動脈粥樣硬化免疫機制的研究進展課件（ ）

動脈粥樣硬化免疫機制

的研究進展

南華大學心血管病研究所楊永宗2005.8.15.2005-8-151動脈粥樣硬化免疫機制

的研究進展2005-8-151一、前言AS病變的炎癥性質(zhì)以及一系列炎性因子在AS病變形成中的關(guān)鍵作用幾已成為共識。但數(shù)以百計的危險因素如何啟動炎癥過程而促成AS病變發(fā)生發(fā)展卻還是個未解的問題。

天然免疫的模式識別理論的提出將開辟AS病變發(fā)生發(fā)展機理研究的新領(lǐng)域。2005-8-152一、前言AS病變的炎癥性質(zhì)以及一系列炎性因子在AS病變二、天然免疫模式識別理論要點美國免疫學家Janeway提出天然免疫的模式識別理論，強調(diào)天然免疫對獲得性免疫的指導和調(diào)控作用，指出抗原遞呈細胞（APC）是緊密地連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁。天然免疫系統(tǒng)通過APC上的模式識別受體(PRR)識別病原相關(guān)分子模式(PAMP)，區(qū)別“自己”與“非己”及無害“非己”和病原體相關(guān)“非己”,并籍抗原遞呈和共刺激信號兩個環(huán)節(jié)賦予獲得性免疫識別“自己”“非己”的能力。2005-8-153二、天然免疫模式識別理論要點美國免疫學家Janeway提出天病原相關(guān)分子模式

（pathogen-associatedmolecularpattern）

PAMP是指一大組或某幾大組病原體所共有的一種分子模式(moleculepattern)，而非某一特定結(jié)構(gòu)。PAMP是病原體的保守結(jié)構(gòu)成分且對其生存是必要的,如發(fā)生突變,將使病原體死亡或喪失致病性。PAMP不同于宿主機體自身成分。

2005-8-154病原相關(guān)分子模式

（pathogen-associatedJaneway提出模式識別理論，將天然免疫針對的主要靶分子信號稱為病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associatedmolecularpattern,PAMP），將其相應的識別受體稱為模式識別受體（patternrecognitionreceptor,PRR）。PAMP主要指廣泛存在于病原體細胞表面的分子標志，如酵母細胞壁上的甘露糖、以及各種細菌的細胞壁成分如脂多糖、多肽糖、胞壁酸等，這些分子在進化過程中都趨于保守。2005-8-1552005-8-155模式識別受體

(patternrecognitionreceptor)

與PAMP相應的識別受體稱為模式識別受體（PRR）。已克隆的PRRｓ大多屬于Toll樣受體(TLRs)家族,清道夫受體特別是SR-A1也具有PRR功能。TLRs廣泛表達在各種淋巴細胞表面，包括非特異性免疫細胞巨噬細胞、中性粒細胞、肥大細胞，和特異性免疫Ｔ淋巴細胞和Ｂ淋巴細胞。其中單核細胞分化的樹突狀細胞是唯一表達所有5種TLR的細胞,也是唯一表達TLR3的細胞。

2005-8-156模式識別受體

(patternrecognitionre1.病原微生物感染

相關(guān)病原體的研究包括肺炎衣原體、幽門螺旋桿菌、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、肝炎病毒等。其中肺炎衣原體在AS斑塊發(fā)生中的作用已有較多研究，但現(xiàn)在認為單一的病原體感染在AS中的作用可能很小，而多重感染并存則是影響心血管疾病的重要因素。2005-8-1571.病原微生物感染相關(guān)病原體的研究包括肺炎衣原體、幽門螺旋內(nèi)毒素的作用ControlGroupEndotoxinGroup2005-8-158內(nèi)毒素的作用ControlGroupEndotoxinGGroup vWF(%) tPAactivity PAIactivity

