第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化

第一節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

一、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性指的是蛋白質(zhì)抵抗各種因素的影響，保持其生物活力的能力。二、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分子原因1、金屬離子、底物、輔因子和其它低分子量配體的結(jié)合作用。金屬離子由于結(jié)合到多肽鏈的不穩(wěn)定部分（特別是彎曲處），因而可以顯著增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。當(dāng)酶與底物、輔因子和其它低分子量配體相互作用時(shí)，也會(huì)看到蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的增加。

第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性2、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-脂的作用在體內(nèi)，蛋白質(zhì)常與脂類或多糖相互作用，形成復(fù)合物，從而顯著增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)形成復(fù)合物時(shí)，脂分子或蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定到疏水簇上，因而防止疏水簇與溶劑的接觸，屏蔽了蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域，從而顯著增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性3、鹽橋和氫鍵蛋白質(zhì)中鹽橋的數(shù)目較少，但對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性貢獻(xiàn)很顯著。嗜熱脫氫酶亞基間區(qū)域有鹽橋協(xié)作系統(tǒng)，這是嗜溫脫氫酶沒有的。因此嗜熱酶的催化活力的變性溫度和最適溫度都比嗜溫酶高出約20℃。用定點(diǎn)突變法定性定量地測(cè)定了引入的氫鍵對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)加入的氫鍵與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性無(wú)關(guān)。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性4．二硫鍵大分子的分子內(nèi)交聯(lián)可增強(qiáng)其堅(jiān)實(shí)性，并提高其在溶液中的穩(wěn)定性。穩(wěn)定化指的是熵性質(zhì)：由于交聯(lián)即蛋白質(zhì)中形成二硫鍵，伸展蛋白質(zhì)的熵急劇降低第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性物質(zhì)的熵是它所處狀態(tài)的分子混亂度

物質(zhì)的熵是它所處狀態(tài)的分子混亂度

(也稱無(wú)序度)的度量。熵值小的狀態(tài)對(duì)應(yīng)比較有序的狀態(tài),熵值大的狀態(tài)對(duì)應(yīng)比較無(wú)序的狀態(tài)。一種物質(zhì)從固態(tài)到液態(tài)到氣態(tài),分子熱運(yùn)動(dòng)的混亂程度依次增強(qiáng),而熵值也依次增大。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性5、對(duì)氧化修飾敏感的氨基酸含量較低結(jié)構(gòu)上重要的氨基酸殘基（如活性部位氨基酸）的氧化作用是蛋白質(zhì)失活的最常見的機(jī)理之一。半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚環(huán)，對(duì)氧化特別敏感，因此，這些不穩(wěn)定氨基酸的數(shù)目，在高度穩(wěn)定的嗜熱蛋白質(zhì)中比在相應(yīng)的嗜溫蛋白質(zhì)中顯著偏低。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性6、氨基酸殘基的堅(jiān)實(shí)裝配蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在有空隙。按照Chothia說法，蛋白球體積的大約25%仍未充滿，即不是被氨基酸占據(jù)。但溶質(zhì)分子可以包埋在這些孔隙中。這些孔隙通常為水分子所充滿。分子量為2―3萬(wàn)的蛋白質(zhì)中約有個(gè)5―15水分子。由布朗運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)的極性水分子與球體疏水核的接觸會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。隨著水分子從孔隙中除去，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更堅(jiān)實(shí)，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性也增加。因此，蛋白質(zhì)的堅(jiān)實(shí)化可作為一種人為穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方法。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性7、疏水相互作用帶有非極性側(cè)鏈的氨基酸大約占蛋白質(zhì)分子總體積的一半。它們與水的接觸從熱力學(xué)上來說是不利的，因?yàn)榉菢O性部分加入水中，會(huì)使水的結(jié)構(gòu)更有序地排列。水分子的這種結(jié)構(gòu)重排，顯然能引起系統(tǒng)的熵降低和蛋白質(zhì)折疊狀態(tài)的改變：蛋白質(zhì)的非極性部分總是傾向于使其不與水接觸，并盡可能地隱藏在蛋白球體內(nèi)部。從而蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增加。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性第二節(jié)蛋白質(zhì)不可逆失活的原因和機(jī)理

