用巢式PCR擴(kuò)增ZFY基因產(chǎn)前診斷胎兒性別

用巢式PCR擴(kuò)增ZFY基因產(chǎn)前診斷胎兒性別近年來(lái)的研究表明，Y染色體上鋅指結(jié)構(gòu)基因(zinc-finger-Ygene,ZFY)是繼SRY之后又一與性分化有關(guān)的單拷貝基因，并與精子的發(fā)生有關(guān)nt。為此，我們利用巢式PCR技術(shù)，以ZFY作為檢測(cè)指標(biāo)，參考有關(guān)文獻(xiàn)自行設(shè)計(jì)內(nèi)外兩側(cè)兩對(duì)巢式PCR引物⑶，對(duì)絨毛、羊水和孕婦外周血標(biāo)本進(jìn)行ZFY基因的特異擴(kuò)增，初步建立了一種用PCR技術(shù)產(chǎn)前檢測(cè)胎兒性別的方法。1材料與方法1.1標(biāo)本取正常男、女外周血各20份，每份0.5ml。孕10?32周婦女外周血31份，每份6ml，流產(chǎn)胎兒絨毛45份，羊水40份，均為本科收治患者。分別采用絨毛染色體核型、羊水染色體核型、引產(chǎn)和出生胎兒生殖器檢查確定胎兒實(shí)際性別。1.2模板DNA的提取1.2.1外周血細(xì)胞DNA的提取(1)將6mlEDTA抗凝血離心5000r/minX3分鐘后棄血清；(2)加入等體積破紅細(xì)胞液〔0.32mol/L蔗糖，10mmol/LTris-HCl(pH7.5),5mmol/LCaCl，1%trito2nX-100〕充分裂解紅細(xì)胞，離心5000r/minX3分鐘，重復(fù)2次；(3)沉淀物加100pl白細(xì)胞裂解液〔50mmol/LKCl,10mmol/LTris-HCl(pH8.3)，1.5mmol/LMgC^,0.1%明膠，0.5%NP40〕混勻后加入蛋白酶K5pl(30mg/ml)，置50°C消化2小時(shí)，95°C加熱10分鐘，置-20C保存?zhèn)錂z。1.2.2絨毛及羊水DNA提取參考文獻(xiàn)［4］的方法，所有標(biāo)本均進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，隨機(jī)取20例絨毛標(biāo)本進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。1.3ZFY基因的引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增根據(jù)ZFY全基因序列，G+C比例和次級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的巢式PCR實(shí)驗(yàn)用的外側(cè)特異性引物選在ZFY基因區(qū)2125?2145位及2458?2478位，引物序列分別為Pl：5‘-CCATTTGTTCTAAGTCGCCA-3‘，P2：5‘-CTTCAAGGCCAACATCAGCTG-3‘，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)354bp。內(nèi)側(cè)特異性引物選在ZFY基因區(qū)2149?2169位及2435?2455位，引物序列分別為：P3：5‘-CTCTCAGT-TCACACAAAGG-3‘，P4：5‘-GCTTGTA-GACACACTGTTAGG-3‘，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)307bp。上述引物經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬核酸雜交軟件輔助分析與美國(guó)GeneBank基因數(shù)據(jù)庫(kù)比較表明，與人體基因組和其它生物基因組無(wú)明顯同源性，引物堿基與靶基因一致，自身無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，無(wú)互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。PCR條件參數(shù)見本實(shí)驗(yàn)室已建立的HPV-PCR試驗(yàn)⑸。1.4斑點(diǎn)雜交樣品配制：DNA液20pl，0.4mol/LNaOH,20pl,20XSCC40》l,混勻后加樣于硝酸纖維素薄膜上，使用PCR擴(kuò)增片段內(nèi)一段特異性寡核苷酸作探針，探針序列為：TTCATACAAA-AGACTATCCTCATCGGTG，探針標(biāo)記采用隨機(jī)引物法，雜交步驟參見文獻(xiàn)［4］的方法。