薯類種子生產基本技術-薯類種子脫毒的基本操作

《薯類種子種苗生產技術》培養(yǎng)基的配制目錄CONTENTS一二準備工作制備過程三培養(yǎng)條件一、準備工作1.儀器設備與熱源2.培養(yǎng)瓶及封口材料一、準備工作3.母液與藥品二、培養(yǎng)基制備過程（一）制備流程確定配方和配制量→計算各種母液和藥品用量→稱量（或量?。芙狻ㄈ荨{pH→分裝→封口→標記→滅菌。二、培養(yǎng)基制備過程（二）制備步驟1.確定配方和配制量2.計算C1V1=C2VX，VX=V1（C1/C2）

=V1/擴大倍數(shù)C1：培養(yǎng)基中某種物質的濃度C2：母液中某種物質的濃度V1：配制培養(yǎng)基的體積VX：需要該種物質母液的體積二、培養(yǎng)基制備過程（二）制備步驟3.稱量、混合稱量蔗糖與瓊脂，量取母液，混合。二、培養(yǎng)基制備過程（二）制備步驟4.補水、加熱、使瓊脂熔化3/4V-9/10V,加熱，邊加熱邊攪拌至瓊脂溶解5.定容、測調PH定容至V，PH6.0-6.5，0.1-1mol/LNaOH/HCl調節(jié),高溫滅菌PH下降0.5。二、培養(yǎng)基制備過程（二）制備步驟6.分裝、封口1/5-1/4V，1-2cm厚，封口，瓶蓋松緊適中7.標記二、培養(yǎng)基制備過程（二）制備步驟8.滅菌（1）設備與方法高壓蒸汽滅菌鍋及內外構造：溫度表/壓強表/壓力表、安全閥、放氣閥注：干熱滅菌（工具與玻璃容器）：160℃，3h二、培養(yǎng)基制備過程（二）制備步驟8.滅菌（2）放氣方法：一次放氣法、二次放氣法（3）溫度、壓強與時間121℃,108kPa,121℃-123℃,15-30min二、培養(yǎng)基制備過程（二）制備步驟8.滅菌（4）培養(yǎng)基的濕熱滅菌過程:檢鍋→加水→裝物，蓋鍋蓋→加熱，排盡空氣→關閉放氣閥→升溫至121℃開始計時，并適當調節(jié)熱源，維持在121℃-123℃間15-30min→關閉熱源→自然冷卻至壓強表指向“0”→先打開放氣閥，再打開鍋蓋取物，冷卻備用→倒去鍋中余水。二、培養(yǎng)基制備過程（二）制備步驟8.滅菌注：無菌培養(yǎng)基放于接種室或培養(yǎng)室冷卻凝固備用，可預培養(yǎng)3天，看是否污染，1~2周內用完?！妒眍惙N子種苗生產技術》培養(yǎng)基母液的配制與保存目錄CONTENTS一二母液及其配制方法MS培養(yǎng)基母液配制一、母液及其配制方法（一）什么是母液為了避免每次配制培養(yǎng)基都要稱量各種化學藥品，常常把培養(yǎng)基中必需的一些化學藥品，按原量的濃度增大10倍、100倍或1000倍后稱量，配成一種濃縮液，這種濃縮液就叫母液。一、母液及其配制方法（二）配制母液的優(yōu)點1.減少誤差。2.提高效率。（三）母液配制方法1.單獨配制：單一化合物母液。2.混合配制：混合化合物母液。二、MS培養(yǎng)基母液配制（一）大量元素母液的配制與保存1.配制過程：10倍，10-1g的天平。按順序依次稱量，逐一溶解于盛有600～700ml蒸餾水的燒杯中，攪拌均勻，充分溶解后，注入1000ml容量瓶中，容器沖洗2~3次，洗液也注入，定容至1L，混合均勻，貼上標簽，放于冰箱備用。

標簽樣式：母液名稱擴大倍數(shù)配制者配制日期二、MS培養(yǎng)基母液配制（一）大量元素母液的配制與保存2.保存：放于冰箱，4℃保存。3.注意事項：（1）逐一溶解，前一個溶解完全，再放下一個，嚴格按順序。避免產生沉淀。（2）藥品等級：化學純CP（三級）及分析純AR（二級）（3）天平感量：0.1g/0.01g/0.001g，即高于0.1g。（4）蒸餾水二、MS培養(yǎng)基母液配制（二）微量元素母液的配制與保存1.配制過程：100倍，10-4g的天平。按順序依次稱量，逐一溶解于盛有600～700ml蒸餾水的燒杯中，攪拌均勻，充分溶解后，注入1000ml容量瓶中，容器沖洗2~3次，洗液也注入，定容至1L，混合均勻，貼上標簽，放于冰箱備用。二、MS培養(yǎng)基母液配制（二）微量元素母液的配制與保存1.配制過程：100倍，10-4g的天平。標簽樣式：2.保存：放于冰箱，4℃保存。注：CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O，可以另外配制，1000倍母液。母液名稱擴大倍數(shù)配制者配制日期二、MS培養(yǎng)基母液配制（三）鐵鹽母液的配制與保存1.配制過程：100倍，天平10-3g。按順序依次稱量，逐一溶解于盛有600～700ml蒸餾水的燒杯中，攪拌均勻，充分溶解后，注入1000ml容量瓶中，容器沖洗2~3次，洗液也注入，定容至1L，混合均勻，貼上標簽，放于冰箱備用。標簽樣式：注：也可分別單獨溶解然后再混合，再定容。母液名稱擴大倍數(shù)配制者配制日期二、MS培養(yǎng)基母液配制（三）鐵鹽母液的配制與保存2.保存：放于冰箱，4℃保存。3.注意事項：先Na2-EDTA充分溶解后，再FeSO4·7H2O，生成螯合鐵，F(xiàn)e2+在PH6-8，仍以Fe2+形式被吸收。否則，在PH﹥5.2時，F(xiàn)e2+→Fe3+→Fe（OH）3↓二、MS培養(yǎng)基母液配制（四）有機物母液的配制與保存1.配制過程：100倍，天平10-4g。

