第三章液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

第三章液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)第1頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。第2頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用要解決的重要問題液相色譜流動相對質(zhì)譜工作條件的影響質(zhì)譜離子源溫度對液相色譜分析源的影響

第3頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月一、LC-MS聯(lián)用的接口技術(shù)常用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的接口主要有移動帶技術(shù)（MB）、熱噴霧接口、粒子束接口（PB）、快原子轟擊（FAB）、電噴霧接口（ESI）等。其中，電噴霧接口的應(yīng)用極為廣泛。1.電噴霧（ESI）1）特點：具有高的離子化效率，對蛋白質(zhì)而言接近100%；有多種離子化模式可供選擇；對蛋白質(zhì)而言，穩(wěn)定的多電荷離子的產(chǎn)生，使蛋白質(zhì)分子量測定范圍可高達(dá)幾十萬甚至上百萬；“軟”離子化方式使熱不穩(wěn)定化合物得以分析并產(chǎn)生高豐度的準(zhǔn)分子離子峰。第4頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月2）ESI接口的結(jié)構(gòu)ESI源主要由五部分組成：（1）流動相導(dǎo)入裝置；（2）真正的大氣壓離子化區(qū)域；（3）離子取樣孔；（4）大氣壓到真空的界面；（5）離子光學(xué)系統(tǒng)。第5頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月電噴霧：現(xiàn)在常見的噴嘴是內(nèi)徑為0.1mm的金屬毛細(xì)管。在它上面施加3～8kV的電壓時。由于毛細(xì)管的頂端很窄，形成的電場強(qiáng)度可高達(dá)106V/m。當(dāng)流速為0.5～5μL／min的LC流出物溢出金屬毛細(xì)管頂端時，會形成扇狀噴霧。它是細(xì)小的液珠和溶劑蒸氣的混合體。由于高壓電場的作用，溶液中帶某種電荷的溶質(zhì)會向液體表面移動，使液珠表面該種電荷過剩。表面過量電荷的正負(fù)，視施加在毛細(xì)管電極上的電壓正負(fù)而定。