(Iu/mgprotein) (Au/mgprotein)Endotoxin 0.556±0.048* 0.227±0.048* 5.36±0.28*Control 0.100±0.050 0.643±0.080 1.25±0.40*P<0.05comparedwithcontrol.內(nèi)毒素對內(nèi)皮細胞功能的影響2005-8-159內(nèi)毒素對內(nèi)皮細胞功能的影響2005-8-159ControlCoronaryArteryfromPatient

肺炎衣原體2005-8-1510ControlCoronaryArteryfromPaA1:ControlA2:106IFUs/LAR-39B1:10mg/LLDLB2:10mg/LLDL+106IFUs/LAR-39C1:10mg/LoxLDLC2:10mg/LoxLDL+106IFUs/LAR-39肺炎衣原體對細胞膽固醇蓄積的影響2005-8-1511A1:Control肺炎衣原體對細胞膽固醇蓄積的影響200A1:對照組A2:cpnB1:LDLB2:LDL+cpnC1:ox-LDLC2:ox-LDL+cpn肺炎衣原體對C57BL/6J小鼠腹膜巨噬細胞泡沫化的影響2005-8-1512A1:對照組A2:cpn肺炎衣原體對C57BL/多重感染并存流行病學資料顯示，冠心病患病危險度與感染病原體的種類多少相關(guān)，而且存在多種感染是冠心病患者發(fā)生心肌梗死的獨立危險因素。現(xiàn)在認為單一的病原體感染在AS中的作用可能很小，而多重感染并存則是影響心血管疾病的重要因素。Circulation.2001;103:45-51.

ProspectiveStudyofPathogenBurdenandRiskofMyocardialInfarctionorDeath2005-8-1513多重感染并存流行病學資料顯示，冠心病患病危險度與感染病原體的

2.氧化修飾低密度脂蛋白A對照組B實驗組小鼠腹腔巨噬細胞豬主動脈平滑肌細胞2005-8-1514

2.氧化修飾低密度脂蛋白A對照組B人U937細胞透射電鏡照片人外周血單核巨噬細胞人THP-1細胞2005-8-1515人U937細胞透射電鏡照片人外周血單核巨噬細胞人THP-1細Proc.Natl.Acad.Sci.USAVol.92,pp.3893-3897,April1995Tlymphocytesfromhumanatheroscleroticplaquesrecognizeoxidizedlowdensitylipoprotein2005-8-1516Proc.Natl.Acad.Sci.USAVolAS患者血清和斑塊可檢測到oxLDL抗體。斑塊中分離出的CD4+T細胞可識別oxLDL。oxLDL抗體可分為IgG和IgM型。IgG抗體水平增高與AS病變程度加重相關(guān)，而IgM型oxLDL抗體與AS病變呈負相關(guān)。2005-8-1517AS患者血清和斑塊可檢測到oxLDL抗體。2005-8-15用oxLDL免疫兔可減少40%～50%AS病變，在apoE和LDLR敲除小鼠的研究中也獲得類似結(jié)果。Shaw等人用肺炎鏈球菌感染LDLR缺乏小鼠，誘導小鼠體內(nèi)高水平IgM型oxLDL抗體產(chǎn)生。伴隨脾臟內(nèi)B淋巴細胞持續(xù)分泌IgM增高，AS病變程度降低。用apoB-100肽鏈免疫apoE缺陷小鼠，可減少60%的AS病變形成，并特異性增加IgG抗體水平[7]。ArteriosclerThrombVascBiol.2003;23:879-884.