失活機(jī)理變性條件聚合（有時(shí)伴隨形成分子間二硫鍵）加熱，變性劑脲，鹽酸胍,SDS,振動(dòng)

一級(jí)結(jié)構(gòu)改變

1、酸、堿催化的肽鍵水解，蛋白水解作用和自溶作用極端pH值，加熱，蛋白水解酶2、功能基氧化（半胱氨酸巰基和色氨酸吲哚環(huán)）氧氣（特別在加熱時(shí)）氧氣代謝產(chǎn)物，輻射3、二硫鍵還原，分子間二硫交換加熱，高pH，巰基化合物,二硫化物4、必需巰基的化學(xué)修飾金屬離子，二硫化物5、蛋白質(zhì)磷酸化蛋白激酶6、在催化過程中由于反應(yīng)中間物（主要是自由基）引起的“自殺”失活底物7、氨基酸的外消旋化加熱，極端pH8、二硫鍵剪切后形成新氨基酸（賴氨丙氨酸、）加熱，高pH9、天冬酰胺脫氨加熱，高PH輔酶分子從活性部位上解離螯合劑、透析、加熱，金屬離子寡聚蛋白解離成亞基化學(xué)修飾，極端pH,脲，表面活性劑，高溫或低溫吸附到容器表面蛋白質(zhì)濃度低,加熱“不可逆”構(gòu)象改變加熱，極端pH,有機(jī)溶劑,鹽酸胍流體中的剪切失活流體形變第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性一、蛋白水解酶和自溶作用

蛋白水解酶可催化肽鍵水解。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)底物也是一種蛋白水解酶時(shí)，就會(huì)發(fā)生自我降解現(xiàn)象，叫作自溶。二、聚合聚合分三步進(jìn)行：N←U→A→As其中NU代表可逆伸展，A是聚合的蛋白質(zhì)，As是發(fā)生了二硫交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)聚合物。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性1、必須發(fā)生單分子構(gòu)象變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)可逆變性。這個(gè)過程使包埋的疏水性氨基酸殘基暴露于水溶劑。2、這種三級(jí)結(jié)構(gòu)改變了的蛋白質(zhì)分子彼此締合，以最大限度地減少疏水氨基酸殘基的不利的裸露。3、如果蛋白質(zhì)分子含有半胱氨酸和胱氨酸殘基，則會(huì)發(fā)生分子間二硫交換反應(yīng)。與許多其它蛋白質(zhì)失活原因不同，聚合并不一定是不可逆的。使用變性劑破壞分子間的非共價(jià)力（氫鍵或疏水相互作用）并且在無(wú)變性劑時(shí)，通過還原和再氧化再生天然二硫鍵，則有可能使蛋白質(zhì)再活化。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性三、極端pH

圖4-6堿催化的β-消除反應(yīng)破壞二硫鍵，產(chǎn)生新的分子內(nèi)交聯(lián)鍵（賴氨丙氨酸）。硫代半胱氨酸殘基

第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性肽鍵水解也容易在強(qiáng)酸條件下或中等pH和高溫相結(jié)合的條件下發(fā)生。在極端條件下（6mol/LHCI，24h,110℃）蛋白質(zhì)可完全水解成氨基酸。在強(qiáng)酸、中性和堿性pH下容易發(fā)生天冬酰胺和谷氨酰胺的脫氨作用，結(jié)果在蛋白質(zhì)的疏水性內(nèi)部引進(jìn)入負(fù)電荷，導(dǎo)致酶失活。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性四、氧化作用

各種氧化劑能氧化帶芳香族側(cè)鏈的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基。分子氧，H2O2和氧自由基是常見的蛋白質(zhì)氧化劑。在過渡金屬離子（如Cu2+存在下），于堿性pH，半胱氨酸可氧化成胱氨酸。氧化劑強(qiáng)度不同，半胱氨酸也可轉(zhuǎn)變成次磺、亞磺或磺（半胱氨）酸。

