分子生物學(xué)第十三章基因診斷

第十三章基因診斷和基因治療基因診斷基因蛋白質(zhì)性狀生化診斷基因診斷臨床診斷傳統(tǒng)的診斷程序

先要對(duì)病原物質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后再分析它的生理學(xué)特性

確定它到底是哪一類的病原物，是病毒、細(xì)菌，還是其他物質(zhì)

實(shí)踐證明:比較有效,檢測(cè)到病原微生物相對(duì)比較特異

診斷成本高、速度慢、效率低

如砂眼衣原體、朊病毒方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)顯微鏡鏡檢簡(jiǎn)單易行，可直接觀察到寄生蟲的形態(tài)速度慢，靈敏度低，對(duì)經(jīng)驗(yàn)水平要求高費(fèi)時(shí)費(fèi)工，無(wú)法辨別形態(tài)相近的寄生蟲體外培養(yǎng)、接種能檢測(cè)到活的寄生蟲，并可檢測(cè)感染性和感染程度速度慢、花費(fèi)高，寄生蟲可能難以進(jìn)行體外培養(yǎng)，且必須使用動(dòng)物材料抗體檢測(cè)簡(jiǎn)單、快速、能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化，可用于檢測(cè)大量的樣品無(wú)法區(qū)分活的寄生蟲與處在潛伏狀態(tài)的寄生蟲。有時(shí)會(huì)有非特異反應(yīng)發(fā)生DNA雜交及PCR快速靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化，可以分辨不同種的寄生蟲，不需要以前有寄生蟲感染病史花費(fèi)高，步驟多，無(wú)法區(qū)分活的和死的寄生蟲，有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性或假陰性檢測(cè)寄生蟲感染的診斷方法的比較現(xiàn)代分子診斷技術(shù)主要是指應(yīng)用免疫學(xué)和分子生物學(xué)的方法對(duì)病原物質(zhì)進(jìn)行診斷檢測(cè)一種有效的診斷方法應(yīng)具備：

1、專一性（specificity）強(qiáng)，診斷只對(duì)某一種病原菌分子產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)2、靈敏度(sensitivity)高3、操作簡(jiǎn)單(simplicity)基因診斷的特點(diǎn)特異性高

檢測(cè)目標(biāo)是基因，為原始的致病因素靈敏度高

待測(cè)標(biāo)本往往微量，目的基因只需pg水平穩(wěn)定性高

基因的化學(xué)組成為核酸，比蛋白質(zhì)穩(wěn)定，且不需處于活性狀態(tài)診斷范圍廣，適應(yīng)性強(qiáng)

確切的診斷，也能確定與疾病的關(guān)聯(lián)狀態(tài)臨床應(yīng)用前景好基因診斷優(yōu)點(diǎn)從基因水平徹底揭示疾病的病因及發(fā)病機(jī)制顯著提早產(chǎn)前診斷的時(shí)間無(wú)需對(duì)組織、器官或細(xì)胞進(jìn)行選擇快捷準(zhǔn)確、安全DNASouthern

blot,

FISH,PCR,

Sequencing,micoarray,

restriction

analysis,

RFLP，SSCPRNANorthern

blot,

RT-PCR,

micoarraysProteinWestern

blot,

Immuno-histochemistry,microarray遺傳性疾病的基因診斷所有遺傳性疾病都與某種或多種基因的突變有關(guān)，對(duì)這類疾病進(jìn)行分子診斷有兩種策略可供選擇：直接診斷策略；間接診斷策略；一、直接診斷策略和方法遺傳性疾病分子診斷的直接策略就是通過(guò)各種分子生物學(xué)技術(shù)直接檢測(cè)導(dǎo)致遺傳性疾病的各種基因突變，如基因的缺失、插入、倍增或者是點(diǎn)突變等遺傳缺陷。因此直接診斷的前提是被測(cè)基因已經(jīng)克隆，其核酸序列和結(jié)構(gòu)已被闡明。直接診斷策略主要涉及以下幾個(gè)方面。全國(guó)高等醫(yī)藥院校教材-分子診斷學(xué)（一）點(diǎn)突變的診斷點(diǎn)突變即DNA分子中的一個(gè)堿基被另一個(gè)堿基所替換，其后果取決于替換的性質(zhì)和位置。對(duì)基因背景清楚或部分清楚的點(diǎn)突變，可以采取直接檢測(cè)基因點(diǎn)突變的方法如等位基因特異性寡核苷酸雜交（ASO）、等位基因特異性擴(kuò)增（ASA）、PCR－RFLP、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、基因芯片技術(shù)進(jìn)行診斷；對(duì)于一些基因背景未知的點(diǎn)突變，可以采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）、變性梯度凝膠電泳（DEEG）、異源雙鏈分析（HA）、DNA序列測(cè)定、蛋白截短測(cè)試等方法。（二）片段性突變的檢測(cè)

