脫落細(xì)胞基本技術(shù)-課件

脫落細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)

---脫落細(xì)胞學(xué)基本技術(shù)

戚永孝脫落細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)

---脫落細(xì)胞學(xué)基本技術(shù)

戚永孝概述

脫落細(xì)胞學(xué)技術(shù)是本課程的重要內(nèi)容。脫落細(xì)胞檢驗(yàn)者除要熟練掌握細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征外，還必須掌握各項(xiàng)操作技術(shù)和觀察方法。包括標(biāo)本的采集、制片、固定、染色、鏡下觀察以及書寫診斷報(bào)告等。概述脫落細(xì)胞學(xué)技術(shù)是本課程的重要內(nèi)容。脫落細(xì)胞檢第一節(jié)標(biāo)本采集標(biāo)本采集是脫落細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)的基礎(chǔ)，也是細(xì)胞學(xué)診斷成敗的關(guān)鍵之一。一、標(biāo)本采集的原則正確選擇采集部位，盡可能自病變區(qū)直接采取細(xì)胞。采集的標(biāo)本必須保持新鮮，以免細(xì)胞自溶或腐敗。盡可能避免干擾物，如血液、粘液等混入標(biāo)本內(nèi)。采集方法應(yīng)簡(jiǎn)便，病人少受痛苫，且不致引起嚴(yán)重的并發(fā)癥或促使腫瘤擴(kuò)散。第一節(jié)標(biāo)本采集標(biāo)本采集是脫落細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)的基礎(chǔ)，也是細(xì)胞學(xué)二、幾種常用的標(biāo)本采集法（一）直視采集法直視下采集標(biāo)本的部位有外陰、陰道、宮頸、陰道穹窿、鼻腔、鼻咽、眼結(jié)膜、皮膚、口腔及肛管等，可用刮片、吸管吸取、擦拭或刷洗。此外，用帶有微型尼龍刷的纖維內(nèi)窺鏡在食管、胃、氣管及肺內(nèi)支氣管部位的病灶處直接刷取細(xì)胞涂片也屬于直視采集法。二、幾種常用的標(biāo)本采集法（一）直視采集法（二）自然分泌液的收集法自然分泌液包括痰液、尿液、前列腺液、乳頭溢液等。