H2O2是非專一性氧化劑。在酸性條件下，它主要把蛋氨酸氧化成它的亞砜。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性五、表面活性劑和去污劑

表面活性劑是由疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)組成的化合物。去污劑有離子性和非離子性兩大類，都含有長(zhǎng)鏈?zhǔn)杷舶偷邦^”部基團(tuán)不同，有帶電的，有不帶電的

去污劑在很低濃度下能使蛋白質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不可逆變性。去污劑的關(guān)鍵物理性質(zhì)是其溶解度。如圖4-7所示，當(dāng)去污劑單體加入水溶液時(shí)，一部分溶解，一部分在氣-水界面形成單層。

第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

圖4-7去污劑分子的單體、單層和膠團(tuán)形成示意圖

表面活性劑分子的兩親性質(zhì)使之在水溶液中能自發(fā)形成結(jié)構(gòu)有序的多分子聚集體,通常稱為膠團(tuán)第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性陰離子去污劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），與蛋白質(zhì)的結(jié)合比例是溶液中游離SDS濃度的函數(shù)。當(dāng)單體SDS濃度使某一生物結(jié)合位點(diǎn)飽和時(shí)，則以協(xié)同方式結(jié)合其它位點(diǎn)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)伸展。伸展使先前埋藏的疏水性氨基酸殘基暴露，有利于SDS的進(jìn)一步結(jié)合，直至達(dá)到飽合為止。對(duì)于幾乎所有的蛋白質(zhì)來說，每克蛋白質(zhì)結(jié)合SDS的最大量類似，大約1.4g/g。SDS-多肽復(fù)合物本質(zhì)上是膠團(tuán)，SDS分子聚集在蛋白質(zhì)暴露的疏水區(qū)域周圍。六、變性劑1、脲和鹽酸胍高濃度脲（8-10mol/L）和鹽酸胍（6mol/L）常用于蛋白質(zhì)變性，然而，盡管它們作用很有效，卻沒有普遍接受的作用機(jī)理。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有兩個(gè)特點(diǎn)已經(jīng)明確，第一，這些試劑消除了在維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中起重要作用的疏水相互作用。第二，它們直接與蛋白質(zhì)分子作用。盡管準(zhǔn)確的作用機(jī)理不清楚，但脲及鹽酸胍廣泛用于檢測(cè)蛋白質(zhì)可逆伸展的構(gòu)象穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)特別注意的是，由脲可自發(fā)形成氰酸鹽。8mol/L脲溶液平衡時(shí)大約含有0.02mol/L氰酸鹽。氰酸鹽可與蛋白質(zhì)中的氨基和巰基相互作用，引起不可逆失活。因此，脲溶液應(yīng)在用前用優(yōu)質(zhì)固體脲新鮮配制第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性1．

2、高濃度鹽

高濃度鹽對(duì)蛋白質(zhì)既可有穩(wěn)定作用，也可有變性作用，這要看鹽的性質(zhì)和濃度.與Hofmeister離子促變序列有關(guān)：（CH3）4N+>NH4+>K+,Na+>Mg2+>Ca2+>Ba2+>SO42->CI->Br->NO3->CIO4->SCN-1）越靠近序列左側(cè)的離子對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用越強(qiáng)，2）愈靠近該序列右邊的離子越使蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。（NH4）2SO4是眾所周知的酶穩(wěn)定劑，貯存酶時(shí)常用它。相反，NaSCN(硫氰酸鈉)是已知的紊亂劑，使蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性1．

3、

螯合

1）結(jié)合金屬離子的試劑,如EDTA能使金屬酶失活，這是由于EDTA與金屬離子形成配位復(fù)合物，從而使酶失去金屬輔因子造成的。這類失活常常是不可逆的，但失去金屬輔因子也能引起大的構(gòu)象變化，從而導(dǎo)致活力不可逆喪失。2）螯合劑通?？梢苑€(wěn)定不需要金屬離子的蛋白質(zhì)，因?yàn)轵蟿┛煞€(wěn)定有害的金屬離子。EDTA：乙二胺四乙酸

