用量：根據(jù)具體的產(chǎn)品，以實驗決定4、使用注意點A.對于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機離子和微量元素在發(fā)酵過程中必須加以考慮例：鐵離子

青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20μg/ml

發(fā)酵罐必須進行表面處理B、使用時注意鹽的形式（pH的變化）例：黑曲酶NRRL-330,生產(chǎn)α-淀粉酶，P對酶活的影響

pH酶活不加4.25120分鐘加K2HPO45.4530分鐘加KH2PO44.6275分鐘四、生長因子、前體和產(chǎn)物促進劑1、生長因子從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。

如以糖質(zhì)原料為碳源的谷氨酸生產(chǎn)菌均為生物素缺陷型，以生物素為生長因子,生長因子對發(fā)酵的調(diào)控起到重要的作用。有機氮源是這些生長因子的重要來源，多數(shù)有機氮源含有較多的B簇維生素和微量元素及一些微生物生長不可缺少的生長因子

2、前體前體指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接彼微生物在生物合成過程中合成到產(chǎn)物物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136作用：前體有助于提高產(chǎn)量和組份用量：前體的用量可以按分子量衡算，具體使用有個轉(zhuǎn)化率的問題例：6000單位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml

苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%實際使用時的轉(zhuǎn)化率在46-90%之間例:某廠單耗為：0.337（kg/10億青霉素）轉(zhuǎn)化率為：0.6/(0.337*36/13.8)=68%用法：前體使用時普遍采用流加的方法前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利

苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07%

前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化，流加也有利于提高前提的轉(zhuǎn)化率3、產(chǎn)物促進劑所謂產(chǎn)物促進劑是指那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。

有些促進劑本身是酶的誘導物；有些促進劑是表面活性劑，可改善細胞的透性，改善細胞與氧的接觸從而促進酶的分泌與生產(chǎn)，也有人認為表面活性劑對酶的表面失活有保護作用；有些促進劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。促進劑提高產(chǎn)量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的

玉米漿（cornsteepliquor,CSL）：亞硫酸浸泡玉米而得到的浸泡液的濃縮物，玉米淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)品，一般用量為0.4～0.8%。主要用作氮源，但它含有乳酸、少量還原糖和多糖，含有豐富的氨基酸、核酸、維生素、無機鹽等，也常用來提供生長因子。麩皮水解液：可以代替玉米漿，但是蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)成分比玉米漿少。用量一般為1%。糖蜜：甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜均可代替玉米漿。但氨基酸等有機氮含量較低。甘蔗糖蜜用量一般為0.1～0.4%。酵母：可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。

提供生長因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料其他原料發(fā)酵農(nóng)作物纖維下腳料：每生產(chǎn)1公斤谷物可產(chǎn)生1～1.5

公斤纖維質(zhì)下腳料，天然纖維質(zhì)原料由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。森林和木材加工工業(yè)的下腳料工廠纖維和半纖維素下腳料城市廢纖維物質(zhì)亞硫酸鹽廢液食品加工業(yè)下腳料五、水

對于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關(guān)重要的，因為在不同水源中存在的各種因素對微生物發(fā)酵代謝影響甚大。

水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。對于釀造行業(yè)，水的重要性不言而喻對于常規(guī)發(fā)酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水。第三節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計和優(yōu)化

目前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方，只能用生物化學、細胞生物學、微生物學等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經(jīng)驗配方，再結(jié)合所用菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設(shè)備，按照一定的實驗設(shè)計和實驗方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。

一、培養(yǎng)基成分選擇的原則

菌種的同化能力

代謝的阻遏和誘導，葡萄糖效應(yīng)

合適的C、N比pH、滲透壓和氧化還原電位

不同微生物菌株、種類，以及微生物菌體的不同生長階段對碳氮比要求不同。酵母細胞C/N為100/20，霉菌為100/10。工業(yè)發(fā)酵為100：（0.2～2.0），氨基酸發(fā)酵，因產(chǎn)物含氮，此比例相對高。霉菌和酵母微酸，細菌偏堿，放線菌中性。厭氧菌需加入還原劑以降低氧化還原電位。

（一）、理論轉(zhuǎn)化率與實際轉(zhuǎn)化率

理論轉(zhuǎn)化率是指理想狀態(tài)下根據(jù)微生物的代謝途徑進行物料衡算，所得出的轉(zhuǎn)化率的大小。

實際轉(zhuǎn)化率是指實際發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化率的大小

如何使實際轉(zhuǎn)化率接近于理論轉(zhuǎn)化是發(fā)酵控制的一個目標

二、成分含量的確定理論轉(zhuǎn)化率的計算：物料平衡如：在酒精生產(chǎn)中葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的理論轉(zhuǎn)化率計算如下∶

C6H12O62C2H5OH＋2CO2

理論得率為：次生代謝：

葡萄糖轉(zhuǎn)化為青霉素的理論得率為：Y＝1.1g培養(yǎng)基的優(yōu)化培養(yǎng)基設(shè)計的幾個步驟：因素（成分）確定

最適成分配比確定（二）、實驗設(shè)計

培養(yǎng)基成分的含量最終都是通過實驗獲得的

合理的實驗方法

多因子實驗：均勻設(shè)計、正交實驗設(shè)計、響應(yīng)面分析等。單因子實驗③當培養(yǎng)基成分確定后，剩下的問題就是各成分最適的濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實驗次數(shù)常采用一些合理的實驗設(shè)計方法。三、培養(yǎng)基設(shè)計的步驟①根據(jù)前人的經(jīng)驗和培養(yǎng)基成分確定時一些必須考慮的問題，初步確定可能的培養(yǎng)基成分；②通過單因子實驗最終確定適宜的培養(yǎng)基成分；實驗設(shè)計正交設(shè)計：四步

根據(jù)問題的要求和客觀條件確定因子和水平，列出因子水平表；根據(jù)因子和水平表選用合適的正交表，設(shè)計正交表頭，并安排實驗；根據(jù)正交表給出的實驗方案，進行實驗；對實驗結(jié)果進行分析，選出較有實驗條件以及對結(jié)果有顯著影響的因子。類胡蘿卜素高產(chǎn)菌Y11的培養(yǎng)基的優(yōu)化郭秒,食品與工業(yè)發(fā)酵，2004類胡蘿卜素的作用：色素、營養(yǎng)保健原培養(yǎng)基:

初步確定可能的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)

通過單因子實驗確定適宜的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源進一步：乙酸鈉的濃度0.2%比較好結(jié)果碳源：乙酸鈉0.2%氮源：氯化銨0.2%

酵母膏0.03%無機鹽:復合無機鹽0.05%

正交設(shè)計確定優(yōu)化的配方改進后培養(yǎng)基原培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基改進后培養(yǎng)基的發(fā)酵結(jié)果四、搖瓶水平到反應(yīng)器水平的優(yōu)化配方搖瓶、反應(yīng)器培養(yǎng)基研究的兩個層次

搖瓶——培養(yǎng)基設(shè)計的第一步

反應(yīng)器—最終的優(yōu)化的基礎(chǔ)配方例：青霉素發(fā)酵發(fā)酵搖瓶：玉米漿4%