2結(jié)果2.1擴(kuò)增片段的序列分析用1.5%低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收354bp和307bp擴(kuò)增片段，經(jīng)Sephaglasbandprepkit抽提后，乙醇沉淀干燥，參照SequiThermTM循環(huán)測(cè)序試劑盒說(shuō)明進(jìn)行Sanger雙脫氧終止法“直接序列測(cè)定”⑹，測(cè)序引物為PCR引物。測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)SephedexG-75離心層析柱純化后，在Bio-radDNA序列儀上，以6%聚丙烯酰胺凝膠，50°C50W電泳，-20°C放射自顯影24小時(shí)。測(cè)序的自顯影結(jié)果如圖1所示。圖1ZFY基因PCR產(chǎn)物純化后直接核酸序列分析的放射自顯影圖結(jié)果所測(cè)得序列與文獻(xiàn)報(bào)道完全一致。ZFY基因354bp及307bp擴(kuò)增片段核酸序列：CCATTTGTTC-IAA^TWOCATATI-??！■? CTg匹取‘mu畑AAGGATUTT-DCATTTAGGT1GTAAGAGATGTAG-AAAGGGATTTAGGCAACAAAATG-AGCTTAAAAAGC^TA1GAACA.CAC-ACAGTGGCAGGZAGTATA1CACT-GTGAGTACTGTGAGTATAGCACTA-CAGATGCCTCAGGCTTTAAACGGC-ACGTTATTTCCATTCATACAAAAG-ACTATCCTCATCGGTGT-GAGTACT-GCAAGAAAGGCTTCCG-AAGACCTT-CAGAAAAGAACCAGCACATAATGA-gacaccataaa^aagttgctctgg-GATTGTCACACAC.\T<JTTCGTTCG^TCGACTACAACCGGAACTTC（虛線為巢式PCR外側(cè)1對(duì)引物，實(shí)線為巢式PCR內(nèi)側(cè)1對(duì)引物）2.2PCR特異性及敏感性實(shí)驗(yàn)20例正常男性用內(nèi)外側(cè)引物均有擴(kuò)增帶，而女性均無(wú)擴(kuò)增條帶；45例絨毛標(biāo)本中，21例有特異性擴(kuò)增帶，有無(wú)擴(kuò)增帶的標(biāo)本之比為1：1.143，接近實(shí)際出生胎兒的性別之比；40例羊水標(biāo)本中，18例判定為男性，隨后與臨床實(shí)際出生的胎兒性別對(duì)照均符合。以男、女混合DNA為模板，加入的模板量依次為：男性DNA/女性DNA：0.5》g/0.5pg、0.25》g/0.5pg、0.025》g/0.5pg、0.01》g/0.5|Jg、0.005》g/0.5》g,巢式PCR擴(kuò)增均顯示了特異性307bp擴(kuò)增帶。2.3孕婦外周血胎兒細(xì)胞的檢測(cè)31例孕10?32周婦女外周血及羊水PCR檢測(cè)，其中男性胎兒19例，女性胎兒12例。12例女性胎兒經(jīng)外周血直接巢式PCR分析均未檢出ZFY基因。對(duì)19例懷男性胎兒婦女同一個(gè)體不同孕周連續(xù)采血發(fā)現(xiàn)，隨著孕齡的增加，胎兒ZFY基因的檢出率逐漸升高，且當(dāng)在某一孕周檢出胎兒ZFY基因后，以后各孕周均可檢出ZFY基因。31例用孕母外周血胎兒細(xì)胞檢出ZFY基因的孕周及例數(shù)分別為，孕10周6例，孕11周11例，孕12周15例，孕13周15例，孕14周16例，孕15周17例，孕16周18例，孕17周18例，有1例直至孕32周仍未檢出。因此，31例男女胎兒性別鑒定的總準(zhǔn)確率為96.8%(30/31)2.4斑點(diǎn)雜交結(jié)果與PCR結(jié)果相比較，二者完全一致。3討論SRY是位于Y染色體短臂1A1A區(qū)的睪丸決定子，已有文獻(xiàn)報(bào)道用Y染色體特異性DNA片段作為引物進(jìn)行胎兒性別的鑒定，以及用相應(yīng)引物進(jìn)行X連鎖遺傳病的檢出⑵。但這種直接擴(kuò)增母血中胎兒細(xì)胞DNA進(jìn)行產(chǎn)前診斷常出現(xiàn)一些假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。究其原因，除各種情況導(dǎo)致的污染、方法條件不當(dāng)外，母血中胎兒細(xì)胞DNA的含量達(dá)不到一般擴(kuò)增條件所要求的最低模板量也是重要原因。