第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性1．

4、有機(jī)溶劑

酶既可在水溶液中發(fā)揮作用，也可在無(wú)水有機(jī)溶劑中發(fā)揮作用。1）當(dāng)與水混溶的有機(jī)溶劑加入蛋白質(zhì)水溶液中時(shí)，則可看到酶失活。這是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑通過疏水相互作用直接結(jié)合于蛋白質(zhì)，并改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù)。有機(jī)溶劑通過增加疏水核的溶解度，降低帶電表面的溶解度而具有使蛋白質(zhì)“從里往外翻”的傾向。2）蛋白質(zhì)（酶）要在幾乎無(wú)水的環(huán)境中發(fā)揮作用，必須在其分子表面有一單層必需水來維持它的活性構(gòu)象，而與水混溶的有機(jī)溶劑能奪去酶分子表面的必需水，因而使酶失活。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性電容器的極板間充滿電介質(zhì)時(shí)的電容與極板間為真空時(shí)的電容之比值稱為（相對(duì)）介電常數(shù)。

物料介電常數(shù)物料介電常數(shù)水80水泥1.5-2.5甲醇33.7干砂2.5煤油2.8洗衣粉1.2-1.5礦物油2.1純白糖3油4.6食鹽7.5丙酮20碳酸鈣8.3-8.8苯2.3聚本乙烯2.4-2.6油漆3.5橡膠2-3第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性七、重金屬和巰基試劑

1、已知重金屬陽(yáng)離子，如Hg2+，Cd2+，Pb2+能與蛋白質(zhì)的巰基反應(yīng)（將其轉(zhuǎn)化為硫醇鹽），也能與組氨酸和色氨酸殘基反應(yīng)。銀或汞能催化水解二硫鍵2、巰基試劑通過還原二硫鍵也能使酶失活，但這個(gè)作用常是可逆的。3、低分子量的含二硫鍵的試劑可與蛋白質(zhì)巰基作用，形成混合二硫鍵，或者在兩個(gè)半胱氨酸殘基之間形成蛋白分子內(nèi)的二硫鍵。雙硫試劑與氧化型谷胱甘肽和含有催化作用必需的巰基的酶之間也會(huì)發(fā)生同樣的二硫交換反應(yīng)。DTNB：5,5’-二硫代-雙（2-硝基苯甲酸）第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性八、熱熱失活通常也是兩步過程：酶可逆熱伸展使它的反應(yīng)基團(tuán)和疏水區(qū)域暴露，隨后相互作用導(dǎo)致不可逆失活。有兩種構(gòu)象過程能引起不可逆熱失活。第一，由于熱伸展，包埋的疏水區(qū)域一旦暴露于溶劑，則會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)聚合。第二，單分子構(gòu)象擾動(dòng)能引起酶失活。高溫（90-100℃）下，依賴pH的共價(jià)反應(yīng)限制了酶的熱穩(wěn)定性。1、Asn和Gln的脫胺作用，在Asp處的肽鍵水解，Cys的氧化，二硫交換作用和二硫鍵的破壞。上述這些破壞性反應(yīng)直接導(dǎo)致高溫下酶失活。2、系統(tǒng)中有還原糖（如葡萄糖），糖很易與Lys的ε-氨基作用，這叫“Maillard反應(yīng)”，是食品工業(yè)中熱失活的原因。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性機(jī)械力，如壓力、剪切力、振動(dòng)和超聲能使蛋白質(zhì)變性。從道理上說，變性是可逆的，但這很難驗(yàn)證，因?yàn)槌０殡S引起不可逆失活的聚合或共價(jià)反應(yīng)。1．

振動(dòng)振動(dòng)使蛋白質(zhì)失活的機(jī)理是，振動(dòng)增加氣-液界面的面積。蛋白分子在這個(gè)界面上呈線性排列并伸展，以使疏水殘基最大限度地暴露于空氣。然后，蛋白質(zhì)由于疏水區(qū)域的暴露而聚合。2．

