第二章各種工具酶課件

第二章各種工具酶第二章各種工具酶1內(nèi)容提要第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第二節(jié)DNA連接酶第三節(jié)DNA聚合酶(聚合酶I/Taq聚合酶/反轉(zhuǎn)錄酶)內(nèi)容提要第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶2第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶

Restrictionendonuclease（RE）一、限制性核酸內(nèi)切酶的概念二、限制性內(nèi)切酶的命名三、限制性內(nèi)切酶的類型四、影響限制性酶活性的因素五、限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA的消化第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶Restrictionendo3一、概念1.定義是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA中的特定核苷酸序列，并在特定位點(diǎn)切割雙鏈DNA的內(nèi)切酶。2.來源細(xì)菌的限制性內(nèi)切酶。一、概念1.定義43.功能(1)限制Restriction侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA（非甲基化），能被限制性內(nèi)切酶識(shí)別和降解，從而保護(hù)自身的DNA不被降解。3.功能(1)限制Restriction5圖細(xì)菌的限制系統(tǒng)圖細(xì)菌的限制系統(tǒng)6細(xì)菌自身的DNA可被甲基化酶修飾，從而防止限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和水解。①Dam甲基化酶在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。②Dcm甲基化酶在CCAGG序列的第2個(gè)胞嘧啶C5位引入甲基。(2)修飾Modification細(xì)菌自身的DNA可被甲基化酶修飾，從而防止限制性內(nèi)切酶的識(shí)別7圖細(xì)菌的修飾系統(tǒng)圖細(xì)菌的修飾系統(tǒng)8圖甲基化位點(diǎn)：DNA上的A/C圖甲基化位點(diǎn)：DNA上的A/C9二、限制性內(nèi)切酶的命名1973年Smith等提出酶的命名原則。用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母，表示宿主菌的物種名。如大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示。用一個(gè)大寫字母表示菌株或型。如EcoR。同一宿主菌內(nèi)，如有不同的限制酶，用羅馬字母表示。如EcoRI。二、限制性內(nèi)切酶的命名1973年Smith等提出酶的命名原則10限制酶的命名限制酶的命名11圖幾種重要的限制酶圖幾種重要的限制酶12圖幾種限制酶的識(shí)別位點(diǎn)圖幾種限制酶的識(shí)別位點(diǎn)13三、限制性內(nèi)切酶的分類分為I型、II型和III型。三、限制性內(nèi)切酶的分類分為I型、II型和III型。141.I型限制性內(nèi)切酶1968年，首先由M.Meselson和R.Yuan在大腸桿菌B株和K株分離。如EcoB和EcoK。（1）識(shí)別序列未甲基化修飾的特異序列：EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I型限制性內(nèi)切酶1968年，首先由M.Mesel15（2）切割位點(diǎn)切點(diǎn)距離識(shí)別位點(diǎn)約400~7000bp。不在識(shí)別位點(diǎn)。隨機(jī)切開一條單鏈。如一條DNA鏈甲基化，就行使甲基化酶功能，使另一條鏈甲基化。如兩條鏈已甲基化，酶從DNA鏈解離。需ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸。（2）切割位點(diǎn)切點(diǎn)距離識(shí)別位點(diǎn)約400~7000bp。不在162.III型限制性內(nèi)切酶與I型酶有甲基化功能。能在DNA鏈上的特異位點(diǎn)切割。其切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)以外。反應(yīng)需要ATP、Mg2+和S-腺苷蛋氨酸?；蚬こ讨杏猛静淮?。如EcoP15:CAGCAG------

2.III型限制性內(nèi)切酶與I型酶有甲基化功能。173.II型限制性內(nèi)切酶1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox首先從流感嗜血菌中分離出HindⅡ。（1）識(shí)別序列與特點(diǎn)雙鏈DNA。未甲基化修飾的靶序列。識(shí)別序列長(zhǎng)度4~8bp。多數(shù)是回文結(jié)構(gòu)。IIs型除外。（2）酶切位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)處，切開雙鏈DNA，形成粘性末端或平齊末端。3.II型限制性內(nèi)切酶1970年，H.O.Smith和K18圖Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)：回文序列圖Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)：回文序列19(3)平齊末端bluntendEcoRV：產(chǎn)生平齊末端。5’-GAT

ATC-3’3’-CTA

TAG-5’(3)平齊末端bluntendEcoRV：產(chǎn)生平20(4)粘性末端stickyend含有幾個(gè)核苷酸的單鏈末端。①5′端突出EcoRI：形成5’-粘性末端。5’-G