片段性突變是指DNA分子中較大范圍的堿基發(fā)生突變，如堿基的缺失、插入、擴(kuò)增和重組。

對(duì)于少數(shù)核苷酸缺失或插入，可以采用檢測(cè)點(diǎn)突變的方法；

而對(duì)于大的片段突變，則使用Southern印跡技術(shù)和多重PCR技術(shù)。二、間接診斷策略和方法目前大多數(shù)遺傳性疾病的致病基因尚未被定位和闡明，因此無(wú)法進(jìn)行直接診斷，還有一些基因長(zhǎng)度數(shù)百到數(shù)千堿基，突變種類多且分布廣泛，這種情況下突變檢測(cè)便十分復(fù)雜和困難，此時(shí)要用間接診斷策略進(jìn)行診斷采用多態(tài)性連鎖分析的方法，尋找具有基因缺陷的染色體、相關(guān)基因的等位基因型和單倍體型等，并判定被檢者是否有這條存在基因缺陷的染色體、相關(guān)基因的等位基因型和單倍體型等。全國(guó)高等醫(yī)藥院校教材-分子診斷學(xué)

多態(tài)性在人群中出現(xiàn)的頻率應(yīng)大于1%（如小于1%

常認(rèn)為是異常突變）。在生物進(jìn)化過(guò)程中形成的，它本身并不致病或于遺傳病有直接聯(lián)系，故稱為“中性突

變”。人類的23對(duì)染色體中，每一條上都帶有許多遺傳多態(tài)性位點(diǎn)，其中一些位點(diǎn)在染色體上的位置與致病基因靠的很近，甚至連鎖在一起遺傳，并且呈孟德爾式遺傳。因此，可利用這一多態(tài)性位點(diǎn)作為遺傳指示標(biāo)記。全國(guó)高等醫(yī)藥院校教材-分子診斷學(xué)間接診斷：檢測(cè)與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)志三代遺傳標(biāo)志：RFLP STR(short

tandem

repeats),VNTR(variable

number

of

tandem

repeats)SNP(single

nucleotide

polymorphism)三代分子標(biāo)記進(jìn)行家系、群體等連鎖分析，找出致病基因。基因芯片、快速測(cè)序等高通量分析手段。第二節(jié)

遺傳病的分子診斷一、血紅蛋白病

hemoglobinopathy血紅蛋白由兩條α珠蛋白肽鏈和兩條其他珠蛋白肽鏈組成的四聚體。血紅蛋白病可以分為二類：①由于珠蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化所導(dǎo)致的異常血紅蛋白病；②由于珠蛋白多肽鏈的合成速率不平衡所導(dǎo)致的地中海貧血。全國(guó)高等醫(yī)藥院校教材-分子診斷學(xué)六種正常血紅蛋白的肽鏈組成和正常人血中的濃度血紅蛋白種類肽鏈組成

(分子式)正常成人血中的濃度（%）HbA(A1)α2β295～98HbA2α2δ22～3HbFGower1Gower2Portlandα2γ2ζ2ε2α2ε2ζ2γ2～1(胎兒期)無(wú)（胎兒期早期）無(wú)（胎兒期早期）無(wú)（胎兒期早期）血紅蛋白HbA基因（一）α珠蛋白基因16p13.3全國(guó)高等醫(yī)藥院校教材-分子診斷學(xué)（二）β珠蛋白基因11p15.5不同階段的血紅蛋白基因表達(dá)和血紅蛋白組成（二）鐮狀細(xì)胞貧血鐮刀型貧血癥是一種遺傳性貧血癥，屬隱性遺傳性疾病?；颊叩募t細(xì)胞缺氧時(shí)變成鐮刀形，失去輸氧的功能，破裂造成嚴(yán)重貧血。該病常見于非洲和美洲黑人，因?yàn)殡s合基因型細(xì)胞貧血癥狀輕微，但紅血球內(nèi)的輕微缺氧對(duì)寄生在紅血球里的瘧原蟲卻是致死的，有利于防止瘧疾的流行。1.鐮狀細(xì)胞貧血的分子機(jī)理由于β珠蛋白基因中第6個(gè)密碼子的序列由原來(lái)的GAG改變成GTG，導(dǎo)致β珠蛋白肽鏈的第6位氨基酸殘基由原來(lái)的谷氨酸改變成纈氨酸，改變后的血紅蛋白稱謂鐮狀血紅蛋白（HbS）。該血紅蛋白四聚體在脫氧時(shí)，聚集成陣列，幾乎變?yōu)榻Y(jié)晶體，使紅細(xì)胞發(fā)生鐮變（sickling）,彈性幾乎喪失，無(wú)法通過(guò)直徑比紅細(xì)胞小的毛細(xì)血管?；蛐蛄忻艽a子

5

6

7…CCTGAGGAG……CCTGTGGAG……CCTAAGGAG…對(duì)應(yīng)氨基酸…Pro

Glu

Glu…βAβSβCβAβSβC…Pro

Val…Pro

LysGlu…Glu…密碼子

5

6

7…

CCT

·

GAG

·

GAG……

CCT

·

GTG

·

GAG……

CCT

·

AAG

·

GAG……

CCT

·

NAG

·

G

…βAβSβC正常鐮狀突變限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列2.鐮狀細(xì)胞貧血的分子診斷方法限制性內(nèi)切酶MstⅡ識(shí)別序列為CCTNAGG，N為任意核苷酸。因此β珠蛋白基因的第5、6、7密碼子中有該內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。發(fā)生鐮狀突變后該酶切位點(diǎn)消失。RFLP