InhibitionofAtherosclerosisinApoE-NullMicebyImmunizationwithApoB-100PeptideSequences2005-8-1518用oxLDL免疫兔可減少40%～50%AS病變，在apoE和斑塊內(nèi)的OxLDL可影響DC的成熟和活化，氧化過程產(chǎn)生的溶血磷脂酰膽堿（LPC）可直接通過G蛋白偶聯(lián)受體途徑誘導DC成熟。oxLDL還可以增加DC表面呈遞抗原以及協(xié)同信號分子的表達。TheJournalofImmunology,2002,169:1688–1695.MatureDendriticCellGenerationPromotedbyLysophosphatidylcholine2005-8-1519TheJournalofImmunology,2003.熱休克蛋白HSP可與多種抗原肽結(jié)合產(chǎn)生免疫原性，誘導抗原特異性免疫反應。Berberian最先報道在人類和兔斑塊中存在HSP70，而且HSP的分布與斑塊中細胞壞死、脂質(zhì)聚集相關(guān)。Kleindienst研究表明頸動脈的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和單核細胞HSP60表達量與AS嚴重程度呈正相關(guān)。斑塊中大量存在的T淋巴細胞對HSP60/65可發(fā)生特異性反應。臨床研究也表明HSP60抗體與冠狀動脈疾病嚴重程度相關(guān)，是冠脈臨床事件發(fā)生的重要危險因素。]ArteriosclerThrombVascBiol.2002;22:1547-1559.

RoleofHeatShockProteinsinAtherosclerosis2005-8-15203.熱休克蛋白HSP可與多種抗原肽結(jié)合產(chǎn)生免疫原性，誘導抗原微生物HSP65/60和人HSP60的抗體之間存在交叉反應，抗微生物HSP65/60的抗體可以引發(fā)自身免疫反應。除了廣泛關(guān)注的肺炎衣原體和巨細胞病毒編碼HSP60與人HSP60分子模擬作用。除上述交叉反應引起免疫反應外，HSP可被TLR4識別通過天然免疫在AS發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ArteriosclerThrombVascBiol.2002;22:1547-1559.

RoleofHeatShockProteinsinAtherosclerosis2005-8-1521微生物HSP65/60和人HSP60的抗體之間存在交叉反應，4.β2糖蛋白I

β2糖蛋白Ⅰ是一種含326個氨基酸的血漿蛋白，主要合成部位在肝臟，一般以游離形式存在于血漿，少量與脂質(zhì)結(jié)合。β2GpI是抗磷脂綜合癥（APS）的主要抗原。多種炎癥性疾病，包括AS、狼瘡、APS血漿中都能檢測到抗β2GpI抗體，人AS斑塊內(nèi)也檢測到β2GPI。

DOMAINSTRUCTUREOFβ2-GLYCOPROTEINI2005-8-15224.β2糖蛋白Iβ2糖蛋白Ⅰ是一種含326個氨基酸的血漿蛋George用人β2GpI免疫LDLR-/-鼠，抗β2GpI抗體顯著增高，血管內(nèi)皮下較多CD4+T細胞浸潤，AS斑塊形成明顯加快。用β2GpI免疫apoE-/-鼠也同樣顯示斑塊形成速度加快，抗β2GpI抗體水平增高。Circulation.1998;98:1108-1115.

InductionofEarlyAtherosclerosisinLDL-Receptor–DeficientMiceImmunizedWithb2-GlycoproteinI2005-8-1523George用人β2GpI免疫LDLR-/-鼠，抗β2GpI用β2GpI免疫普通小鼠，再將其淋巴結(jié)和脾臟處的淋巴細胞注入LDLR-/-小鼠的腹腔，發(fā)現(xiàn)LDLR-/-小鼠早期AS斑塊增加。說明β2GpI通過淋巴細胞在動脈粥樣硬化的形成中發(fā)揮作用。Circulation.2000;102:1822-1827.