AATTC-3’3’-CTTAA

G-5’②3′端突出PstI：形成3’-粘性末端。5’-CTGCA

G-3’3’-G

ACGTC-5’(4)粘性末端stickyend含有幾個(gè)核苷酸的單鏈21G

AATTC

CTTAA

G

GAATTC

CTTAA

G5’--3’

3’--5’

5’--3’

3’--5’

EcoRI：5’端凸出GAATTCCTTAAGG22CTGCA

G

G

ACGTC

5’--3’

3’--5’

5’--3’

3’--5’

CTGCAG

GACGTC

PstI：3’端凸出CTGCAGGACGTC5’--3’3’--5’23③粘性末端的意義連接方便不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。③粘性末端的意義連接方便24圖粘性末端連接圖粘性末端連接255’末端標(biāo)記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。補(bǔ)平成平齊末端粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。5’末端標(biāo)記26四、同裂酶Isoschizomers識(shí)別位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶。①完全同裂酶識(shí)別序列相同和切點(diǎn)相同。

HindⅢ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’

HsuI5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’

四、同裂酶Isoschizomers識(shí)別位點(diǎn)的序列相同的27XmaI5’-C

CCGGG-3’3’-GGGCC

C-5’SmaI5’-CCC

GGG-3’3’-GGG

CCC-5’②不完全同裂酶識(shí)別序列相同，但切點(diǎn)不同。XmaI5’-CCCGGG-3’②不完全28五、同尾酶Isocaudamers1.定義識(shí)別序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI等為同尾酶。2.特點(diǎn)同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后，形成的新位點(diǎn)，不能再被原來的酶所識(shí)別。五、同尾酶Isocaudamers1.定義295’-G

GATCC-3’3’-CCTAG

G-5’

BamHIBclI5’-T

GATCA-3’3’-ACTAG

T-5’5’-A

GATCT-3’3’-TCTAG

A-5’

BglⅡ5’-GGATCC-3’BamHIBclI5’-T305’-G

3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’

BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’

BamHIBglⅡSau3A同尾酶的粘性末端結(jié)合形成的新位點(diǎn)不能再被原來的酶識(shí)別5’-GGATCT-3’BamHIBglⅡ5’-GG31六、限制酶的活性限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性，只有在最適條件下，才表現(xiàn)出最大酶切能力和位點(diǎn)專一性。1.活性的定義在適當(dāng)反應(yīng)條件下，1小時(shí)內(nèi)完全酶解1

g特定DNA底物，所需要的限制性內(nèi)切酶的量，為一個(gè)活性單位。六、限制酶的活性限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性，只有在最適條件32星號(hào)活性:改變反應(yīng)條件，導(dǎo)致限制酶的專一性和切割效率的改變。如EcoRI和BamHI等都有*活性。使用時(shí)要防止星號(hào)活性。2.星號(hào)活性（*）星號(hào)活性:2.星號(hào)活性（*）33在低鹽、高pH（>8）時(shí)可識(shí)別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等5’-GAATTC-3’EcoRI：在低鹽、高pH（>8）時(shí)可識(shí)別和切割GAATTA、AAATT34七、三類限制酶的特性比較特性I類內(nèi)切酶II類內(nèi)切酶III類內(nèi)切酶限制和修飾作用的活性單一多功能的酶內(nèi)切酶和甲基化酶分開共同亞基的雙功能酶酶蛋白結(jié)構(gòu)3種不同亞基同型二聚體2種不同亞基限制所需要的輔助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+

ATP、Mg2+和SAM特異性位點(diǎn)或識(shí)別序列EcoB：TGA(N)8TGCT回文序列EcoRI：GAATTCEcoP1:AGACC七、三類限制酶的特性比較特性I類內(nèi)切酶II類內(nèi)切酶III類內(nèi)35八、影響限制性酶活性的因素1.DNA的純度DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。采取措施：①純化DNA②加大酶的用量③延長(zhǎng)保溫時(shí)間④擴(kuò)大反應(yīng)體積（>20