按順序依次稱量，逐一溶解于盛有300～400ml蒸餾水的燒杯中，攪拌均勻，充分溶解后，注入500ml容量瓶中，容器沖洗2-3次，洗液也注入，定容至500ml，混合均勻，貼上標簽，放于冰箱備用。2.保存：放于冰箱，4℃保存二、MS培養(yǎng)基母液配制（四）有機物母液的配制與保存3.注意事項氨基酸、維生素和肌醇可以單獨配制（1mg/ml），大量的可以不配母液如肌醇，可以直接稱量加入。標簽樣式：母液名稱擴大倍數(shù)配制者配制日期二、MS培養(yǎng)基母液配制（五）植物生長調節(jié)物質母液配制與保存單獨配制，50ml/100ml,常用濃度1mg/ml,0.5mg/ml,配好后貼標簽放于冰箱內保存（4℃）。標簽樣式：母液名稱擴大倍數(shù)配制者配制日期二、MS培養(yǎng)基母液配制（五）植物生長調節(jié)物質母液配制與保存1.生長素母液（1）IAA、IBA、NAA：先用少量95%酒精使之充分溶解。（2）2,4－D：可用少量0.1~1mol/L的NaOH溶液充分溶解，再緩緩加蒸餾水定容至需要的體積。二、MS培養(yǎng)基母液配制（五）植物生長調節(jié)物質母液配制與保存2.細胞分裂素母液（1）KT和6-BA等細胞分裂素類：先用少量0.1~1mol/L的HCl溶解，再用蒸餾水定容至需要的體積。（2）ZT:先用少量95%酒精使之充分溶解。注：溶劑多少，熱水。二、MS培養(yǎng)基母液配制（五）植物生長調節(jié)物質母液配制與保存3.赤霉素母液GA3:先用少量95%酒精使之充分溶解?！妒眍惙N子種苗生產技術》培養(yǎng)室操作基本要求主要內容一二培養(yǎng)前準備培養(yǎng)室消毒三超凈臺消毒四洗手和著裝五培養(yǎng)過程中的無菌操作1.操作前要制定好計劃和操作程序。事先計算好有關數(shù)據(jù)。2.根據(jù)要求準備各種所需器材和物品放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。一、培養(yǎng)前準備1.地面消毒無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次，拖布要專用。二、培養(yǎng)室消毒2.全面消毒紫外線照射消毒30~50min。二、培養(yǎng)室消毒培養(yǎng)室紫外線消毒1.超凈工作臺臺面每次操作前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。三、超凈臺消毒酒精消毒臺面紫外線消毒2.一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內同時紫外線消毒。三、超凈臺消毒開始操作前要用75％酒精消毒手和前臂。如果操作過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進行原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。四、洗手和著裝1.在無菌環(huán)境進行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經過燒灼進行。五、培養(yǎng)過程中的無菌操作2.進行培養(yǎng)時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。五、培養(yǎng)過程中的無菌操作《薯類種子種苗生產技術》無菌操作技術目錄CONTENTS二二準備工作無菌操作一什么是無菌操作一、什么是無菌操作無菌操作技術即外植體的接種，是把經過表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細胞，轉放到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。二、準備工作（一）所用物品及場所

1.場所：接種室（即無菌操作室）2.所用物品：設備、試劑、接種工具、材料、培養(yǎng)基、其他二、準備工作（一）所用物品及場所

二、準備工作（二）接種室的消毒1.掃帚打掃，浸泡過來蘇爾溶液/石灰水的拖把拖地。2.70%~75%的酒精/來蘇爾溶液噴灑空氣、角落、臺面、地面。二、準備工作（二）接種室的消毒3.啟動超凈工作臺：清理臺面→70%-75%的酒精噴灑消毒→打開電源開關→打開風機吹風→打開隨機紫外燈照。二、準備工作（二）接種室的消毒4.打開室內紫外燈照射（工作人員離開），20~30min后，（工作人員）關閉室內和工作臺上紫外燈，保持暗光10min左右，打開日光燈，準備接種。二、準備工作（三）無菌操作對工作人員的要求1.工作人員自身要求：剪、洗、消毒。2.工作人員接種時應穿戴經過消毒滅菌處理的工作服、帽子、口罩、拖鞋等。3.接種期間禁止談話。三、無菌操作（一）操作過程1.雙手消毒：用70%~75%的酒精擦洗或噴洗。2.點燃酒精燈。3.支架、接種工具依次放在酒精燈外焰灼燒滅菌。三、無菌操作（一）操作過程4.用無菌的鑷子取出滅過菌的莖段。5.左手拿無菌的鑷子，右手拿無菌的手術剪/解剖刀切去與消毒劑接觸過的切口，將莖尖放于無菌紙上。三、無菌操作（一）操作過程6.在酒精燈上灼燒工具滅菌，并放于支架冷卻。7.左手拿瓶子，迅速灼燒一周，冷卻后打開瓶蓋。8.用無菌鑷子夾取莖尖插入培養(yǎng)基。三