/

MstII

test

for

Sickle-Cell

Anemia（二）地中海貧血地中海貧血（thalassemia）是由于珠蛋白鏈的合成不平衡所造成的一類常見的單基因遺傳性、溶血性疾病。血紅蛋白α地中海貧血1.α地中海貧血遺傳特征（1）由于基因缺失導(dǎo)致的α地中海貧血基因型表

型 基因型正常人

αα/ααα地中海貧血Ⅱ（靜止型）α地中海貧血Ⅰ（標(biāo)準(zhǔn)型）Hb

H病（β4）Hb

Bart’s（胎兒水腫綜合癥，γ4）α

-/αα-

-/ααα-

/

-

--

-/

-

-（2）由于以下基因突變導(dǎo)致α地中海貧血①點(diǎn)突變②移碼突變③無(wú)義突變④mRNA加尾信號(hào)突變⑤終止密碼子突變2.分子診斷方法（1）PCR法擴(kuò)增產(chǎn)物194bp：Bart’s水腫胎兒；擴(kuò)增產(chǎn)物194bp和287bp：HbH病或α地中海貧血

Ⅰ；擴(kuò)增產(chǎn)物287bp：正常人或α地中海貧血Ⅱ。（2）Southern印跡法α地中海貧血的基因簇限制性酶切片段長(zhǎng)度α基因探針ζ基因探針Bam

HⅠ

Eco

RⅠHind

Ⅲ

EcoRⅠaa/aa14

2316.5，13

23，5--/---

-20，13

17，5-a3.7/aa10.3

19.3ND

ND-a4.2/aa9.8

18.8ND

NDβ地中海貧血

1.遺傳特征：突變是β地中海貧血的主要發(fā)病原因。如果突變發(fā)生在β基因的啟動(dòng)子區(qū)域則轉(zhuǎn)錄的β鏈mRNA水平下降；如果突變發(fā)生在剪接信號(hào)附近則導(dǎo)致異常的剪接；如果在結(jié)構(gòu)基因中發(fā)生突變，導(dǎo)致β珠蛋白鏈的合成量減少、根本沒(méi)有或產(chǎn)生異常的β珠蛋白鏈。 重型β珠蛋白生成障礙性貧血，又稱為β0珠蛋白生成障礙性貧血，基因型為純合子β地/β地，兩個(gè)β基因都發(fā)生突變，使其不能合成正常的β珠蛋白，沒(méi)有血紅蛋白A的合成，患者幾乎靠輸血維持生命。 β珠蛋白生成障礙性貧血，又稱為β+珠蛋白生成障礙性貧血，其基因型為雜合子β地/β，其中一個(gè)基因正常，貧血癥狀較輕。β地中海貧血常見突變位點(diǎn)2．分子診斷方法PCR和基因點(diǎn)突變檢測(cè)技術(shù)是β地中海貧血基因診斷的主要手段，常用的方法有：（1）PCR-RDB法(反向斑點(diǎn)雜交)：先將探針固定在尼龍膜上，再將待測(cè)的

DNA樣本(一般是經(jīng)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物)與之雜交，一次就可以判斷某一基因的各種突變情況。擴(kuò)增的引物為：Bio-C1

：GTACGGCTGTCATCACTTAGACTTCA-3′Bio-C2

：5′-402bp5′-TGCAGCTTGTCACAGTGCAGCTCACT-34′23bpBio-C3：5′-GTGTACACATATTGACCAAA-3′Bio-C4：5′-AGCACACAGACCAGCACGTT-3′中國(guó)人中已發(fā)現(xiàn)有21種β珠蛋白基因的突變型，使用固化在膜上的11種探針可以檢測(cè)出98%以上的中國(guó)人β地中海貧血突變基因型。（2）PCR-ASO法：當(dāng)基因的突變情況完全明了時(shí)，可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific

oligonucleotide,ASO），長(zhǎng)度通常為

20bp左右。一種探針與正常基因雜交，另一種探針與突變基因雜交，即將突變的基因區(qū)別開來(lái).PCR先將含有突變點(diǎn)的基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后再與ASO探針作點(diǎn)雜交。優(yōu)點(diǎn)是靈敏、難確，缺點(diǎn)是一次雜交只能檢測(cè)一種突變。（3）等位基因特異性PCR（ASPCR）:TTTATTTAAATAAAGGC產(chǎn)物AAAAAAAGGCTTTTTTT產(chǎn)物正常引物突變引物PCRPCR無(wú)突變突變雜合子（4）芯片技術(shù)多采用PCR體外擴(kuò)增結(jié)合DNA芯片反向點(diǎn)雜交檢測(cè)技術(shù)，可快速準(zhǔn)確檢測(cè)人臨床全血樣本中β珠蛋白基因上多個(gè)基因位點(diǎn)的突變。遺傳性乳腺癌相基因突變2013年切除乳腺2015年切除卵巢和輸卵管BRCA1安吉麗娜·朱莉Let’s