AdoptiveTransferofb2-GlycoproteinI–ReactiveLymphocytesEnhancesEarlyAtherosclerosisinLDLReceptor–DeficientMice2005-8-1524用β2GpI免疫普通小鼠，再將其淋巴結(jié)和脾臟處的淋四、AS與天然免疫天然免疫是機體的第一道防線，它通過天然免疫效應細胞和效應分子發(fā)揮作用。天然免疫效應細胞包括單核/巨噬細胞、NK細胞，樹突狀細胞、肥大細胞、B1細胞等；天然免疫效應分子則有炎癥介質(zhì)、補體等。單核/巨噬細胞在AS發(fā)病中具有重要地位，其他效應細胞同樣可能發(fā)揮一定作用。2005-8-1525四、AS與天然免疫天然免疫是機體的第一道防線，它通過天然免疫Kristina用半定量PCR和免疫組化方法發(fā)現(xiàn)，人AS斑塊中TLR1、TLR2、TLR4表達明顯增加，同時也伴隨有NF-κB的表達。推測TLRs在斑塊炎癥活化過程中天然免疫機制發(fā)揮作用。Circulation.2002;105:1158-1161.

ExpressionofToll-LikeReceptorsinHumanAtheroscleroticLesions:APossiblePathwayforPlaqueActivation

2005-8-1526Circulation.2002;105:1158-116

TLR信號轉(zhuǎn)導

TLR和PAPMs結(jié)合后形成二聚體,隨后轉(zhuǎn)接蛋白MyD88通過C末端的Toll/IL-1R（TIR）結(jié)構(gòu)域與TLR的胞內(nèi)段相互作用，介導LPS誘導的單核細胞或內(nèi)皮細胞NF-κB活化，激活細胞因子基因轉(zhuǎn)錄，介導共刺激信號B7分子表達，進而通過APC而活化Ｔ細胞。TLR細胞內(nèi)信號傳導分子MyD88參與AS進程。MyD88缺乏可使斑塊面積縮小，脂質(zhì)成分降低，促炎介質(zhì)以及細胞因子和趨化因子如IL-12和MCP-1的表達減少。2005-8-1527TLR信號轉(zhuǎn)導2005-8-1527Frank分別以野生型牙齦卟啉單胞菌和毒性減弱的牙齦卟啉單胞菌菌毛缺失突變體(FimA-)感染apoE-/-小鼠。感染野生型牙齦卟啉單胞菌的apoE-/-小鼠AS斑塊增加，主動脈壁TLR2和TLR4表達上調(diào)；而后者盡管在apoE-/-小鼠血液和主動脈弓組織內(nèi)檢測到FimA-突變株存在，但是沒有出現(xiàn)TLRs表達上調(diào)，斑塊病變無明顯進展；提示由TLRs介導的天然免疫在AS發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Circulation.2004;109:2801-2806.)InnateImmuneRecognitionofInvasiveBacteriaAcceleratesAtherosclerosisinApolipoproteinE–DeficientMice2005-8-1528Circulation.2004;109:2801-280清道夫受體巨噬細胞清道夫受體在生物學方面的最新進展是發(fā)現(xiàn)，它既能識別感染性非自身物質(zhì)（病原體），又能識別修飾后自身物質(zhì)(凋亡樣細胞和修飾后LDL)，是模式識別受體家族中的一員。

AS斑塊內(nèi)的巨噬細胞表達大量清道夫受體。特別是SR-A，在天然免疫，凋亡樣細胞的清除，以及組織自穩(wěn)態(tài)方面也發(fā)揮著重要作用。2005-8-1529清道夫受體巨噬細胞清道夫受體在生物學方面的最新進展是發(fā)現(xiàn)，它SR-A1轉(zhuǎn)基因鼠

轉(zhuǎn)SR-A1的C57BL/6小鼠喂養(yǎng)高脂飼料24周后，主動脈瓣膜附著處血管壁增厚，明顯的粘液樣變性，冠脈內(nèi)膜增厚，泡沫細胞聚集、中膜粘液樣變性；主動脈蘇丹Ⅳ染色表明有明顯的脂紋形成。2005-8-1530SR-A1轉(zhuǎn)基因鼠轉(zhuǎn)SR-A1的C57BL/6ControlgrouptransgenicgroupTransgenichighcholesterolgroupHighcholesterolgroup2005-8-1531ControlgrouptransgenicgroupT小鼠主動脈粥樣硬化斑塊

