六α淀粉酶酶學性質測定II改

六、α-淀粉酶酶學性質測定II

（米氏常數Km值的測定)

1.目的意義

由LeonorMichaelis和MaudMenten在1913年提出的米氏方程（Michaelis-MentenEquation）是酶學中表示整個反應中底物濃度和反應速度關系的、表示一個酶促反應的起始速度V與底物濃度[S]關系的方程。

米氏方程形式如下所示：其中，Vmax表示酶被底物飽和時的反應速度，Km值稱為米氏常數，是酶促反應速度V為最大酶促反應速度值一半時的底物濃度,即V=1/2Vmax時,Km=[S]

。在酶促反應中，底物在低濃度情況下，反應相對于底物是一級反應（firstorderreaction）；而當底物濃度處于中間范圍時，反應（相對于底物）是混合級反應（mixedorderreaction）；當底物濃度增加時，反應由一級反應向零級反應（zeroorderreaction）過渡；當底物濃度[S]逐漸增大時，速度V相對于[S]的曲線為一雙曲線。下圖為米氏方程的模擬作圖：米氏常數的意義由米氏方程可知，當反應速度等于最大反應速度一半時,即V=1/2Vmax時,Km=[S]。上式表示,米氏常數是反應速度為最大值的一半時的底物濃度。因此,米氏常數的單位為mol/L(在本實驗中單位為g/L)。不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個重要的特征物理常數。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的Km值。Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。通過Km值的測定，可鑒定酶的各種底物，Km值最小者為酶最佳底物，即天然底物。2.實驗原理底物濃度對酶促反應的影響在酶濃度、pH、溫度等條件不變的情況下研究底物濃度和反應速度的關系。如右圖所示：在低底物濃度時,反應速度與底物濃度成正比，表現為一級反應特征。當底物濃度達到一定值，幾乎所有的酶都與底物結合后，反應速度達到最大值（Vmax），此時再增加底物濃度，反應速度不再增加，表現為零級反應。

酶促反應中的米氏常數的測定和Vmax的測定有多種方法。比如固定反應中的酶濃度，然后測試幾種不同底物濃度下的起始速度，即可獲得Km和Vmax值。但直接從起始速度對底物濃度的圖中確定Km或Vmax值是很困難的，因為曲線接近Vmax時是個漸進過程。因此，通常情況下，我們都是通過米氏方程的雙倒數形式來測定，即Lineweaver-Burkplot，也可稱為雙倒數方程(double-reciprocalplot)：

用1/V對1/[S]作圖，即可得到一條直線，該直線在Y軸的截距即為1/Vmax，在X軸上的截距即為1/Km的絕對值，斜率為Km/Vmax。如圖所示：Km=-1/x3.儀器設備3.1試劑10mg/ml可溶性淀粉1500ml0.005%碘液2000ml0.25M醋酸溶液0.4MpH6.0醋酸緩沖液3.2器材15ml大試管20支1ml移液管2支5ml移液管2支10ml移液管2支200ml燒杯2個100ml燒杯2個玻棒1支雙蒸水1瓶（50ml）比色皿1套（4個）、玻璃皿1套、洗瓶1個吸耳球1個記號筆1支試管架2個200μl-1000μl、20μl-200μl、0.5μl-10μl移液器各1支；小號、中號、大號槍頭各1盒（需滅菌）旋渦混合器1套（置于每組桌上）4.實驗方法取一定量的酶（稀釋為10-6倍）；加入各種不同濃度的底物（如表所示）；在一定時間內測定產物的量（30min）；建立x，y軸，作圖，建立回歸方程；在Y=0時，求其x值（即[S]）→Km；4.1測定—取12支試管，分別標記，按照下表操作。編號123456789底物濃度[S]（mg·mL-1）46810121416182010mg/ml淀粉溶液（ml）0.40.60.81.01.21.41.61.82.0醋酸緩沖液（ml）2.62.42.22.01.81.61.41.21.0預熱40℃5minα-淀粉酶（ml）1反應時間30min反應終止各管加入0.25M醋酸10ml顯色反應取1ml反應液加入預先加入試管中的0.005%碘液中，振蕩混勻A(OD700nm)1/A1/[S](mg·ml-1)

注意：每組（不同底物濃度）都需要設置D0為對照，計算出U值。

chenhuicheng@4.2數據處理各管在700nm測定OD700nm值（注意，比色皿務必洗凈擦干）。由于光密度（OD700nm）與顯色，顯色與底物濃度成正比，反應時間均為30min。計算1/V，以1/V為縱坐標作圖。由于測定所用單位為mg·mL-1換算為Km