1．痰液涂片檢查因痰液為支氣管等呼吸道的分泌物，對(duì)支氣管肺癌和呼吸道的疾病診斷具有重要價(jià)值。2．尿液涂片檢查泌尿道的上皮、炎癥細(xì)胞及惡性腫瘤細(xì)胞等均可在腔內(nèi)脫落，隨尿液排出，因此，收集尿液細(xì)胞作檢查，對(duì)泌尿道腫痛及某些疾病診斷有一定意義。3．前列腺液涂片檢查采用前列腺按摩法取得分泌物作涂片，對(duì)前列腺炎及癌的診斷有一定價(jià)值。4．乳頭溢液涂片檢查用于診斷乳腺病。（二）自然分泌液的收集法（三）灌洗法此法是通過向空腔器官灌注一定量生理鹽水等液體，運(yùn)用沖洗、振動(dòng)、揉捏等方法，使空腔器官中的某些細(xì)胞包括癌細(xì)胞脫落于其中，然后將灌洗液取出，經(jīng)適當(dāng)處理后檢查。（四）摩擦法此法主要采用摩擦工具，摩揉病變區(qū)的粘膜直接涂片。（三）灌洗法（五）穿刺針吸法細(xì)針吸取細(xì)胞學(xué)又名細(xì)針吸取或針吸細(xì)胞學(xué)，是用細(xì)針穿刺病灶，吸取少許細(xì)胞成分做涂片檢查的—種診斷細(xì)胞學(xué)。所吸取的細(xì)胞是人為的“脫落”細(xì)胞，有時(shí)可同時(shí)吸出少許組織。此法是細(xì)胞學(xué)診斷中重要的標(biāo)本采集方法之一。（五）穿刺針吸法細(xì)針吸取細(xì)胞學(xué)又名細(xì)針吸取或針吸細(xì)胞學(xué)，是用1．細(xì)針吸取細(xì)胞學(xué)穿刺部位的選擇正確選擇穿刺部位是一個(gè)十分重要的問題，實(shí)踐證明，對(duì)腫塊穿刺部位的選擇應(yīng)參考下列原則進(jìn)行：（1）腫塊暴露較好，操作較方便。（2）懷疑原發(fā)性病灶的腫塊。（3）淋巴結(jié)或腫塊較大、較硬，無液化、壞死或繼發(fā)感染者。（4）穿刺點(diǎn)應(yīng)避開體表血管、炎癥及潰瘍等部位，且腫物鄰近無重要神經(jīng)、血管、臟器。1．細(xì)針吸取細(xì)胞學(xué)穿刺部位的選擇正確選擇穿刺部位是一個(gè)十2．細(xì)針吸取細(xì)胞學(xué)的優(yōu)點(diǎn)（1）穿刺抽取操作簡(jiǎn)單易行。（2）操作安全，極少發(fā)生副作用或意外，病人痛苦小，不需切開，無明顯瘢痕形成。（3）取樣迅速、制片、診斷亦較快．一般僅需1h左右．可用于手術(shù)中的快速診斷。（4）應(yīng)用范圍，幾乎適用于任何部位。穿刺檢查可到達(dá)人體不同組織器官的病灶，并可同時(shí)對(duì)多個(gè)腫塊進(jìn)行穿刺提高了陽(yáng)性率及準(zhǔn)確率。（5）可對(duì)同—腫物進(jìn)行多次穿刺，重復(fù)檢在，有利于動(dòng)態(tài)觀察腫塊的生長(zhǎng)、發(fā)展或腫塊放療、化療的療效。2．細(xì)針吸取細(xì)胞學(xué)的優(yōu)點(diǎn)第二節(jié)涂片制作良好、適宜的涂片是脫落細(xì)胞學(xué)能否正確診斷的重要條件之一。一、涂片制備的原則：第一，在標(biāo)本制片之前，要把材料準(zhǔn)備好，如載玻片、推片、蓋玻片、滴管等，各種用品均要求清潔、干燥，載玻片要求表面光滑，無油漬、無劃痕及破損等。第二，標(biāo)本采集后，應(yīng)盡快做出處理、以最快的速度制片，否則標(biāo)本凝固或pH值改變，引起細(xì)胞形態(tài)變化或自溶、腐敗等，影響診斷結(jié)果。第三，制片時(shí)操作應(yīng)輕巧，以免損傷細(xì)胞。涂片的厚薄應(yīng)適宜，太厚則細(xì)胞過多、重疊．不易染色且細(xì)胞形態(tài)不易辨別；太薄則細(xì)胞稀少，影響陽(yáng)性的檢出率。一張好的涂片應(yīng)是分布均勻、厚薄適宜，涂片呈舌狀，分為頭、體、尾三部分，鏡下各個(gè)視野均有細(xì)胞成分，紅細(xì)胞無明顯重疊現(xiàn)象。第二節(jié)涂片制作良好、適宜的涂片是脫落細(xì)胞學(xué)能否正確診斷的重第四，若液體標(biāo)本內(nèi)缺乏蛋白質(zhì)時(shí)，在制片過程戶，可先在玻片上涂上粘附劑（如甘油血清、甘油蛋白、血清等）或直接在液體標(biāo)本中加入粘附劑，以防標(biāo)本在固定及染色過程中脫落。第五，應(yīng)采取標(biāo)本的各部分制片，特別是對(duì)于組織鉗取物及較大組織的印片，并盡可能選取具有代表件的部位制片，以減少漏診，提高陽(yáng)性的檢出率。第六．標(biāo)本一般應(yīng)制片4張以上，并逐張固定、染色及鏡檢，以防遺漏。第七，涂片應(yīng)統(tǒng)一進(jìn)行編號(hào)、登記，以免混淆。第四，若液體標(biāo)本內(nèi)缺乏蛋白質(zhì)時(shí)，在制片過程戶，可先在玻片上涂二、涂片的制備方法

（1）推片法：用于稀薄的標(biāo)本，如血液，胸、腹水等。取離心后標(biāo)本一小滴滴在玻片偏右側(cè)端，用推片用30度夾角將玻片上檢液輕輕向左推。

（2）涂抹法：適用于稍稠的檢液，如鼻咽部標(biāo)本。用竹棉簽在玻片上涂布，由玻片中心經(jīng)順時(shí)針方向外轉(zhuǎn)圈涂抹；或從玻片一端開始平行涂抹，涂抹要均勻，不宜重復(fù)。