2005-8-1532小鼠主動脈粥樣硬化斑塊

2005-8-1532SR-AⅠ對ox-LDL誘導TPH-1細胞MMP-9表達的影響

明膠酶譜MMP-9活性1：對照2：OX-LDL3：OX-LDL+SR-AⅠ正義寡核苷酸4：OX-LDL+SR-AⅠ反義寡核苷酸5：OX-LDL+SR-AⅠ抗體123542005-8-1533SR-AⅠ對ox-LDL誘導TPH-1細胞MMP-9表達的影SR-AⅠ對ox-LDL誘導TPH-1細胞MMP-2活性影響2005-8-1534SR-AⅠ對ox-LDL誘導TPH-1細胞MMP-2活性影響SR-Ⅰ對ox-LDL誘導TPH-1細胞TIMP-1表達的影響

TIMP-1WesternBlot

1：對照2：OX-LDL3：OX-LDL+SR-AⅠ正義寡核苷酸4：OX-LDL+SR-AⅠ反義寡核苷酸5：OX-LDL+SR-AⅠ抗體123452005-8-1535SR-Ⅰ對ox-LDL誘導TPH-1細胞TIMP-1表達的影肥大細胞肥大細胞表達Fcγ-RⅠ，F(xiàn)cγ-RⅢ，TLR-2，TLR-4，作為微環(huán)境感應細胞在天然免疫和獲得性免疫都起直接作用。外源凝集素、補體活化產(chǎn)物C5a、C3a等多種刺激物均可通過Fcγ-Ⅰ激活肥大細胞。促進肥大細胞脫顆粒?；罨姆蚀蠹毎擃w粒釋放大量生物活性物質(zhì)，包括血管活性物質(zhì)、中性蛋白酶、炎癥因子和生長因子等，促進AS病變形成和破裂。2005-8-1536肥大細胞肥大細胞表達Fcγ-RⅠ，F(xiàn)cγ-RⅢ，TLR-2，Circulation.1996;94:2787-2792.)MastCellsinRupture-ProneAreasofHumanCoronaryAtheromasProduceandStoreTNF-α2005-8-1537Circulation.1996;94:2787-2792

對照組ox-LDL(48h)透射電鏡甲苯胺藍

染色2005-8-1538對照組對照組實驗組主動脈病變HE染色實驗組主動脈甲苯胺藍染色Compound48/80對apoE基因敲除鼠主動脈斑快的影響2005-8-1539對照組雖然NK細胞存在于斑塊處的直接證據(jù)很少，但最近報道NK細胞功能抑制時，LDLR-/-小鼠體內(nèi)AS病變減少，NK細胞可能有致AS的作用。

ArteriosclerThrombVascBiol.2004;24:1049-1054.DepletionofNaturalKillerCellFunctionDecreasesAtherosclerosisinLow-DensityLipoproteinReceptorNullMice2005-8-1540雖然NK細胞存在于斑塊處的直接證據(jù)很少，但最近報道NK細五、AS與抗原呈遞細胞

APC在連接天然免疫和獲得性免疫中起橋梁作用，它能攝取、加工、處理抗原并將抗原信息呈遞給淋巴細胞，促使特異性淋巴細胞活化，產(chǎn)生獲得性免疫應答。巨噬細胞、樹突狀細胞、B淋巴細胞是專職抗原呈遞細胞，內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、上皮及間皮細胞等抗原呈遞作用較弱，為非專職性抗原呈遞細胞。