Do

PCR!美國(guó)前副總統(tǒng)漢弗萊<Humphrey)在1967年發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)有一腫物，病理切片未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞良性“慢性增生性囊腫”，未進(jìn)行手術(shù)治療。九年后，他被診斷為患有“膀朧癌”，兩年后死于該病1994年，研究者用靈敏的PCR技術(shù)對(duì)上述漢弗萊1967年的病理切片進(jìn)行了P53抑癌基因檢查，發(fā)現(xiàn)那時(shí)的組織細(xì)胞雖然在形態(tài)上還沒(méi)有表現(xiàn)出惡性變化，但其P53基因的第227個(gè)密碼子已經(jīng)發(fā)生了一個(gè)核苷酸的突變。就是這個(gè)基因的微小變化，使其抑癌功能受損，導(dǎo)致九年后細(xì)胞癌變的發(fā)生。這說(shuō)明，在典型癥狀出現(xiàn)之前的很長(zhǎng)時(shí)間，細(xì)胞癌變的信息已經(jīng)在基因上表現(xiàn)出來(lái)了P53抑癌基因思考題遺傳性疾病的分子診斷策略全國(guó)高等醫(yī)藥院校教材-分子診斷學(xué)基因治療Genetherapy狹義概念將具有正常功能的基因置換或增補(bǔ)患者體內(nèi)有缺陷的基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。第一節(jié)

基因治療的概念及其策略一、基因治療（

Gene

therapy）概念廣義概念將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達(dá)到治療疾病的目的。分子缺陷清楚可以得到相應(yīng)基因的克隆病理生理機(jī)制已知有利的風(fēng)險(xiǎn)-利益比治療基因可以被調(diào)控合適的靶細(xì)胞有效安全相關(guān)法規(guī)健全基因治療的必備條件：基因矯正（gene

correction）對(duì)于致病基因中的異常堿基進(jìn)行精確修復(fù)，使其恢復(fù)正常功能；基因置換（gene

replacement）用正?；蛟谠惶鎿Q致病基因，使細(xì)胞DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)；基因增補(bǔ)（gene

augmentation）將正?；?qū)牖颊唧w細(xì)胞內(nèi)，使其整合到染色體中一起表達(dá)，以補(bǔ)償缺陷基因的功能，但致病基因未去除；基因表達(dá)調(diào)節(jié)（modulation

）指將特定的反義核酸、RNA干擾或核酶等技術(shù)抑制目的基因表達(dá)從而消除致病基因的作用。第一節(jié)

基因治療的概念及其策略二、基因治療的總體策略針對(duì)致病基因而言第一節(jié)

基因治療的概念及其策略二、基因治療的總體策略針對(duì)非致病基因而言自殺基因這種基因?qū)胧荏w細(xì)胞后可產(chǎn)生一種酶，它可將原無(wú)細(xì)胞毒性或低毒藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒物質(zhì)，將細(xì)胞受體細(xì)胞殺死，這種基因被稱為“自殺基因”。自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞后，可將腫瘤細(xì)胞殺死。但對(duì)正常細(xì)胞則無(wú)傷害作用。免疫基因治療將某些細(xì)胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因?qū)肽[瘤患者體內(nèi)，以增強(qiáng)患者的抵抗力。耐藥基因治療在腫瘤化療過(guò)程中，把產(chǎn)生抗藥物毒性的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，從而使患者能耐受更大劑量的化療。More……第一節(jié)

基因治療的概念及其策略二、基因治療的總體策略Germ

line

gene

therapyIn

the

case

of

germ

line

gene

therapy,

Germ

cells,

i.e.,

sperm

or

eggs,are

modified

by

the

introduction

of

functional

genes,

which

are

integratedinto

their

genomes.

Therefore,

the

change

due

to

therapy

would

beheritable

and

would

be

passed

on

to

later

generations.

This

new

approach,theoretically,

should

be

highly

effective

in

counteracting

genetic

disordersand

hereditary

diseases.

However,

many

jurisdictions

prohibit

this

forapplication

in

human

beings,

at

least

for

the

present,

for

a

variety

oftechnical

and

ethical

reasons.Somatic

gene

therapyIn

the

case

of

somatic

gene

therapy,

the

therapeutic

genes

aretransferred

into

the

somatic

cells

of

a

patient.

Any

modifications

andeffects

will

be

restricted

to

the

individual

patient

only,

and

will

not

beinheritedby

the

patient's

offspring

or

later

generations.第二節(jié)基因治療的基本程序第二節(jié)

基因治療的基本程序基因治療的兩種途徑載體目的基因in

vivoex

vivo靶細(xì)胞1、間接體內(nèi)治療途徑（ex

vivo）是先從患者體內(nèi)取出某一器官組織的細(xì)胞，體外擴(kuò)增后，將目的基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞形成表達(dá)外源基因的遺傳修飾細(xì)胞，選擇高表達(dá)的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，以一定數(shù)量移植患者體內(nèi)。（安全、易控制但操作復(fù)雜）2、直接體內(nèi)治療途徑（in

vivo）將目的基因體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，所用載體必須具有特異的導(dǎo)向性和轉(zhuǎn)移效率。（操作簡(jiǎn)單但療效短、免疫排斥等）第二節(jié)基因治療的基本程序目的基因的選擇和獲取目的基因與轉(zhuǎn)運(yùn)載體結(jié)合靶細(xì)胞的確認(rèn)載體攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)胞外源基因的整合外源基因的表達(dá)及檢測(cè)治療作用及穩(wěn)定性、安全性評(píng)價(jià)第二節(jié)

