3-4-苯基磺酰胺苯甲酰-2h-1-苯并吡喃-2-酮母核結(jié)構(gòu)化合物yg-18的降糖作用及安全性評價

3-4-苯基磺酰胺苯甲酰-2h-1-苯并吡喃-2-酮母核結(jié)構(gòu)化合物yg-18的降糖作用及安全性評價

糖尿病是一種常見的慢性顱內(nèi)疾病，以高血糖為主要臨床特征。國際糖尿病聯(lián)盟的數(shù)據(jù)顯示，2015年全球糖尿病患病率為8.8%，預(yù)計2040年成人糖尿病患病率將上升到10.4%α-葡萄糖苷酶抑制劑可以抑制小腸刷狀緣上的α-葡萄糖苷酶對碳水化合物的轉(zhuǎn)化，從而延緩葡萄糖吸收，降低餐后血糖，在全球被廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的一線治療根據(jù)前期報道1材料表面1.1糖、糖、甘油、在阿拉丁生物化工和聚氧乙烯社會油試劑廠YG-18（沈陽藥科大學(xué)藥物化學(xué)教研室，純度≥98.0%）；阿卡波糖（艾覽化工科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；聚氧乙烯蓖麻油EL、甘油（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；蔗糖、葡萄糖等試劑均為分析純。1.2醫(yī)療器材、設(shè)備OneTouchUltraVue血糖儀[強生（中國）醫(yī)療器材有限公司]；SQP電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；D3024R離心機（大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司）；體重秤（慈溪市天東衡器廠）；恒溫超聲儀（上海柯祁儀器設(shè)備有限公司）。1.3fps小鼠模型SPF級ICR小鼠（22～24g),SPF級KM小鼠（22～24g）[遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2020-0001]。2方法2.1灌胃蔗糖的給藥小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后，ICR小鼠48只，隨機分為正常組、陽性藥物阿卡波糖組（Acar,9.6mg·kg禁食不禁水12h后，平行設(shè)置的兩組小鼠分別灌胃給予蔗糖（4.0g·kg2.2-葡萄糖苷酶共結(jié)晶的對接實驗利用Chemdraw19.0繪制出阿卡波糖與YG-18的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使用Chem3D19.0將其轉(zhuǎn)變?yōu)?D結(jié)構(gòu)，并對其進行構(gòu)象的優(yōu)化。分子對接研究使用DiscoveryStudiov16.1進行。對接計算采用從PDB數(shù)據(jù)庫中獲得的α-葡萄糖苷酶與葡萄糖絡(luò)合物（PDB代碼：3A4A）的晶體結(jié)構(gòu)。去除蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中所有的結(jié)合水，并將所有的氫原子添進結(jié)構(gòu)中。該蛋白質(zhì)前期進行制備、優(yōu)化和能量最小化處理。以α-葡萄糖苷酶共結(jié)晶的活性結(jié)合位點設(shè)置配體對接的空間，采用拉馬克遺傳算法進行對接實驗。對接的多種結(jié)合結(jié)果中，選取了能量最低的構(gòu)象為本次實驗對藥物與酶抑制方式的預(yù)測構(gòu)象。最后，使用Pymol和DiscoveryStudiov16.1繪制藥物與酶結(jié)合方式構(gòu)象。2.3單次灌胃給藥和大鼠的急性毒性試驗根據(jù)OECD急性毒性實驗指導(dǎo)原則禁食不禁水12h后，空白對照組小鼠給予溶媒羧甲基纖維素鈉單次灌胃處理，給藥組單次灌胃給藥處理，每組序貫進行。給藥當日連續(xù)觀察4h，之后固定時間間隔觀察48h。如果組內(nèi)死亡小鼠數(shù)量大于半數(shù)，則降低下一組小鼠給藥劑量；如果組內(nèi)死亡小鼠數(shù)量小于半數(shù)，則提高下一組小鼠給藥劑量。每一組存活動物均觀察14d，后期死亡動物在統(tǒng)計時記為死亡。觀察結(jié)束后處死小鼠，解剖后觀察各組小鼠的器官的形態(tài)、顏色、質(zhì)地等有無明顯變化。