剪切當(dāng)酶溶液快速通過管道或膜時(shí)，則在管（膜）壁處或靠近管（膜）壁處產(chǎn)生剪切力梯度。這個(gè)梯度能引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，導(dǎo)致原先埋藏的疏水區(qū)域暴露，然后聚合。失活程度隨剪切速度的增大和暴露時(shí)間的增長(zhǎng)而增加。九、機(jī)械力第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性3、超聲波

超聲波壓力使溶解的氣體產(chǎn)生小氣泡，小氣泡迅速膨脹至一定程度時(shí)突然破碎，這就是空化作用，它既產(chǎn)生機(jī)械力，又產(chǎn)生化學(xué)變性劑（如在小氣泡中熱反應(yīng)所產(chǎn)生的自由基），結(jié)果使蛋白質(zhì)失活。4、壓力

0.1-6×108pa的壓力下可使酶失活。壓力誘導(dǎo)的失活通常認(rèn)為是蛋白質(zhì)變性后聚合的結(jié)果，但還有另外兩個(gè)失活機(jī)理：第一，已經(jīng)證明，多亞基酶在高壓下可解離成單體，取消壓力后，活力得到不同程度的恢復(fù)，但很多這類失活是不可逆的。第二，關(guān)于乳酸脫氫酶的工作表明，半胱氨酸氧化與失活機(jī)理有關(guān)，而這個(gè)反應(yīng)與壓力引起的酶結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性十、冷凍和脫水酶溶液通?？稍诘蜏叵沦A存時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)間，也有不少例外，冷凍可使蛋白質(zhì)發(fā)生可逆和不可逆失活。1、在冷凍過程中，溶質(zhì)（酶和鹽）隨著水分子的結(jié)晶而被濃縮，引起酶微環(huán)境中的pH和離子強(qiáng)度的劇烈改變。如磷酸鹽緩沖液的pH在冷凍后可由7變到3.5，這個(gè)pH很容易引起蛋白質(zhì)的酸變性。2、鹽的濃縮可提高離子強(qiáng)度，引起寡聚蛋白質(zhì)的解離。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性3、二硫交換或巰基氧化。

隨著冷凍進(jìn)行，酶濃度增加，半胱氨酸濃度也增加。當(dāng)這種濃縮效應(yīng)與構(gòu)象變化同時(shí)發(fā)生時(shí)，分子內(nèi)和分子間的二硫交換反應(yīng)就很容易發(fā)生，巰基在低溫下更易氧化，因?yàn)樵?3℃部分凍結(jié)系統(tǒng)內(nèi)的氧濃度要比0℃溶液中的高1150倍。這種濃縮效應(yīng)還能增加氧自由基的濃度。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性十一、輻射作用1、不同的電離輻射（如γ-射線，X-射線，電子，α-粒子）對(duì)蛋白質(zhì)分子及其周圍水分子產(chǎn)生的化學(xué)變化類型是相似的。1）直接作用（輻射對(duì)蛋白質(zhì)分子的影響）引起，電離輻射的直接作用由于形成自由基而引起一級(jí)結(jié)構(gòu)的共價(jià)改變，繼而交聯(lián)或氨基酸破壞。2）間接作用（水輻射分解副產(chǎn)物對(duì)蛋白質(zhì)分子的影響）引起，是由于在水溶液中形成反應(yīng)性產(chǎn)物，其中主要是·OH(羥自由基)，溶解的電子和H2O2等。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性2、非電離輻射，如可見光或UV輻射也能使蛋白質(zhì)失活?？梢姽獾墓饣瘜W(xué)氧化要求光敏化染料，它能吸收光能，然后氧化蛋白分子中的敏感基團(tuán)（半胱氨基，色氨酸，組氨酸）。UV輻射能直接破壞蛋白質(zhì)的氨基酸而使蛋白質(zhì)失活；胱氨酸和色氨酸殘基特別不穩(wěn)定。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性第三節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性酶穩(wěn)定化方法概述

第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性表4-4酶穩(wěn)定化方法概述

方法說明固定化

1、酶多點(diǎn)連接于載體上酶構(gòu)象堅(jiān)固化；立體障礙防止蛋白水解酶的降解作用2、分配效應(yīng)和擴(kuò)散限制載體的化學(xué)和物理性質(zhì)影響酶分子周圍的微環(huán)境非共價(jià)修飾