第7頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月離子的形成：當(dāng)表面帶有大量電荷的精細(xì)液珠向下游移動時，溶劑迅速蒸發(fā)，液珠表面積不斷縮小，電荷密度增高。當(dāng)此情況達(dá)到Rayleigh極限時，液珠會分裂成更小的液珠。在質(zhì)量和電荷重新再分配后，更小的液珠進(jìn)入穩(wěn)定態(tài)；然后再重復(fù)蒸發(fā)、電荷過剩和液珠分裂。在整個過程的某個階段，分析物可以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。第8頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月離子的輸送：大氣壓條件下形成的離子，在電位差的趨使下（當(dāng)然也有壓力差的作用）,通過取樣孔（samplingcone）進(jìn)入質(zhì)譜真空區(qū)。離子流通過一個加熱的金屬毛細(xì)管，進(jìn)入第一個降壓區(qū)，在毛細(xì)管的出口處形成超聲速噴射流。由于分析物帶電荷并且動量大，可通過下游處于低電位的錐形分離器的小孔，進(jìn)入第二降壓區(qū)，經(jīng)聚焦后進(jìn)入質(zhì)譜。而與分析物離子一同穿過毛細(xì)管的少量的溶劑，由于呈電中性而且動量小，則在第一和第二降壓區(qū)被抽走。第9頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月電噴霧電離源ESINeedle噴霧針多層套管構(gòu)成溶液霧化氣（N2/Air）NebulizingGas干燥氣DryingGas（N2）加快溶劑揮發(fā)第10頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月電噴霧電離源ESITaylor錐庫侖分裂Rayleigh穩(wěn)定限形成正/負(fù)氣相離子被吸入質(zhì)量分析器第11頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月電噴霧接口的主要缺點是它只能接受非常小的液體流量（1～10μL?min-1）將氣動輔助電噴霧技術(shù)運用在接口中，使得接口可與大流量（約1mL?min-1）的HPLC聯(lián)機(jī)使用第12頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月2.大氣壓化學(xué)電離源（APCI）大氣壓化學(xué)離子化（APCI）技術(shù)應(yīng)用于液-質(zhì)聯(lián)用儀是由Horning等人于20世紀(jì)70年代初發(fā)明的，20世紀(jì)80年代末得到突飛猛進(jìn)的發(fā)展，與ESI源的發(fā)展基本上是同步的。但是APCI技術(shù)不同于傳統(tǒng)的化學(xué)電離接口，它是借助于電暈放電啟動一系列氣相反應(yīng)以完成離子化過程，因此也稱為放電電離或等離子電離。第13頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月大氣壓化學(xué)電離是將化學(xué)電離原理延伸到大氣壓下進(jìn)行的一種新的軟電離技術(shù)，樣品溶液從LC流出被氣化后，溶劑分子在電暈放電探針處形成反應(yīng)氣等離子體，樣品分子與反應(yīng)氣等離子體進(jìn)行質(zhì)子交換被電離，形成準(zhǔn)分子離子[M+H]+或[M-H]-，最后，樣品分子的準(zhǔn)分子離子通過篩選狹縫進(jìn)入質(zhì)譜儀，整個過程在大氣壓條件下完成。APCI是一種軟電離接口技術(shù)，電離過程中只產(chǎn)生單電荷峰，非常適合弱極性小分子化合物的測定。另外，APCI還與高流量的梯度洗脫兼容，通過調(diào)節(jié)離子源電壓，可以得到不同斷裂程度的質(zhì)譜圖。第14頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點：形成的是單電荷的準(zhǔn)分子離子，不會發(fā)生ESI過程中因形成多電荷離子而發(fā)生信號重疊、降低圖譜清晰度的問題；適應(yīng)高流量的梯度洗脫的流動相；采用電暈放電使流動相離子化，能大大增加離子與樣品分子的碰撞頻率，比化學(xué)電離的靈敏度高3個數(shù)量級。第15頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月大氣壓化學(xué)電離源APCINeedle噴霧針（加熱）CoronaNeedle電暈針reagentgas試劑氣離子-分子反應(yīng)第16頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月電噴霧與大氣壓化學(xué)電離的比較電離機(jī)理：電噴霧采用離子蒸發(fā)，而APCI電離是高壓放電發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移而生成[M＋H]+或[M-H]-離子。樣品流速：APCI源可從0.2到2mL／min；而電噴霧源允許流量相對較小,一般為0.2-1mL／min.斷裂程度；APCI源的探頭處于高溫，對熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解.靈敏度：通常認(rèn)為電噴霧有利于分析極性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性較小的化合物。多電荷：APCI源不能生成一系列多電荷離子第18頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月二、LC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化1.接口的選擇：ESI適合于中等極性到強(qiáng)極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個質(zhì)子的大分子（如蛋白質(zhì)）。APCI不適合可帶多個電荷的大分子，其優(yōu)勢在于弱極性或中等極性的小分子的分析。第19頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月2.正、負(fù)離子模式的選擇：正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時可優(yōu)先考慮使用正離子模式。負(fù)離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進(jìn)行堿化。樣品中含有較多的強(qiáng)負(fù)電性基團(tuán)，如含氯、含溴和多個羥基時可嘗試使用負(fù)離子模式。第20頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月3.流動相的選擇常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液。LC/MS接口避免進(jìn)入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須＜lmmol/L。第21頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月4.流量和色譜柱的選擇不加熱ESI的最佳流速是1-50mL/min，應(yīng)用4.6mm內(nèi)徑LC柱時要求柱后分流，目前大多采用l-2.1mm內(nèi)徑的微柱，ESI源最高允許lmL/min，建議使用200-400mL/min；APCI的最佳流速～lmL/min，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適。為了提高分析效率，常采用＜100mm的短柱第22頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月5.輔助氣體流量和溫度的選擇

操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點20℃左右即可。對熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。選用干燥氣溫度和流量大小時還要考慮流動相的組成，有機(jī)溶劑比例高時可采用適當(dāng)?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c的。第23頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月六大禁止禁止高濃度待測樣品<1ppm禁止用洗滌劑清洗玻璃容器禁止用塑料容器裝有機(jī)溶劑禁止用不揮發(fā)性緩沖鹽禁止高濃度有機(jī)緩沖鹽<10mM

禁止無機(jī)樣品進(jìn)樣第24頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月建議采用等度洗脫采用甲醇作為流動相比例偏大采用小內(nèi)徑的色譜柱如2.1mm除MRM模式不能超過4個通道一個色譜峰的數(shù)據(jù)點在15-25個第25頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月建議

ESI廣泛適用

APCI效果更佳

正模式廣泛適用負(fù)模式本底更低，信噪比更高第26頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月影響分子量測定的因素1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負(fù)離子方式pH要高些，除對離子化有影響，還影響LC的峰形。2）氣流和溫度：水含量高及流量大時要相應(yīng)增加。3）溶劑和緩沖液流量：流速適當(dāng)高可以提高出峰的靈敏度。4）溶劑和緩沖液的類型：通常正離子用甲醇好，負(fù)離子乙腈好些5）選擇合適的液相色譜類型：正相、反相、選擇合適的色譜柱第27頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月6）合適的電壓：DP電壓高時，樣品在源內(nèi)分解或碎裂；高DP電壓時會使多電荷離子比例低，多聚體也減少7）樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì)8）雜質(zhì)的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當(dāng)成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多時，競爭使被測物離子化不好，同時使LC分離不好9）樣品濃度第28頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月分子量測定中的誤判溶劑中的雜質(zhì)來自于塑料添加劑的峰樣品容器不干凈，常見表面活性劑的峰進(jìn)樣系統(tǒng)污染樣品在源內(nèi)碎裂，形成碎片離子第29頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月分子量測定失敗的原因

