FISH技術(shù)在乳腺癌檢測中的應(yīng)用課件

FISH技術(shù)在乳腺癌檢測中的應(yīng)用.FISH技術(shù)在乳腺癌檢測中的應(yīng)用.

細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)

原理：通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交觀察：熒光顯微鏡原位觀察（細(xì)胞、組織）細(xì)胞核彩色探針信號目的：獲得細(xì)胞內(nèi)多條染色體(或染色體片段)或多種

基因狀態(tài)的信息。

熒光原位雜交（FISH）Fluorescenceinsituhybridization.細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)熒光原位雜交（FISH）.熒光標(biāo)記探針探針變性樣本DNA變性雜交用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位FISH原理.熒光標(biāo)記探針探針變性樣本DNA變性雜交用已知的標(biāo)記單鏈核酸為操作簡便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，可與多種技術(shù)結(jié)合，可成功地幫助細(xì)胞遺傳學(xué)家做出回顧性分析方法敏感，能迅速得到結(jié)果探針為直接標(biāo)記，特異性好，信號強(qiáng)標(biāo)本來源豐富，間期細(xì)胞，分裂中期細(xì)胞、分化或未分化細(xì)胞及死亡或存活的細(xì)胞皆可以被檢測FISH技術(shù)的特點(diǎn).操作簡便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，可與多種技術(shù)結(jié)合，方法敏感，能迅速CSP探針：染色體著絲粒探針GLP探針：位點(diǎn)特異性探針WPP探針：全染色體或染色體區(qū)域特異性探針centromeretelomeresubtelomerelocusspecificwholechromosomepaintFISH探針的種類.CSP探針：染色體著絲粒探針centromeretelome制片預(yù)處理FISH結(jié)果分析

破壞細(xì)胞膜利于探針

雜交。

蛋白酶消化、HCl處理

變性

雜交

洗滌

復(fù)染操作流程簡圖.制片預(yù)處理FISH結(jié)果分析破壞細(xì)胞膜利于探針變性乳腺癌

Her-2基因Her-2基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物為人表皮生長因子受體-2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2)，也稱為neu、C-erbB-2、Her-2/neu。.乳腺癌Her-2基因Her-2基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物為人表皮生乳腺癌

Her-2基因

致癌基因：Her-2基因；

位點(diǎn)：17q11.2-q12；

編碼蛋白：跨膜蛋白（與

表皮生長因子受體部分同源）；25-30%乳腺癌病人都有HER-2的擴(kuò)增；HER-2基因擴(kuò)增是決定Herceptin治療是否有效的關(guān)鍵性指標(biāo)。.乳腺癌Her-2基因致癌基因：Her-2基因；.Her-2基因的檢測方法.Her-2基因的檢測方法.HER-2檢測和熒光原位雜交技術(shù)(FISH)FISH成為檢測HER-2的金標(biāo)準(zhǔn)FISH方法的操作簡單，探針重復(fù)性好檢測結(jié)果明確，只需計(jì)數(shù)紅綠信號的比例，方法簡單、直觀結(jié)果可以通過軟件分析,客觀.HER-2檢測和熒光原位雜交技術(shù)(FISH)FISH成為檢測HER-2探針.HER-2探針.HER-2探針.HER-2探針.Her-2基因FISH探針組.Her-2基因FISH探針組.HER-2基因擴(kuò)增模式.HER-2基因擴(kuò)增模式.評價(jià)17號染色體的意義

17號染色體非整倍性：每個細(xì)胞中17號染色體多于或少于2個；

乳腺癌遺傳學(xué)特征之一，可能預(yù)示預(yù)后不良；

17號染色體多體性是導(dǎo)致IHC3+但FISH檢測為陰性的主要原因；

有實(shí)驗(yàn)室完成病例中17號染色體非整倍性發(fā)生率為33.3%。評價(jià)Her-2基因狀態(tài)的同時應(yīng)考慮

17號染色體數(shù)目的變化.評價(jià)17號染色體的意義

評價(jià)Her-2基因狀態(tài)的同時應(yīng)考慮..DAPI染色后與HE切片對比圖觀察浸潤部分導(dǎo)管內(nèi)癌.DAPI染色后與HE切片對比圖觀察浸潤部分導(dǎo)管內(nèi)癌.計(jì)數(shù)細(xì)胞核選擇.計(jì)數(shù)細(xì)胞核選擇.結(jié)果判斷統(tǒng)計(jì)Ratio值（計(jì)數(shù)浸潤性部分的20個細(xì)胞）

Ratio值＝20個細(xì)胞核中紅信號總數(shù)/綠信號總數(shù)

Ratio＜2.0

為陰性結(jié)果

Ratio＞2.0或眾多信號連接成簇時可不計(jì)算為陽性結(jié)果

比值2～4為低度擴(kuò)增4～10為中度擴(kuò)增>10為高度擴(kuò)增Ratio在1.8-2.0

之間時，則需要再計(jì)數(shù)20個細(xì)胞核中

的信號。如仍為臨界值，則應(yīng)在FISH檢測報(bào)告中注明。.結(jié)果判斷統(tǒng)計(jì)Ratio值（計(jì)數(shù)浸潤性部分的20個細(xì)胞）.....A.無須計(jì)數(shù)的大簇團(tuán)信號（高度擴(kuò)增）B.

顆粒狀信號（R>10，高度擴(kuò)增）C.

須計(jì)數(shù)的顆粒狀信號（R=3.5，低度擴(kuò)增）ACBHer-2基因擴(kuò)增狀況.A.無須計(jì)數(shù)的大簇團(tuán)信號（高度擴(kuò)增）B.顆粒狀信號（RHer-2基因無擴(kuò)增情況紅信號數(shù)>2，同時綠信號非整倍體R<2，無擴(kuò)增紅信號與綠信號均為兩點(diǎn)，R=1.Her-2基因無擴(kuò)增情況紅信號數(shù)>2，同時綠信號非整倍體R<常見問題分析.常見問題分析.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.實(shí)驗(yàn)操作.注意事項(xiàng)

組織固定——保持形態(tài)，推薦的固定劑：10%中性緩沖福爾馬林脫蠟徹底蛋白酶預(yù)處理－過消化或消化不足各種試劑的PH值要嚴(yán)格測定

試劑偏酸影響紅色信號

試劑偏堿影響綠色信號變性、雜交、洗滌溫度的要求合適的濾光片－紅色，橙色顯微鏡的汞燈光源－100瓦特，使用不到2年.注意事項(xiàng)

組織固定——保持形態(tài)，推薦的固定劑：10%中性緩沖及時固定標(biāo)本很重要備檢標(biāo)本應(yīng)及時固定及處理乳腺癌：不超過1小時胃癌：20分鐘之內(nèi)從機(jī)體移除至組織開始降解之過程稱為“組織缺血”。組織缺血影響：HER2檢測雌激素及孕激素受體(ER和PR)檢測

從手術(shù)切除到實(shí)驗(yàn)室接收之間的組織處理不當(dāng)會造成不理想和不一致的H