基因治療的基本程序第二節(jié)

基因治療的基本程序一、目的基因在了解疾病發(fā)生的分子機(jī)制基礎(chǔ)上，選擇對(duì)疾病有治療作用的特定基因。如對(duì)單基因缺陷遺傳病，可用野生型（非突變）基因即可用于治療；對(duì)于腫瘤，最好選擇某些與該類腫瘤密切相關(guān)的癌基因或抑癌基因用于基因治療。治療性基因獲得的方法很多：用酶切或探針雜交法從基因組DNA文庫(kù)獲得，從cDNA文庫(kù)獲取，PCR擴(kuò)增，人工合成等?；蛑委熽P(guān)鍵步驟之一，是將治療基因高效轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)、并能調(diào)控其適度表達(dá)。常用的載體有兩類：病毒載體和非病毒載體。病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒載體、皰疹病毒載體等非病毒載體：裸露DNA、脂質(zhì)體、分子耦聯(lián)載體、染色體載體、多聚物、納米載體等。與病毒載體的主要區(qū)別在于：采用理化方法將治療基因轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)。第二節(jié)

基因治療的基本程序二、轉(zhuǎn)運(yùn)載體第二節(jié)

基因治療的基本程序二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)Safety:

deletion

of

a

part

of

the

viral

genome

critical

for

viralreplication.

Such

a

virus

can

efficiently

infect

cells

but,

once

theinfection

has

taken

place,

requires

a

helper

virus

to

provide

themissing

proteins

for

production

of

new

virions.Low

toxicity:

The

viral

vector

should

have

a

minimal

effect

on

thephysiology

of

the

cell

it

infects.Stability:

Some

viruses

are

genetically

unstable

and

can

rapidlyrearrange

their

genomes.Cell

type

specificity:

Most

viral

vectors

are

engineered

to

infect

aswide

a

range

of

cell

types

as

possible.Identification:

Viral

vectors

are

often

given

certain

genes

that

helpidentify

which

cells

took

up

the

viral

genes.

These

genes

are

calledMarkers,

a

common

marker

is

antibiotic

resistance

to

a

certainantibiotic.第二節(jié)

基因治療的基本程序二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)（逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）LTR

ψLTRgagpolenv逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)結(jié)構(gòu)和感染過(guò)程與普通逆轉(zhuǎn)錄病毒相似；可使靶細(xì)胞變成穩(wěn)定表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；感染靶細(xì)胞后不擴(kuò)散；假病毒感染靶細(xì)胞的效率非常高；不感染非增殖細(xì)胞。第二節(jié)

基因治療的基本程序二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)（逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）同時(shí)也存在一定的缺點(diǎn):①容量小，只能容納8kb-10kb的外源基因片段；②血清補(bǔ)體能使之失活；③病毒滴度低，低于治療大腫瘤需要的滴度；④病毒整合到DNA后，可能引起插入突變和激活癌基因的可能；⑤宿主范圍有限，只感染增殖細(xì)胞，故在應(yīng)用上有一定局限性。第二節(jié)

基因治療的基本程序二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)（逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）慢病毒(HIV)載體

Lentivirus優(yōu)點(diǎn)：高效感染宿主細(xì)胞，并且其感染范圍廣；能逃避人體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，從而防止免疫排斥缺點(diǎn)：引起抑癌基因的受抑和原癌基因的激活，以及對(duì)細(xì)胞的毒性和產(chǎn)生變種病毒第二節(jié)

基因治療的基本程序二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)腺病毒載體

1、結(jié)構(gòu)E1AE1BE2BE2AE4E3L1~L5第二節(jié)

基因治療的基本程序二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)（腺病毒載體）2、腺病毒載體特點(diǎn)宿主范圍廣腺病毒蛋白表達(dá)不以宿主增殖為必要條件可獲得高病毒效價(jià)重組體非常穩(wěn)定不會(huì)引起腫瘤有較高的安全性無(wú)包膜，不易被補(bǔ)體滅活，可直接在體內(nèi)應(yīng)用不整合入染色體第二節(jié)

基因治療的基本程序病毒載體生物學(xué)特性適用范圍反轉(zhuǎn)錄病毒載體單鏈RNA

病毒8~10kb可感染分裂細(xì)胞；整合到染色體中；表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)；

有致癌的危險(xiǎn)；Exvivo

基因治療；腫瘤基因治療。腺病毒載體雙鏈DNA

病毒36kb可感染分裂和非分裂細(xì)胞；不整合到染色體中；

外源基因表達(dá)水平高；表達(dá)時(shí)間較短；免疫原性強(qiáng)；Invivo

基因治療；腫瘤基因治療；疫苗。AAV

病毒載體單鏈DNA

病毒~5kb可感染分裂和非分裂細(xì)胞；整合到染色體中；無(wú)致病性；免疫原性弱；可長(zhǎng)期表達(dá)外源基因；在骨骼肌、心肌、肝臟、視網(wǎng)膜等組織中表達(dá)較高；In

vivo

基因治療；Exvivo

基因治療；遺傳病基因治療；

獲得性慢性疾病的基因治療。慢病毒載體單鏈RNA

病毒>10kb整合到染色體中容量大；可感染分裂和非分裂細(xì)胞；無(wú)免疫原性血液病的治療腫瘤的基因治療。脂質(zhì)體脂質(zhì)體載體是用人造雙層磷脂質(zhì)，包裝DNA后形成的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。脂質(zhì)體載體無(wú)毒無(wú)抗原性，目的基因與脂質(zhì)體的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大，可單獨(dú)或聯(lián)合其他載體使用，并可通過(guò)靜脈注射使目的基因進(jìn)入特定部位。缺點(diǎn)：表達(dá)時(shí)間短，不能通過(guò)血腦屏障。第二節(jié)