1、添加劑專一性添加劑使N≒U平衡向N移動(dòng)；競(jìng)爭(zhēng)性添加劑除掉破壞性催化劑；有的中性鹽和多羥基化合物的保護(hù)作用2、反相膠團(tuán)反相膠團(tuán)中酶抵抗有機(jī)溶劑變性3、蛋白質(zhì)間相互作用酶的抗體保護(hù)酶化學(xué)修飾

1、共價(jià)交聯(lián)使酶構(gòu)象堅(jiān)固化2、改變離子狀態(tài)或引入立體障礙的試劑修飾增加、中和或改變酶分子上的帶電殘基；可溶性大分子的連結(jié)抑制與其它溶質(zhì)（蛋白酶）的相互作用蛋白質(zhì)工程定點(diǎn)突變?nèi)〈环€(wěn)定的氨基酸殘基，引入穩(wěn)定酶的因素第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性一、固定化1、酶固定到載體上后可產(chǎn)生空間障礙，結(jié)果，其它大分子難于與酶作用。因此，固定到載體上的酶往往能抵抗蛋白水解酶的降解作用，這也是防止蛋白水解酶自溶的原因。固定化也能抑制化學(xué)失活，因?yàn)檩d體阻擋酶不能與失活劑接觸。2、底物，配體和氫離子濃度在載體附近和整體溶液之間的分布不均一。視底物和載體的性質(zhì)（帶電、疏水性等），其在載體周圍的局部濃度與整體溶液不同，也就是說，酶的微環(huán)境有了改變。因此，與游離酶相比?？煽吹焦潭ɑ傅淖钸mpH，底物專一性和動(dòng)力學(xué)常數(shù)發(fā)生改變。例如，用陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑作載體固定的酶，其最適pH分別向高pH和低pH值移動(dòng)。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性3、當(dāng)酶包埋在多孔顆粒內(nèi)，底物必須先擴(kuò)散到顆粒表面（外部質(zhì)量傳遞），然后進(jìn)入顆粒內(nèi)部（內(nèi)部質(zhì)量傳遞），酶才能與其作用。這些擴(kuò)散限制可明顯使固定化酶“穩(wěn)定化”。外擴(kuò)散：底物必須從流動(dòng)的水溶液傳遞到固定化酶顆粒外表面，這一過程叫外擴(kuò)散內(nèi)擴(kuò)散：底物進(jìn)一步傳遞到固定化酶顆粒內(nèi)部，這一過程叫內(nèi)擴(kuò)散第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性4．

將酶多點(diǎn)共價(jià)連接到載體表面，或用雙功能試劑交聯(lián)酶，或?qū)⒚赴裨谳d體緊密的孔中，可以使酶構(gòu)象更加堅(jiān)牢，從而阻止酶構(gòu)象從折疊態(tài)向伸展態(tài)過渡

圖4-8多點(diǎn)固定酶結(jié)構(gòu)示意圖：（A）用雙功能試劑交聯(lián)；（B）共價(jià)或非共價(jià)連于載體上；（C）包埋到載體的緊密孔中。

第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性二、非共價(jià)修飾

1．反相膠團(tuán)反相膠團(tuán)是由兩性化合物在占優(yōu)勢(shì)的有機(jī)相中形成的。反相膠團(tuán)不僅可以保護(hù)酶，還能提高酶活力，改變酶的專一性。在保證酶有效作用所必需的水量的前提下，酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性比在水中更好。例如，在干燥的三丁酸甘油酯中的脂肪酶相當(dāng)穩(wěn)定，100℃時(shí)的半衰期大于12h,而水含量大于1%時(shí)，酶立即失活。圖4-12反相膠團(tuán)示意圖第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性2．