（3）壓拉涂片法：將標(biāo)本夾于橫豎交叉的兩張玻片之間，然后移動(dòng)兩張玻片，使之重疊，再邊壓邊拉，獲得兩張涂片。該法適用于較粘稠標(biāo)本，如痰液。二、涂片的制備方法（1）推片法：用于稀薄的標(biāo)本，如血液（4）吸管推片法：用吸和將標(biāo)本滴在玻片一端，然后將滴管前端平行置于標(biāo)本滴上，平行向另一端均速移動(dòng)滴管即可推出均勻薄膜。此法亦適用于胸、腹水標(biāo)本。

（5）噴射法：用配細(xì)針頭的注射器將標(biāo)本從左至右反復(fù)均勻地噴射在玻片上，此法適用于各種吸取的液體標(biāo)本。

（6）印片法：將切取的病變組織用手術(shù)切開，立即將切面平放在玻片上，輕輕按印。此方法為活體組織檢查的輔助方法。（4）吸管推片法：用吸和將標(biāo)本滴在玻片一端，然后將滴管前端平第三節(jié)涂片的固定固定的目的是保持細(xì)胞自然形態(tài)，防止細(xì)胞自溶和細(xì)菌所致的腐敗；固定液能沉淀和凝固細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和破壞細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶，使細(xì)胞不但保持自然形態(tài)，而且結(jié)構(gòu)清晰，易于著色。因此標(biāo)本愈新鮮，固定愈及時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)愈清晰，染色效果愈好。第三節(jié)涂片的固定固定的目的是保持細(xì)胞自然形態(tài)，防止細(xì)胞自1．固定液：細(xì)胞學(xué)檢查常用的固定液有下列三種：第一種乙醚酒清固定液：該固定液滲透明性較強(qiáng)，固定效果好適用于于一般細(xì)胞學(xué)常規(guī)染色；二種是氯仿酒精固定液：又稱卡諾氏固定液。其優(yōu)點(diǎn)同上；第三種95%酒精固定液：適用于大規(guī)模防癌普查。制備簡(jiǎn)單。但滲透作用稍差。

1．固定液：細(xì)胞學(xué)檢查常用的固定液有下列三種：第一種乙醚酒清2．固定方法

（1）帶濕固定：涂片后未待標(biāo)本干燥即行固定的方法稱帶濕因定。此法因定細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，染色新鮮。適用于巴氏或HE染色。痰液、陰道分泌物及食管拉網(wǎng)涂片等常任常用此方法。

（2）干燥因定：涂片后未待其自然干燥，再行固定。適用于稀薄標(biāo)本如尿液、胃沖洗液等，也適用于于瑞特染色和姬姆薩染色。

3．固定時(shí)間：一般為15-30min。含粘液較多標(biāo)本，如痰液、陰道分泌物、食管拉網(wǎng)等因定時(shí)間在適當(dāng)延長(zhǎng)；尿液、胸、腹水等涂片不含粘液，固定時(shí)間可酌情縮短。2．固定方法

（1）帶濕固定：涂片后未待標(biāo)本干燥即行固定的第四節(jié)涂片的染色1．染色的目的和原理：染色的目的是借助于一種或多種染料，使組織和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)分別著不同的染色，這樣在顯微鏡下能清楚地觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，作出正確判斷。

組織細(xì)胞染色原理至今尚無滿意的解釋，可能是物理作用，也可能是化學(xué)作用，或者是兩者綜合作用的結(jié)果。

染色的物理作用是利用毛細(xì)管現(xiàn)象，滲透、吸收和吸附作用，使染料的色素顆粒牢固地進(jìn)入組織細(xì)胞，并使其顯色。

第四節(jié)涂片的染色1．染色的目的和原理：染色的目的是借助于一染色的化學(xué)作用是滲入組織細(xì)胞的染料與其相應(yīng)的物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生有色的化合物。

各染料都具有兩種性質(zhì)，即產(chǎn)生顏色；與組織形成親和力。這兩種性質(zhì)主要由發(fā)色基因和助色基因所產(chǎn)生的。

發(fā)色基團(tuán)：苯的衍生物具有可見光區(qū)吸收帶。這些衍生物的吸收帶與其價(jià)鍵的不穩(wěn)定性有關(guān)，如對(duì)苯二酚為無色，當(dāng)其氧化后失去兩個(gè)氫原子，它的分子或則變?yōu)橛悬S色的對(duì)醌，這種產(chǎn)生顏色的醌式環(huán)稱為發(fā)色基團(tuán)。若一種化合物含有幾個(gè)環(huán)，只要其中有一個(gè)醌式環(huán)就會(huì)發(fā)出顏色，稱此發(fā)色基團(tuán)為色原.