2005-8-1541五、AS與抗原呈遞細胞APC在連接天然免疫和獲得性免疫中起

獲得性免疫應答需要雙信號啟動，即特異性抗原的刺激和來自抗原遞呈細胞的共刺激信號，這些信號多要APC特別走DC提供。APC通過其PRR的模式識別作用內(nèi)在化病原體，并將其加工成MHC：肽復合物，之后遞呈給Th細胞，并且只有在將某一物質(zhì)識別為有害物后才表達共刺激信號Ｂ7分子。

2005-8-15422005-8-1542人和鼠AS斑塊均可檢測到DC，并且DC與T淋巴細胞同時存在于易破裂的斑塊肩部。DC還可能通過抗原呈遞作用刺激T淋巴細胞活化，影響斑塊的穩(wěn)定性。DC在攝取微環(huán)境中的抗原后進一步分化成熟，促進T淋巴細胞活化，激活獲得性免疫反應。JPathol.2002Dec;198(4):511-6.HumanatheroscleroticplaquesexpressDC-SIGN,anovelproteinfoundondendriticcellsandmacrophages.2005-8-1543人和鼠AS斑塊均可檢測到DC，并且DC與T淋巴細胞同時存在于六、AS與獲得性免疫2005-8-1544六、AS與獲得性免疫2005-8-1544Zhou等將apoE-/-鼠與scid/scid免疫缺陷小鼠雜交其后代小鼠大動脈斑塊面積與apoE-/-鼠相比減少73％，而將apoE-/-鼠CD4＋T細胞移植到apoE-/-/scid/scid小鼠體內(nèi)，斑塊增加164％。

Circulation.2000;102:2919-2922.TransferofCD41TCellsAggravatesAtherosclerosisinImmunodeficientApolipoproteinEKnockoutMice2005-8-1545Zhou等將apoE-/-鼠與scid/sc七、AS臨床事件與免疫反應

免疫細胞在斑塊部位的聚集，提示免疫在AS發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起作用。Yuri發(fā)現(xiàn)，NKT細胞和DC在AS斑塊肩部聚集，CD1+NKT細胞參與AS斑塊的破裂，推測NKT細胞和DC間存在直接的聯(lián)系，共同參與AS斑塊破裂過程。JHistochemCytochem.2005Jun;53(6):781-5.Co-accumulationofdendriticcellsandnaturalkillerTcellswithinrupture-proneregionsinhumanatheroscleroticplaques.2005-8-1546七、AS臨床事件與免疫反應免疫細胞在斑塊部位的聚集，提示免而INF-γ抑制膠原合成，抑制SMCs增殖，還可以與TNF-α和IL-1一起促進SMCs凋亡，使纖維帽變薄，易于破裂。免疫介質(zhì)可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶、組織蛋白酶和肥大細胞蛋白水解酶可降解纖維帽膠原的釋放影響斑塊的穩(wěn)定。

2005-8-1547而INF-γ抑制膠原合成，抑制SMCs增殖，還可以與TNF-人AS晚期病變中T細胞數(shù)量占細胞總數(shù)的10％到20％，同時表達CD3、CD4和T細胞抗原受體（TCRαβ+）的T細胞占所有CD3+T細胞的比例高達2/3（在apoE-/-鼠中可超過90％）。AS的大部分臨床并發(fā)癥都涉及血栓形成，T細胞在AS斑塊破裂處聚集可引發(fā)致命性的動脈粥樣血栓形成。先天性免疫介質(zhì)可影響血栓形成的一些環(huán)節(jié)，組織因子（TF）是動脈粥樣血栓形成的主要因子，LPS、TNF-α、IL-1、INF-γ和PTX-3都可誘導人ECs表達TF，CD40L可誘導單核巨噬細胞表達TF。2005-8-1548人AS晚期病變中T細胞數(shù)量占細胞總數(shù)的10％到20％，同時表而在動脈粥樣瘤內(nèi)Mφ、Ecs、SMCs和活化的血小板都可以表達CD40L[42]?？扇苄约毎蜃尤鏘L-1和TNF-α可改變纖維酶原激活物的活性，也可改變凝