添加劑

許多化合物可增加溶液酶或凍干過程中酶的穩(wěn)定性。這類物質(zhì)分為三類：1）專一性的底物和配體酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物、變構(gòu)效應(yīng)劑、輔酶或輔酶衍生物能與酶緊密結(jié)合（單點(diǎn)或多點(diǎn)結(jié)合），因而使天然酶≒伸展酶之間的平衡向天然酶方向移動(dòng)，從而對(duì)酶的總活力產(chǎn)生有益的影響。如果酶與底物結(jié)合，則得到低內(nèi)能構(gòu)象，產(chǎn)生的復(fù)合物能更好地抵抗變性作用。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性2）非專一性的中性鹽和多羥基化合物甘油、糖和聚乙二醇是多羥基化合物，能形成很多氫鍵，并有助于形成“溶劑層”，這種酶分子周圍的溶劑層與整體水相不同。它們可增加表面張力和溶液粘度。這類添加劑通過對(duì)蛋白質(zhì)的有效脫水，降低蛋白水解作用而起穩(wěn)定酶的作用。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性3）與酶失活劑競(jìng)爭(zhēng)的物質(zhì)或除掉破壞化學(xué)反應(yīng)催化劑的物質(zhì)，如加入的蛋白質(zhì)，螯合劑和還原劑。螯合劑能絡(luò)合金屬離子，因而可防止活化氧的自氧化作用，也能防止金屬離子誘導(dǎo)的聚合作用。然而螯合劑也能除去活性部位必需的金屬離子，使酶失活。還原劑可防止必需功能基團(tuán)的氧化，但它也有缺點(diǎn)。如常用的巰基乙醇能還原蛋白質(zhì)的二硫鍵、催化導(dǎo)致聚合的二硫交換反應(yīng)。添加劑不僅可以提高酶的熱穩(wěn)定性，還可提高酶抗蛋白水解、抗化學(xué)試劑、抗pH變化、抗變性劑、抗稀釋作用等的穩(wěn)定性。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性3．

蛋白質(zhì)間非共價(jià)相連蛋白質(zhì)間相互作用時(shí)，由于從蛋白質(zhì)表面相互作用區(qū)域排除水，因而降低自由能，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。酶的多聚體或酶的聚合體的活力和穩(wěn)定性也常比其單體高。例如，α-淀粉酶與其抗體的復(fù)合物在70℃時(shí)的半壽期為16h，而天然酶的半壽期僅為5min。

第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性三、

化學(xué)修飾

1．

可溶性大分子修飾酶如：PEG修飾的人血紅蛋白可作為血漿代用品，而且具有輸血與血型無(wú)關(guān)，凍干后可永久保存，避免輸血時(shí)可能發(fā)生的肝炎和艾滋病毒感染等優(yōu)點(diǎn)。用戊二醛將白蛋白偶聯(lián)到棕色固氮菌超氧化物岐化酶上，所得綴合物的熱穩(wěn)定性明顯提高，修飾酶的半壽期約為天然酶的1.5倍（80℃時(shí)保溫）；同時(shí)，修飾酶抗蛋白水解及酸水解的效能以及抗抑制劑作用都有顯著提高。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性2．

小分子修飾酶

共價(jià)修飾蛋白質(zhì)達(dá)到穩(wěn)定化的原因：A)修飾有時(shí)會(huì)獲得不同于天然蛋白質(zhì)構(gòu)象的更穩(wěn)定構(gòu)象;將酶構(gòu)象轉(zhuǎn)變成更穩(wěn)定構(gòu)象，較難實(shí)現(xiàn)，因?yàn)橛苫瘜W(xué)修飾引起的構(gòu)象變化特征一般是很難預(yù)測(cè)的。B)由于修飾“關(guān)鍵功能基團(tuán)”也會(huì)達(dá)到穩(wěn)定化;化學(xué)修飾蛋白質(zhì)時(shí)常不能導(dǎo)致穩(wěn)定性隨修飾功能基數(shù)目的增加而顯著變化。當(dāng)修飾的功能基數(shù)達(dá)到臨界值時(shí)，穩(wěn)定性突然增加。第四章蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

圖4-13修飾α-胰凝乳蛋白酶NH2-基的數(shù)目與抗熱失活穩(wěn)定化效應(yīng)