染色的化學(xué)作用是滲入組織細(xì)胞的染料與其相應(yīng)的物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng)，助色基團(tuán)：是一種能使化合物以生電離作用的輔助原子團(tuán)（酸堿性基團(tuán)）。它能使染色的色澤進(jìn)一步加深，并使其與被染色組織具有親和力。

助色基團(tuán)的性質(zhì)決定染料是酸性堿性。堿性染料具有堿性助色基團(tuán)，在溶酶中產(chǎn)生的帶色部分為帶正電荷的陽(yáng)離子，易與組織細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合而顯色。如細(xì)胞核內(nèi)的主要化學(xué)成分脫氧化核糖核酸易被蘇木素染成紫藍(lán)色，稱嗜堿性。酸性染料具有酸性助色基團(tuán)，在溶酶中產(chǎn)生帶色部分為陰離子，易與組織細(xì)胞內(nèi)帶正電荷部分結(jié)合而顯色，此性質(zhì)被稱為嗜酸性，如細(xì)胞漿內(nèi)成分為蛋白質(zhì)，易與伊紅或橘黃結(jié)合呈紅色或橘黃色。助色基團(tuán)：是一種能使化合物以生電離作用的輔助原子團(tuán)（酸堿性基2．常用染色方法：臨床日常工作中較為常用的染色方法有下列3種：

（1）巴氏染色法：本法染色特點(diǎn)是細(xì)胞具有多色性顏色，色彩鮮艷多彩。涂片染色的透明性好，胞質(zhì)顆粒分明，胞核結(jié)構(gòu)清晰，如鱗狀上皮過度角化細(xì)胞胞質(zhì)呈橘黃色；角化細(xì)胞顯粉紅色；而角化前細(xì)胞顯淺綠色或淺藍(lán)色，適用于上皮細(xì)胞染色或觀察陰道涂片中激素水平對(duì)上皮細(xì)胞的影響。此方法的缺點(diǎn)是染色程序比較復(fù)雜。

（2）蘇木精—伊紅（HE）染色法：該方法染色透明度好，核與胞質(zhì)對(duì)比鮮明。染色步驟簡(jiǎn)便，效果穩(wěn)定。適用于痰液涂片，異質(zhì)核呈紫藍(lán)色，胞質(zhì)淡玫瑰紅色，紅細(xì)胞呈淡朱紅色。

（3）瑞特—吉姆薩染色法；本方法多用于血液，骨髓細(xì)胞學(xué)檢查。胞質(zhì)內(nèi)顆粒與核安危質(zhì)結(jié)構(gòu)顯示較清晰。操作簡(jiǎn)便。2．常用染色方法：臨床日常工作中較為常用的染色方法有下列3種第五節(jié)涂片的觀察與診斷一、涂片觀察的方法為提高診斷率和防止造成差錯(cuò)，檢查涂片前必須嚴(yán)格核對(duì)涂片編號(hào)，了解送檢單上填寫的全部資料；閱片要全面、認(rèn)真、細(xì)心觀察。因涂片中細(xì)胞成分分布極為分散，所以顯微鏡觀察時(shí)必須按順序視全張涂片，用推進(jìn)器從左至右。自上而下移動(dòng)，仔細(xì)觀察每一個(gè)視野，歸后將蓋片邊緣亦做仔細(xì)檢查，防止漏診（圖20-1）。第五節(jié)涂片的觀察與診斷一、涂片觀察的方法圖20-1觀察切片的移動(dòng)法