2.4實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析使用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，分析模型選取單因素方差分析（one-wayANOVA),P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，實驗中的數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism8繪制作圖。3結(jié)果3.1蔗糖、葡萄糖負荷對血糖水平的影響為了驗證YG-18在體外降低餐后血糖的藥效和作用機制，選取正常ICR小鼠作為模型，單次給藥后，分別記錄蔗糖、葡萄糖負荷后的血糖水平的血糖值變化，觀察其對血糖的影響，結(jié)果見圖2。YG-18在7.23mg·kg由此可以證明，新型化合物YG-18的體內(nèi)降糖作用的靶點為α-葡萄糖苷酶，只能對非單糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖產(chǎn)生抑制作用，進而發(fā)揮降糖作用，而對直接攝入葡萄糖的血糖變化無法發(fā)揮作用。3.2酶結(jié)構(gòu)基因發(fā)生d本次實驗分別采用了3D與2D方式展示了藥物-酶的結(jié)合構(gòu)象，見圖3、4。圖3展示了α-葡萄糖苷酶-阿卡波糖之間的相互結(jié)合的3D與2D構(gòu)象，圖4展示了α-葡萄糖苷酶-YG-18相互結(jié)合的3D與2D構(gòu)象。結(jié)果顯示，阿卡波糖與酶結(jié)構(gòu)中GLN279、GLU411和ARG442等氨基酸殘基形成氫鍵，氫鍵也是其與酶結(jié)合的主要方式。YG-18可能會與酶結(jié)構(gòu)中的GLN279、ARG315、GLU411、ASN415和ARG442氨基酸殘基形成氫鍵；除氫鍵外，其可能還與ASP69、ASP215、GLU277氨基酸殘基形成范德華力。YG-18展現(xiàn)出的α-葡萄糖苷酶抑制活性可能與這樣的結(jié)合方式有關(guān)，且兩種藥物共同結(jié)合的ASP69、GLU277、GLN279、GLU411、ARG442等氨基酸殘基可能為抑制活性的關(guān)鍵氨基酸。3.3小鼠器官形態(tài)變化OECD指導(dǎo)原則下YG-18單次給藥的序列劑量中，未能得出該藥物的LD在實驗結(jié)束后對所有小鼠進行頸椎脫臼處死，解剖后觀察，發(fā)現(xiàn)各組小鼠除有2只存在腸道梗阻外，其余小鼠器官的形態(tài)、顏色、質(zhì)地都未發(fā)現(xiàn)顯著異常。根據(jù)小鼠發(fā)生腹瀉的毒性反應(yīng)推測，該藥物的毒性反應(yīng)主要是通過α-葡萄糖苷酶導(dǎo)致碳水化合物吸收緩慢，從而導(dǎo)致腹瀉。4藥物共結(jié)晶蛋白模型在本次研究中，化合物YG-18降低了蔗糖負荷后正常ICR小鼠的血糖峰值，并明顯降低了負荷2h內(nèi)的血糖濃度-時間曲線下面積。由此可見，YG-18雖然對于血糖峰值的影響不如陽性對照藥阿卡波糖，但是在1h時的血糖可以控制在與阿卡波糖相同的水平，且2h內(nèi)的血糖濃度-時間曲線下面積顯著下降。在葡萄糖負荷后，阿卡波糖和YG-18組的血糖均未下降。根據(jù)α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用特點，這證明YG-18是通過抑制小腸刷狀緣上的α-葡萄糖苷酶起到降血糖作用的。本研究利用α-葡萄糖苷酶共結(jié)晶蛋白模型分析了YG-18與α-葡萄糖苷酶相互作用的潛在機制，發(fā)現(xiàn)YG-18主要通過氫鍵、范德華力、π-陰/陽離子、π-π相互作用與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，而阿卡波糖中主要的相互作用只有氫鍵和范德華力。兩種藥物通過不同結(jié)合作用共同抑制的氨基酸殘基主要有ASP69、GLU277、GLN279、GLU411、ARG442等，說明這些氨基酸殘基可能是藥物對α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生抑制作用的關(guān)鍵氨基酸。在急性經(jīng)口毒實驗中，雖然本次實驗未能得出該YG-18的LD在合成工藝方面看來，目前，已上市的α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖的工業(yè)合成途徑主要為游動放線菌（Actinoplanesspp.）發(fā)酵生產(chǎn)有研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制劑不僅有降糖