基因治療的基本程序二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)分子耦聯(lián)載體分子耦聯(lián)載體由DNA、DNA結(jié)合因子和配體三部分組成。配體與特異的受體結(jié)合，經(jīng)受體介

導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑，將目的基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。缺點(diǎn)：DNA易被降解，降低了基因轉(zhuǎn)移效率；靶向性不高第二節(jié)

基因治療的基本程序二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)多聚物載體多聚物載體是利用帶正電荷的多聚陽(yáng)離子與帶負(fù)電荷的

DNA相結(jié)合，形成穩(wěn)定的多聚復(fù)合物，使DNA不易被核酸酶降解，并可與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的受體相結(jié)合，而被攝入到細(xì)胞中。聚合物聚乙烯亞氨(PEI)：PEI分子量的增加，其對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性同時(shí)增加；聚乙二醇(PEG)：降低PEI的毒性；聚D，L22，42二氨基丁酸(PDBA)：一種新型多聚物基因載體第二節(jié)

基因治療的基本程序二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)裸露質(zhì)粒DNA將裸露質(zhì)粒DNA直接注入肌肉，外源基因在肌肉中的表達(dá)量與注入的外源基因含量成正比，與溶液體積無(wú)關(guān)。第二節(jié)

基因治療的基本程序二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)染色體載體一些參與哺乳動(dòng)物基因表達(dá)和復(fù)制的染色體成分如轉(zhuǎn)座子、基因隔離子、增強(qiáng)子、基因座控制區(qū)、核骨架結(jié)合區(qū)以及基質(zhì)結(jié)合區(qū)等在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中，均被用來(lái)設(shè)計(jì)載體，并整合入基因組而發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)座子是一類小的DNA片段，可以在染色體不同的區(qū)域移動(dòng)并攜帶遺傳信息；轉(zhuǎn)座子的整合位點(diǎn)具有可預(yù)測(cè)性，從而提高轉(zhuǎn)基因治療的安全性。第二節(jié)

基因治療的基本程序二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)1.細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽介導(dǎo)基因?qū)胂到y(tǒng)蛋白質(zhì)之所以能夠進(jìn)入細(xì)胞，就是因?yàn)樵谒鼈兊慕Y(jié)構(gòu)中含有能夠攜帶生物大分子進(jìn)入細(xì)胞的多肽-細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽。如果將這個(gè)多肽結(jié)構(gòu)和目的基因結(jié)合，它就能將目的基因帶入靶細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的表達(dá)效率高，但價(jià)格昂貴，穩(wěn)定性差，在一定程度上限制了它的應(yīng)用。第二節(jié)

基因治療的基本程序二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)（其他新型載體）2.納米微生物技術(shù)基因治療載體納米微生物具有許多優(yōu)點(diǎn)：

1)納米脂質(zhì)體主要由磷脂以及膽固醇合成，可以通過(guò)與細(xì)胞膜的融合或者胞吞作用將目的基因?qū)氚屑?xì)胞；

2)納米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在傳遞過(guò)程中無(wú)毒，無(wú)免疫原性，并且可以通過(guò)新陳代謝降解，因此不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性；

3)通過(guò)調(diào)節(jié)納米材料的降解速度，還可以控制目的基因的釋放速度，延長(zhǎng)其治療效果；

4)納米基因載體比表面積大，并可在表面偶聯(lián)靶細(xì)胞的配體

或抗體，實(shí)現(xiàn)基因治療的主動(dòng)靶向性，大大提高基因傳遞的

特異性和加強(qiáng)靶細(xì)胞對(duì)目的基因的攝取。第二節(jié)

基因治療的基本程序二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)（其他新型載體）選擇靶細(xì)胞的原則是：

1）必須較堅(jiān)固，足以耐受處理，并易于由人體分離又便于輸回體內(nèi)；

2）具有增殖優(yōu)勢(shì)，生命周期長(zhǎng)，能存活幾月至幾年，最后可延續(xù)至病人的整個(gè)生命期；

3）易于受外源遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化；4）在選用反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，目的基因表達(dá)最好具有組織特異性的細(xì)胞。目前使用得較多的是骨髓干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞等。第二節(jié)

基因治療的基本程序三、靶細(xì)胞的選擇干細(xì)胞一種具有復(fù)制能力、可以形成各種組織的早期未分化細(xì)胞Embryonic

stem

cells

(ES)