a）流動相不合適b）不揮發(fā)性鹽的影響c）成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多d)樣品濃度不夠e）pH值不合適f）樣品在源內(nèi)分解或碎裂第30頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月目標(biāo)化合物分析（1）選擇離子監(jiān)測（SIM）SIM用于檢測已知或目標(biāo)化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數(shù)據(jù)采集的方式一般用在定量目標(biāo)化合物之前，而且往往需要已知化合物的性質(zhì)。若幾種目標(biāo)化合物用同樣的數(shù)據(jù)采集方式監(jiān)測，那么可以同時測定幾種離子。第31頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）母離子掃描母離子分析可用來鑒定和確認(rèn)類型已知的化合物，盡管它們的母離子的質(zhì)量可以不同，但在分裂過程中會生成共同的子離子，這種掃描功能在藥物代謝研究中十分重要。

第32頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)中性丟失掃描中性丟失掃描分析可用來鑒定和確認(rèn)類型已知的化合物，例如新生兒遺傳疾病篩查中某些檢測項目。也可以幫助進(jìn)行未知物結(jié)構(gòu)判斷，例如有中性丟失18Da的意味著-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。第33頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月三、LC-MS的應(yīng)用醫(yī)藥學(xué)：藥物代謝、藥物動力學(xué)、雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析生物化學(xué)：肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、糖環(huán)境化學(xué)：農(nóng)藥和農(nóng)殘分析、有機(jī)污染物、土壤/食品/水分析臨床醫(yī)學(xué)：新生兒檢查、糖化血紅蛋白（糖尿?。⒀t蛋白變異、膽酸食品科學(xué)：香料、添加物、包裝物、蛋白質(zhì)、致癌物法醫(yī)學(xué)：濫用藥物、爆炸物、興奮劑檢測獸醫(yī)學(xué)：興奮劑、磺胺類藥物、抗體合成化學(xué)：有機(jī)金屬化合物、有機(jī)合成物有機(jī)化學(xué)：表面活性劑、染料第34頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月LC-MS應(yīng)用小分子化合物分析第35頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第36頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月Mesocarb(雙苯斯酮胺)