l）八、影響限制性酶活性的因素1.DNA的純度362.DNA的甲基化程度（1）大腸桿菌有2種甲基化酶修飾質(zhì)粒：dam甲基化酶：修飾GATC中的A。dcm甲基化酶：修飾CCA/TGG的C。（2）基因工程中使用的是甲基化酶失活突變的菌株。2.DNA的甲基化程度（1）大腸桿菌有2種甲基化酶修飾質(zhì)粒373.溫度Tm不同的限制性內(nèi)切酶，最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。酶最適oC酶最適oC酶最適oCMaeIIMaeIII5055BstEIITaqI6065ApaIMaeISmaI3045253.溫度Tm不同的限制性內(nèi)切酶，最適反應(yīng)溫度不同。酶最384.緩沖液Buffer緩沖液是影響限制酶活性的重要因素。化學(xué)組成：MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強(qiáng)度。Tris-HCl：維持pH。二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性。牛血清白蛋白（BSA）：有助于酶的穩(wěn)定。商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。4.緩沖液Buffer緩沖液是影響限制酶活性的重要因素39九、限制性內(nèi)切酶酶切圖譜Restrictionmapping1.限制酶對(duì)DNA的酶切方法完全酶切/消化對(duì)DNA上所有的識(shí)別位點(diǎn)都被酶切開。應(yīng)用有限。部分酶切/消化DNA上只有部分酶切位點(diǎn)被切開。部分酶切的方法：縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度、減少酶的用量。九、限制性內(nèi)切酶酶切圖譜Restrictionmappin40圖完全酶切如EcoRI（GAATTC）的4個(gè)位點(diǎn)都被切開。12341234圖完全酶切如EcoRI（GAATTC）的4個(gè)位點(diǎn)都被41圖部分酶切4個(gè)EcoRI位點(diǎn)中，僅酶切2個(gè)位點(diǎn)。123414圖部分酶切4個(gè)EcoRI位點(diǎn)中，僅酶切2個(gè)位點(diǎn)。123422.限制性內(nèi)切酶圖譜（1）定義DNA上某些限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的圖譜，可作為DNA片段的特殊標(biāo)記。也稱DNA物理圖譜。2.限制性內(nèi)切酶圖譜（1）定義43（2）酶切圖譜的建立識(shí)別4個(gè)核苷酸的內(nèi)切酶，在DNA鏈上出現(xiàn)機(jī)率為：1/44＝1/256bp識(shí)別6個(gè)核苷酸的內(nèi)切酶，在DNA鏈上出現(xiàn)機(jī)率為：1/46＝1/4.1kb識(shí)別8個(gè)核苷酸的內(nèi)切酶，在DNA鏈上出現(xiàn)機(jī)率為：1/48＝1/65.5kb（2）酶切圖譜的建立識(shí)別4個(gè)核苷酸的內(nèi)切酶，在DNA鏈上出現(xiàn)443.限制酶酶切圖譜的分析EcoR1NotIEcoRINotI2.0kb3.0kb1.0kbEcoRINotIEcoRI/NotI3.0kb5.0kb2.0kb3.0kb5.0kb4.0kb1.0kb3.限制酶酶切圖譜的分析EcoR1NotIEcoRINot454.酶切產(chǎn)物的檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳法DNA經(jīng)內(nèi)切酶酶切，然后在瓊脂糖凝膠電泳分析。適合小分子DNA分析。SouthernBlot法DNA酶切后，電泳分離。后變性后轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維膜，然后與同位素標(biāo)記的探針雜交，最后做放射自顯影，檢測(cè)多態(tài)性條帶。4.酶切產(chǎn)物的檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳法46瓊脂糖凝膠電泳圖譜瓊脂糖凝膠電泳圖譜47第二節(jié)DNA連接酶ligase內(nèi)容提要一、DNA連接酶的種類二、DNA連接的特點(diǎn)三、連接反應(yīng)的機(jī)理四、連接反應(yīng)的溫度五、影響連接反應(yīng)的因素第二節(jié)DNA連接酶ligase內(nèi)容提要48一、DNA連接酶的種類1.大腸桿菌DNA連接酶連接粘性末端。2.T4噬菌體DNA連接酶連接粘性末端。連接齊平末端。一、DNA連接酶的種類1.大腸桿菌DNA連接酶49二、連接反應(yīng)的條件（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。（3）需要能量動(dòng)物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+二、連接反應(yīng)的條件（1）必須是兩條雙鏈DNA。50三、連接反應(yīng)的機(jī)理1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。2.ATP與連接酶形成共價(jià)“連接酶-AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi。3.AMP與連接酶的賴氨酸

-氨基相連。4.AMP隨后從連接酶的賴氨酸

-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”復(fù)合物。5.3’-OH對(duì)磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。三、連接反應(yīng)的機(jī)理1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。51四、連接反應(yīng)的溫度1.最佳溫度連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37