胚胎干細(xì)胞4~5

d

胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner

cell

mass

of

blastocyst）具有自我更新和分化為任何類型組織細(xì)胞的能力（全能性）Pluripotent

stem

cells

多能干細(xì)胞5

~10

W

fetus

(

Embryonic

germ

cells)外層細(xì)胞→胚胎等與發(fā)育相關(guān)組織內(nèi)細(xì)胞團(tuán)→人體所有器官Special

stem

cells

專能干細(xì)胞adult (adult

stem

cells,

AS)hematopoietic

stem

cell

(HSC)neural

stem

cell

(NSC)mesenchymal

stem

cell

(MSC)骨髓干細(xì)胞骨髓中至少含有兩種干細(xì)胞：造血干細(xì)胞

Hematopoeitic

stem

cells（HSC）骨髓間質(zhì)干細(xì)胞Bone

marrow

stromal

cells（MSC）HSC一般處于靜止期，必要時(shí)才進(jìn)入細(xì)胞周期多能干細(xì)胞 (造血干細(xì)胞,

HSC)定向干細(xì)胞 (造血祖細(xì)胞,HPC)成熟的終末細(xì)胞紅系祖細(xì)胞巨核系祖細(xì)胞單核系祖細(xì)胞 具有可移植性和自我更新能力，在體內(nèi)永不耗竭，只需單次治療； 具有多能性，可分化為粒、紅、淋巴和血小板等各種血細(xì)胞，且在分化過(guò)程中保持基因組的相對(duì)穩(wěn)定，使目的基因隨細(xì)胞的分化成熟而相對(duì)擴(kuò)增，病人可終身受益；外源基因表達(dá)產(chǎn)物可通過(guò)血液循環(huán)遍布全身；造血干/祖細(xì)胞的功能活性可在體內(nèi)外進(jìn)行分析； 取材于自體骨髓或臍帶血，易于獲取也便于植回并存活，臨床已有成熟技術(shù)骨髓中的非造血干細(xì)胞，能分化成多種中胚層來(lái)源的間質(zhì)細(xì)胞（骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞等）MSC在體內(nèi)可定向成骨、成軟骨或成肌腱分化，可能是不同組織的微環(huán)境含有不同因子，促進(jìn)MSC向不同譜系分化。

MSC體外易于分離和培養(yǎng)，回輸體內(nèi)后可定位于骨髓并通過(guò)自我更新而長(zhǎng)期存活，因而可作為理想的靶細(xì)胞用于基因治療（直接移植MSC可治療骨和軟骨的疾?。┕撬栝g質(zhì)干細(xì)胞成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞是一種容易獲得和在體外培養(yǎng)并進(jìn)

行遺傳修飾的細(xì)胞。經(jīng)修飾的細(xì)胞又容易移植

回體內(nèi)，必要時(shí)還可將已植入的細(xì)胞重新移走，使其介導(dǎo)的基因治療終止。已有多種細(xì)胞因子基因被轉(zhuǎn)移到小鼠皮膚成纖 維細(xì)胞，然后再移植回小鼠。這些細(xì)胞再體內(nèi) 持續(xù)分泌細(xì)胞因子，使小鼠對(duì)腫瘤的免疫功能 明顯增強(qiáng)。遺傳修飾后的成纖維細(xì)胞也可移植入腦內(nèi)，以治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病國(guó)內(nèi)薛京倫等以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將人凝血因子IX cDNA 在體外轉(zhuǎn)移到兩例血友病患者的皮膚成纖維細(xì)胞中，用膠原基質(zhì)包埋后再自體移植回體內(nèi)，結(jié)果IX因子在體內(nèi)持續(xù)高水平表達(dá)2年以上，使兩患者的出血癥狀得到不同程度減輕。肌細(xì)胞骨骼肌優(yōu)點(diǎn)：最常用的注射途徑，對(duì)外源藥物耐受力強(qiáng)；面廣量大又位于體表易于操作，是表達(dá)外源基因的良好場(chǎng)所。外周血淋巴細(xì)胞（peripheralblood

lymphocyte，PBL）主要優(yōu)點(diǎn)： 易于從體內(nèi)取出和回輸。應(yīng)用IL-2尚可使PBL在體外進(jìn)行培養(yǎng)并擴(kuò)增，從而獲得足夠數(shù)量以適應(yīng)體外操作。 PBL對(duì)目前常用的RV,AAV等都有一定敏感度，可被有效導(dǎo)入外源基因，并可耐受篩選。 篩選出轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的細(xì)胞回輸體內(nèi)可繼續(xù)存活，應(yīng)用

IL-2可使之繼續(xù)生長(zhǎng)且有功能。世界上首例遺傳病的基因治療：ADA缺乏癥（SCID）淋巴細(xì)胞物理方法膜融合法

病毒載體法質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)移法磷酸鈣法化學(xué)方法DEAE－葡聚糖法電穿孔法粒子轟擊法（基因槍法）第二節(jié)

基因治療的基本程序四、載體攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)胞第二節(jié)

基因治療的基本程序五、外源基因的整合不整合整合隨機(jī)整合定點(diǎn)整合第二節(jié)

基因治療的基本程序六、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)（一）DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)用于外源基因的整合分析。（二）RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。第二節(jié)

基因治療的基本程序七、有效性、穩(wěn)定性和安全性評(píng)價(jià)動(dòng)物模型臨床試驗(yàn)第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀進(jìn)行基因治療必須具備下列條件：