第37頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第39頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月檳榔有效成分的分析檳榔含有多種人體所需的營養(yǎng)元素和有益物質(zhì)，同時也含有多種藥理活性成分，主要包括生物堿、酚類化合物、脂肪油以及多種氨基酸和各種各樣的礦物質(zhì)等。檳榔的主要作用是由檳榔堿的功效體現(xiàn)的。檳榔堿(Arecoline)屬于生物堿，是一種含氮雜環(huán)的有機(jī)物，分子式C8H13O2N，沸點209℃，溶于醇、醚、氯仿和苯等有機(jī)溶劑，不溶于水。第40頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第41頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第42頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月1．根據(jù)“氮規(guī)律”質(zhì)量數(shù)奇數(shù)可以得到該化合物含有奇數(shù)個N原子。2．結(jié)合計算機(jī)檢索系統(tǒng)，根據(jù)同位素豐度，對于荷質(zhì)比155的分子離子峰可以得到一個環(huán)加兩個雙鍵的數(shù)值。3．由于是正離子電離方式，中性離子丟失不多，且分子離子在首先消去一個中性分子甲基后得到最穩(wěn)定的140質(zhì)量數(shù)的最高峰。同時根據(jù)Beynon表及其最小碎片質(zhì)量數(shù)42的所有可能性可以得到該化合物只能含有不超過兩個N原子。（1個）4．對于含有雙鍵和雜環(huán)的化合物，它們的分子離子比較穩(wěn)定，這從譜圖和檢索系統(tǒng)的碎片質(zhì)量數(shù)上可以得到它們的一些穩(wěn)定的碎片峰。第43頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月生物大分子分析第45頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月多電荷離子指帶有2個或更多電荷的離子，常見于蛋白質(zhì)或多肽等離子。有機(jī)質(zhì)譜中，單電荷離子是絕大多數(shù)，只有那些不容易碎裂的基團(tuán)或分子結(jié)構(gòu)-如共軛體系結(jié)構(gòu)-才會形成多電荷離子。它的存在說明樣品是較穩(wěn)定的。采用電噴霧的離子化技術(shù)，可產(chǎn)生帶很多電荷的離子，最后經(jīng)計算機(jī)自動換算成單質(zhì)/荷比離子。第46頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第47頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月 ESI在大氣壓和環(huán)境溫度下進(jìn)行，被分析物的分子在電離過程中通常產(chǎn)生多重質(zhì)子化的離子。下圖是典型的ESI質(zhì)譜圖，由一簇不同程度質(zhì)子化的分子離子峰組成，相鄰兩峰相差一個質(zhì)子。對于任意相鄰兩峰，由下列公式計算所含的質(zhì)子數(shù)(n)和樣品的分子量(M)。第48頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月13＋14+第49頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月川牛膝HPLC—MS分析第50頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月tR=17.67min的色譜峰，一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)(ESI，MS其為含量最大的峰，結(jié)合杯莧甾酮(分子量為520.3)是川牛膝的主要成分，推測該離子峰為杯莧甾酮分子加合一個甲酸根后形成的準(zhǔn)分離子峰[M+HCOO]-。又其二級碎片圖中有m/z=519.2，其應(yīng)為杯莧甾酮分子失去一個質(zhì)子形成的碎片離子峰[M-H]-。有m/z=501.4，這應(yīng)是由于甾酮類物質(zhì)中含有較多的羥基，其施加碰撞能后以水分子的形式失去而形成碎片離子峰[M-H-H2O]-。再結(jié)合其它的碎片離子與杯莧甾酮的結(jié)構(gòu)相符，因此推斷該化合物為杯莧甾酮。第51頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月tR=16.22min的色譜峰，一級質(zhì)譜數(shù)據(jù),結(jié)合川牛膝中成分b-胡羅卜苷的分子量(576.2)推測其是b-胡羅卜苷分子失去一個質(zhì)子而形成的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-。再結(jié)合b-胡羅卜苷的結(jié)構(gòu)中含有羥基以及其二級質(zhì)譜的碎片離子531.2[M-H-H2O]-,513.0[M-H-2H2O]-,431.1、341.0、233.2，與b-胡羅卜苷的結(jié)構(gòu)相符，因此推斷該化合物為b-胡羅卜苷。第52頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第53頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第54頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月麻黃類生物堿HPLC-MS第55頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第56頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第57頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)合麻黃的正離子一級質(zhì)譜全掃描圖和麻黃中三對主要生物堿的分子量(151.1、165.1、179.2)，發(fā)現(xiàn)色譜峰均為被測物質(zhì)加合一個質(zhì)子后形成的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，說明麻黃生物堿類物質(zhì)在電噴霧電離(ESI)條件下易得到質(zhì)子而帶正電荷。麻黃中的三對同分異構(gòu)體為空間異構(gòu)，因此每對物質(zhì)的二級質(zhì)譜圖是相同的。第58頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月由于麻黃中的三對同分異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)比較相似，均含有烷基、羥基等，容易失去水分子、碳分子、烷烴等而形成相應(yīng)的碎片離子峰。根據(jù)此規(guī)律，結(jié)合三對同分異構(gòu)體麻黃堿的分子量對其成分推測如下：M/Z=152.1的分子離子峰，由其質(zhì)譜數(shù)據(jù)(ESI.MS)M/Z：152.1[M+H]+、l34.1[M+H-H2O]+、l07.1[M+H-H2O-CH3-C]+、89[M+H-2H2O-CH3-C]+，因此推斷其為去甲基麻黃堿或去甲基偽麻黃堿。第59頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月m/z=166.l的分子離子峰，由其一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z：166.1[M+H]+以及二級質(zhì)譜碎片離子148.1；[M+H-H2O]+、l35.1[M+H-H2O-CH2]+、124.1，推斷其為麻黃堿或偽麻黃堿。m/z=180.1的分子離子峰，由其質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z：l62.2[M+H-H2O]+、l47.4[M+H-H2O-CH2]+、134.1[M+H-2CH2]+、l15.9[M+H-CH2-NH4]+、l03.1[M+H-H2O-CH2-C]+、88.8，推斷其為甲基麻黃堿或甲基偽麻黃堿。第60頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第61頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月第62頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月高效液相色譜―電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定清開靈復(fù)方中膽酸

采用HPLC/MS/MS技術(shù)，從清開靈注射液中，通過分子量、二級質(zhì)譜碎片信息定性測定了清開靈復(fù)方中的膽酸。直接進(jìn)樣實驗。清開靈注射液經(jīng)過初步化學(xué)處理后采用電噴霧（ESI）離子源，在負(fù)離子掃描方式下，得到一極質(zhì)譜圖、即分子離子峰[M-H]-，再用二級質(zhì)譜（MS/MS）掃描目標(biāo)分子離子的碎片峰。再以相同的實驗條件對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，做出其一級、二級