A錯(cuò)誤的玻片移動(dòng)法B正確的玻片移動(dòng)法圖20-1觀察切片的移動(dòng)法涂片細(xì)胞學(xué)檢查十分重視低倍觀察，先宏觀涂片中各種細(xì)胞成分，發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞時(shí)，再轉(zhuǎn)換高倍視野，仔細(xì)觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)，明確性質(zhì)，做出正確診斷。涂片細(xì)胞學(xué)檢查十分重視低倍觀察，先宏觀涂片中各種細(xì)胞成分，發(fā)二、提高細(xì)胞學(xué)診斷率的要領(lǐng)（一）細(xì)胞學(xué)診斷的書寫方式細(xì)胞學(xué)檢查癌細(xì)胞的診斷方式分為直接法和分級(jí)法。1．直接法：根據(jù)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果，直接寫出關(guān)于疾病的診斷如痰抹片檢查結(jié)果為“支氣管鱗癌”。2．分級(jí)法：將涂片中細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞變化，用分級(jí)方式表示。它的優(yōu)點(diǎn)是能真實(shí)地反映細(xì)胞學(xué)所見。比較客觀。目前有三級(jí)、四級(jí)、和五級(jí)三種分類方法。五級(jí)分類法過于繁瑣，實(shí)際應(yīng)用中較難掌握。因此國(guó)內(nèi)仍常用三級(jí)或四級(jí)分類法，該兩種分類法較為簡(jiǎn)單明確，易于掌握，能夠更準(zhǔn)確地反映涂片的本質(zhì)。二、提高細(xì)胞學(xué)診斷率的要領(lǐng)（一）細(xì)胞學(xué)診斷的書寫方式（1）三級(jí)分類法：將細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果分為陰性，可疑和陽(yáng)性三級(jí)。Ⅰ級(jí)：陰性：無核異質(zhì)細(xì)胞，涂片中均為正常細(xì)胞或一般退變細(xì)胞。Ⅱ級(jí)：可疑。涂片中發(fā)現(xiàn)核異質(zhì)細(xì)胞，但不能肯定的是腫瘤細(xì)胞，應(yīng)重復(fù)送檢。Ⅲ級(jí)：陽(yáng)性。涂片中發(fā)現(xiàn)典型癌細(xì)胞，有時(shí)根據(jù)癌細(xì)胞形態(tài)特征及分布，初步進(jìn)行分類。（1）三級(jí)分類法：將細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果分為陰性，可疑和陽(yáng)性三級(jí)。（2）四級(jí)分類法：將細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果分為陰性、核異質(zhì)，可疑和陽(yáng)性四級(jí)。Ⅰ級(jí)：陰性。Ⅱ級(jí)：核異質(zhì)。涂片中發(fā)現(xiàn)少量核異質(zhì)細(xì)胞，由高度炎癥增生所致。Ⅲ級(jí)：可疑。涂片中見重度核異質(zhì)細(xì)胞，其形態(tài)基本符合惡性腫瘤細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，但數(shù)量過少，還不能完全排除癌前期病變或高度炎癥增生生的可能，建議臨床重復(fù)送檢。Ⅳ級(jí)：陽(yáng)性。（2）四級(jí)分類法：將細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果分為陰性、核異質(zhì)，可疑和陽(yáng)（3）五級(jí)分類法Ⅰ級(jí)：無核異質(zhì)細(xì)胞。Ⅱ級(jí)：少量輕度核異質(zhì)細(xì)胞，但無惡性證據(jù)。Ⅲ級(jí)：有較多重度核異質(zhì)細(xì)胞，但不能肯定為惡性。Ⅳ級(jí)：有大量重度核異質(zhì)細(xì)胞，但仍缺乏典型惡性腫瘤細(xì)胞的證據(jù)。Ⅴ級(jí)：發(fā)現(xiàn)典型惡性腫瘤細(xì)胞，根據(jù)其細(xì)胞形態(tài)，作出初步的分類。（3）五級(jí)分類法（二）提高細(xì)胞學(xué)診斷的要領(lǐng)1．熟練掌握病理學(xué)：脫落細(xì)胞來自組織，所以是病變組織的部分反映，具有踏實(shí)的病理學(xué)基礎(chǔ)，才能對(duì)千變?nèi)f化的脫落細(xì)胞形態(tài)作出正確的判斷。2．多思考、多比較：涂片中細(xì)胞成分，背景成分以及細(xì)胞變性程度等每例各不相同，閱片時(shí)要分析思考和比較，最好用涂片中某一背景成分，如淋巴細(xì)胞或紅細(xì)胞作標(biāo)本。3．密切結(jié)合臨床：多與臨床醫(yī)生聯(lián)系，了解臨床癥狀，化驗(yàn)及影像診斷結(jié)果，避免盲目性。4．認(rèn)識(shí)脫