為了在母血中富集到足夠數(shù)量的胎兒細(xì)胞以提高檢出率，馬旭等［7，8］利用密度梯度離心結(jié)合CD71單抗流式細(xì)胞術(shù)對(duì)多核細(xì)胞及富集后低密度細(xì)胞中的胎兒細(xì)胞SRY基因的診斷率可達(dá)93.2%,但步驟繁雜費(fèi)時(shí)，常需特殊儀器，且因人類Y染色體上一些重復(fù)順序與常染色體存在一定程度上的同源性［7］，易出現(xiàn)假陽(yáng)性干擾。ZFY基因是Ao等［1］首次報(bào)道的性別決定基因，位于Y染色體短臂的Ucdo43區(qū)，目前越來(lái)越多的證據(jù)表明ZFY是繼SRY之后又一睪丸決定子(TDF)候選基因之一。我們使用計(jì)算機(jī)模擬核酸雜交軟件程序，明顯提高了ZFY基因引物設(shè)計(jì)的特異性和實(shí)驗(yàn)的成功率，節(jié)省了人工選擇引物的時(shí)間，并避免了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。進(jìn)一步采用巢式PCR以提高檢測(cè)的特異性和靈敏度，這種ZFY檢測(cè)系統(tǒng)可檢出IX105女性細(xì)胞中的1個(gè)男性細(xì)胞，6ml孕母外周血大約有1?6個(gè)胎兒細(xì)胞存在，足以滿足PCR模板量的要求。對(duì)擴(kuò)增片段的序列分析及40例正常男、女外周血DNA標(biāo)本擴(kuò)增，結(jié)果表明了其特異性很強(qiáng)。在45例絨毛DNA擴(kuò)增陽(yáng)性與陰性之比為1：1.143,此比例也接近實(shí)際自然出生胎兒性別之比。敏感性實(shí)驗(yàn)也表明，當(dāng)將男、女性DNA混合時(shí)，當(dāng)模板中只含有1%男性DNA時(shí)（此時(shí)相當(dāng)于男性細(xì)胞數(shù)500余個(gè)），仍可得到理想的擴(kuò)增帶。19例懷男性胎兒的婦女外周血中有18例檢出了ZFY基因，在對(duì)12例懷女性胎兒的婦女外周血進(jìn)行ZFY基因檢測(cè)時(shí)，未見假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，提示該法對(duì)孕母外周血胎兒性別鑒定是可行的。對(duì)于本研究出現(xiàn)的1例假陰性結(jié)果，推測(cè)可能與孕母外周血中尚未出現(xiàn)胎兒細(xì)胞或其含量未達(dá)到檢測(cè)水平有關(guān)，尚需連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察以明確胎兒細(xì)胞最晚進(jìn)入母血循環(huán)的時(shí)間并注意個(gè)體差異，從而使陰性結(jié)果的判斷更為可靠。本課題由山東省自然科學(xué)基金（9648）資助作者單位：250031濟(jì)南，濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科（周寧、陳君、黃海士、克丙申）；山東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室（于萍），附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（江森）參考文獻(xiàn)AoA,EricksonRP,WinstonRM,etal.TranscriptionofpaternalYlinkedgenesinthehumanzygoteasearlyastheprenudeatestage.Zygote,1994,2（4）：281-287.ReynoldsR,VarlaroJ.GenderdeterminationofforensicsamplesusingPCRamplificationofZFY/ZFXgenesequence.JForensciSci,1996,41（2）：279286.KaoSM,TangGC,HsiehTT,etal.AnalysisofperipheralbloodofpregnancywomenforthepresenceoffetalYchromosome-specificZFYgenedeoxyribonucleicacidsequence.AmJObstetGynecol,1992,166(2):1013-1019.SambrookJ,FrotschEF,ManiatisT.Molecularcloning:Alaboratorymanual.2nded.NewYork:ColdSpringHarborLaboratory,1989,463-472.周寧，于萍，徐增祥.宮頸癌組織中乳頭瘤病毒感染及抑癌基因p53突變的