C。2.實(shí)用溫度但在37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。所以一般采用4~16

C。四、連接反應(yīng)的溫度1.最佳溫度52五、影響連接反應(yīng)的因素1.插入片段與載體的濃度比例

10~20倍。增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。2.反應(yīng)溫度12.5℃。一般14~16℃。五、影響連接反應(yīng)的因素1.插入片段與載體的濃度比例53第三節(jié)DNA聚合酶內(nèi)容提要一、常用的DNA聚合酶二、DNA聚合酶的特點(diǎn)三、DNA聚合酶的用途第三節(jié)DNA聚合酶內(nèi)容提要54一、常用的DNA聚合酶1.大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過的T7DNA聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶一、常用的DNA聚合酶1.大腸桿菌DNA聚合酶55二、DNA聚合酶的特點(diǎn)1.共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’-OH端。2.主要區(qū)別持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)dNTPs就會(huì)從模板上解離下來。二、DNA聚合酶的特點(diǎn)1.共同特點(diǎn)56DNA聚合酶3’

5’外切酶活性5’

3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高3.DNA聚合酶的特性比較DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率57三、各種DNA聚合酶的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶I主要用來制備帶放射性標(biāo)記的DNA探針。（1）聚合酶I的性質(zhì)①一條單鏈多肽。②具備5’

3’外切酶活性，位于N端。③具備3’

5’外切酶活性。具備5’

3’的聚合酶活性。用枯草桿菌蛋白酶處理，可以切掉N端的5’

3’外切酶活性部分，就成為Klenowfragment。三、各種DNA聚合酶的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶I58（2）用DNA聚合酶I制備探針①核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的、帶有標(biāo)記的寡聚核苷酸。標(biāo)記：已知序列的核酸片段顯示位置：與互補(bǔ)的待測(cè)序列雜交（2）用DNA聚合酶I制備探針①核酸探針（probe）標(biāo)59標(biāo)記已知序列的核酸片斷②探針的標(biāo)記方式標(biāo)記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5’

3’

標(biāo)記已知序列的核酸片斷②探針的標(biāo)記方式標(biāo)記已知序列的核酸片60③DNA聚合酶I對(duì)探針序列的標(biāo)記放射性同位素標(biāo)記。A.放射性同位素標(biāo)記切口轉(zhuǎn)移法(nicktranslation)：5’

3’外切酶活性從DNA切口的下一段DNA的5’端除去一個(gè)核苷酸后，聚合酶活性就會(huì)在切口的上一段DNA的3’一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸。③DNA聚合酶I對(duì)探針序列的標(biāo)記放射性同位素標(biāo)記。61切口轉(zhuǎn)移法切口切口5’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

切口轉(zhuǎn)移法切口切口5’5’3’3’5’3’5’621.純化的DNA片段2.DNaseI制造單鏈切口4.DNAPolI進(jìn)行切口轉(zhuǎn)移3.一種

-32P-dNTP和dNTPs

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標(biāo)記1.純化的DNA片段2.DNaseI制造單鏈切口4.DN632.Klenowfragment（1）Klenowfragment的性質(zhì)DNAPolI經(jīng)枯草桿菌蛋白酶酶切，失去5’

3’外切酶活性后的大片段(76KD）。具有5’

3’聚合酶活性和3’

5’外切酶活性。2.Klenowfragment（1）Klenowfr64（2）主要用途①3’端補(bǔ)平補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。5’

5’

klenowklenow（2）主要用途①3’端補(bǔ)平5’5’klenowklen65②DNA3’末端標(biāo)記在3’隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。②DNA3’末端標(biāo)記663’隱蔽末端的片段Klenow片段補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇一種

-32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA

限制性內(nèi)切酶切5’----G3’

3’----CTTAA5’

5’----GAA3’

3’----CTTAA5’

5’----GAATT3’

3’----CTTAA5’

5’----G3’

3’----CCTAG5’

5’----GG3’

3’----CCTAG5’

5’----GGATC3’

3’----CCTAG5’

EcoRIBamHI

-32P-dATP

-32P-dGTP25oC1h3’隱蔽末端的片段Klenow片段補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇一種67mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenowfragment5’

3’

3’

5’

5’

3’

引物③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenowfr683.T4DNA聚合酶（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)①來源：從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由噬菌體基因43編碼。②酶活性：有5’