1)選擇適當(dāng)?shù)募膊?，并?duì)其發(fā)病機(jī)理及相應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)功能了解清楚；

2)糾正該病的基因已被克隆，并了解該基因表達(dá)與調(diào)控的機(jī)制與條件；

3)該基因具有適宜的受體細(xì)胞并能在體外有效表達(dá)；4)具有安全有效的轉(zhuǎn)移載體和方法，以及可供利用的動(dòng)物模型。今20年來(lái)基因治療的成果1腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)病因:淋巴細(xì)胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆積破壞免疫功能患兒很少活到成年第一個(gè)基因臨床治療的方案(1990.9.14,NIH)治療策略：淋巴細(xì)胞ADA酶恢復(fù)至正常水平的5%-10%維持免疫系統(tǒng)功能改善病人癥狀XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在

Xq26.3-q27.2。臨床表現(xiàn)，易出血，凝血時(shí)間長(zhǎng)，輕傷、小手術(shù)后常出血不止。發(fā)病率為

1/30000。例如：我國(guó)學(xué)者薛京倫實(shí)施的FⅨ的基因治療。第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀二、乙型血友病逆轉(zhuǎn)錄病毒載體+FⅨcDNA重組體5`

LTR

FⅨ

neo

SV

PSOLTR

3`①導(dǎo)入倉(cāng)鼠細(xì)胞（CHO）→FⅨ表達(dá)；②導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞→FⅨ表達(dá)；③91年，導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞→回植病人皮下→FⅨ基因表達(dá)，F(xiàn)Ⅸ基表達(dá)水平達(dá)正常人的5%。是我國(guó)基因治療成功的例子。第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀二、乙型血友?、買L-2

Gene（白介2）②TNF-Gene（腫瘤壞死因子）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入TIL（體外培養(yǎng)的自體細(xì)胞）回植患者體內(nèi)TIL進(jìn)入自體腫瘤部位，提高細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀三、黑色素瘤的基因治療是指利用人工合成的反義RNA和反義DNA來(lái)阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，控制細(xì)胞生長(zhǎng)在中間階段，使編碼蛋白質(zhì)的基因能轉(zhuǎn)錄為mRNA，因而不能翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，以達(dá)治療某一疾病的目的第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀四、反義技術(shù)第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀五、基因編輯技術(shù)基因編輯技術(shù)及基因編輯的三大利器：ZFN（鋅指

核酸酶）、TALEN（轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶）

和CRISPR/Cas9（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)技術(shù)）。

CRISPR技術(shù)在今年被《Nature

Methods》評(píng)為在過(guò)去十年中對(duì)生物學(xué)研究影響最深的十大技術(shù)之一。全球首例！“基因編輯”治療白血病第四節(jié)、基因治療的靶向性靶向性基因載體的作用原理靶向性是指在治療過(guò)程中，把治療作用或藥物效應(yīng)限定在特定的靶細(xì)胞、組織或器官內(nèi)，而不影響其他正常的細(xì)胞、組織或器官的功能。靶向性載體在這里不僅僅起一個(gè)靶向作用，還要通過(guò)各自的不同作用力和DNA分子鏈結(jié)合形成一個(gè)相對(duì)緊密的復(fù)合物粒子，使其更容易穿過(guò)細(xì)胞膜并且免受核酸酶的降解。第四節(jié)、基因治療的靶向性一、靶向性基因載體的作用原理三個(gè)步驟：

1.靶向性載體和目的基因以適當(dāng)比例混合，通過(guò)靜電荷力、分子間作用力等結(jié)合力結(jié)合在一起，使鏈狀的DNA分子折疊，形成粒狀的復(fù)合物。復(fù)合物在靶向性基團(tuán)的引導(dǎo)下接近靶細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞或者吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，在細(xì)胞內(nèi)緊密的復(fù)合物可以保護(hù)DNA避免核酸酶的降解。靶向性載體和目的基因脫離，目的基因通過(guò)核膜孔或者是在細(xì)胞分裂過(guò)程中進(jìn)入細(xì)胞核，修補(bǔ)缺失基因或者關(guān)閉異常基因，而靶向性載體則分解成小分子化合物通過(guò)細(xì)胞的新陳代謝排出細(xì)胞。理想的基因載體應(yīng)具備以下特點(diǎn)：

1)靶向特異性，并且不易被免疫系統(tǒng)識(shí)別；高度穩(wěn)定，容易制備，可濃縮和純化；安全，無(wú)毒性，對(duì)人體以及環(huán)境無(wú)危害；有利于基因高效轉(zhuǎn)移和長(zhǎng)期表達(dá)。第四節(jié)、基因治療的靶向性二、靶向性基因載體的選擇靶向性基因載體的安全性在攜帶目的基因進(jìn)入靶細(xì)胞后，某些基因載體并不能馬上分解，滯留在細(xì)胞內(nèi)影響細(xì)胞正常的新陳代謝，甚至引起基因突變從而殺死正常細(xì)胞乃至對(duì)人體的生命安全產(chǎn)生危害。尤其是病毒載體，存在著較為明顯的安全問(wèn)題：病毒載體中可能產(chǎn)生有傳染性、野型或輔助型病毒；可能隨機(jī)整合于宿主基因組中，從而活化癌基因