3’聚合酶活性和3’

5’外切酶活性（降解單鏈更快）。3.T4DNA聚合酶（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)69③特點(diǎn)當(dāng)沒有dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶行使3’

5’外切酶功能，制造出3’隱蔽端。如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP的位置。③特點(diǎn)70T4DNA聚合酶5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

T4DNA聚合酶無dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’

5’

T4DNA聚合酶5’5’3’3’5’5’3’71（2）T4DNA聚合酶的用途①補(bǔ)平隱蔽末端②DNA3’末端標(biāo)記標(biāo)記末端（取代合成法）方法：用3’

5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出3’隱蔽端。再利用它的5’

3’聚合酶活性補(bǔ)平，并加入放射性標(biāo)記的dNTP。（2）T4DNA聚合酶的用途①補(bǔ)平隱蔽末端72酶切中間產(chǎn)生兩個(gè)末端標(biāo)記加入某種32P-dNTP和dNTPsT43’

5’外切酶DNA酶切片斷T45’

3’聚合酶5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

內(nèi)切酶切無dNTPs酶切中間產(chǎn)生兩個(gè)末端標(biāo)記加入某種32P-dNTP和dNTPs73a.放射性標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)制作簡(jiǎn)單、高比放射性、放射自顯影效果好。缺點(diǎn)半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、對(duì)人體有害、要求在專門實(shí)驗(yàn)室操作。a.放射性標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)74b.非放射性標(biāo)記i）生物素（biotin）標(biāo)記：又稱維生素H。結(jié)構(gòu)：CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH可以與dNTP?；Y(jié)合成為生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。也可以被生物素連接酶（biotinligase）催化與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。b.非放射性標(biāo)記i）生物素（biotin）標(biāo)記：75純化的DNA片段DNaseI制造單鏈缺口DNAPolI進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)移生物素-dTTP和dNTPs

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

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生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口轉(zhuǎn)移法將生物素?fù)饺隓NA探針中純化的DNA片段DNaseI制造單鏈缺口DNAPolI進(jìn)行缺76光促生物素標(biāo)記生物素連接臂光敏基因探針序列探針序列生物素連接臂光敏基因+光照光促生物素標(biāo)記生物素連接臂光敏基因探針序列探針序列生物素連接77ii）地高辛標(biāo)記可以與dNTP連接成地高辛-dUTP等，參入DNA合成過程。形成地高辛標(biāo)記的DNA探針。地高辛的結(jié)合物是抗地高辛抗體。生物素和地高辛標(biāo)記的探針有試劑盒(kit)。ii）地高辛標(biāo)記可以與dNTP連接成地高辛-dUTP等，參入78圖試劑盒(kit)圖試劑盒(kit)79iii）偶聯(lián)酶及其底物常用的兩種酶：辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）酶的作用：催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過程中發(fā)出熒光（或生成有色的產(chǎn)物）。iii）偶聯(lián)酶及其底物常用的兩種酶：80圖化學(xué)發(fā)光底物圖化學(xué)發(fā)光底物81圖HRPO和AP的顯色反應(yīng)底物圖HRPO和AP的顯色反應(yīng)底物82HRPO和AP的顯色反應(yīng)底物HRPO和AP的顯色反應(yīng)底物83發(fā)光反應(yīng)機(jī)理發(fā)光反應(yīng)機(jī)理84iv）用非放射性標(biāo)記探針檢測(cè)原理探針DNA用生物素或地高辛標(biāo)記。親和素或地高辛抗體與酶偶聯(lián)。酶催化一個(gè)發(fā)光或顯色反應(yīng)。親和素或地高辛抗體與生物素或地高辛結(jié)合。iv）用非放射性標(biāo)記探針檢測(cè)原理探針DNA用生物素或地高辛標(biāo)85圖非放射性標(biāo)記探針檢測(cè)原理*生物素探針序列待測(cè)基因親和素酶底物中間產(chǎn)物產(chǎn)物發(fā)光圖非放射性標(biāo)記探針檢測(cè)原理*生物素探針序列待測(cè)基因親和素酶86核酸探針雜交篩選法的缺點(diǎn)只檢測(cè)是否有外源DNA插入，而不論該DNA是否表達(dá)出產(chǎn)物。核酸探針雜交篩選法的缺點(diǎn)只檢測(cè)是否有外源DNA插入，而不論該874.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的。（2）結(jié)構(gòu)由兩個(gè)亞基組