基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫與運(yùn)用課件

基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫與運(yùn)用基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫

講課內(nèi)容三、人類遺傳物質(zhì)的差異--基因多態(tài)性二、導(dǎo)致人類表型多樣性的原因四、SNPs概論五、SNPs數(shù)據(jù)庫構(gòu)建六、SNPs實(shí)驗(yàn)分析技術(shù)七、SNPs實(shí)驗(yàn)分析中的問題八、實(shí)際工作中SNPs的選擇原則一、人類表型的多樣性九、SNPs數(shù)據(jù)庫使用流程演示講課內(nèi)容三、人類遺傳物質(zhì)的差異--基因多態(tài)性二、導(dǎo)致人類表一、人類表型的多樣性一、人類表型的多樣性基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫與運(yùn)用課件基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫與運(yùn)用課件遺傳背景一致性和部分表型的差異遺傳背景一致性和部分表型的差異二、導(dǎo)致人類表型的多樣性的原因生存環(huán)境因素的影響

自然條件文化背景生活與飲食習(xí)慣社會(huì)體制………2.自身遺傳物質(zhì)的作用

基因的功能和調(diào)節(jié)非編碼DNA序列的影響表觀遺傳的作用上位抑制的影響多態(tài)性位點(diǎn)的存在………

二、導(dǎo)致人類表型的多樣性的原因基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫與運(yùn)用課件基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫與運(yùn)用課件基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫與運(yùn)用課件血緣關(guān)系與患病風(fēng)險(xiǎn)示意圖血兩個(gè)重要的容易混淆的概念1.易感性(Susceptibility)

一個(gè)個(gè)體僅在遺傳因素的作用下罹患某種疾病的風(fēng)險(xiǎn)。2.易患性(Liability)

一個(gè)個(gè)體在遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用下罹患某種疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

兩個(gè)重要的容易混淆的概念1.易感性(Susceptibil常用的遺傳學(xué)研究資源和數(shù)據(jù)庫1GeneticAssociationDatabase:Anarchiveofhumangeneticassociationstudiesofcomplexdiseases.

/2SchizophreniaGeneDatabase:Anarchiveofgeneticassociationstudiesperformedonschizophreniaphenotypes.

/res/sczgene/default.asp

3OnlineMendelianInheritanceinMan:Acatalogueofhumangenesdisorders.

/sites/entrez?db=OMIM&

4HumanGeneMutationDatabase.Acatalogueofpublishedgeneresponsibleforhumaninheriteddisease.

http://www.hgmd.cf.ac.常用的遺傳學(xué)研究資源和數(shù)據(jù)庫1GeneticAssoci5HumanGenomeVariationDatabase:Acatalogueofnormalhumangenomevariation.

/

6dbSNP:Acatalogueofhumansinglenucleotidepolymorphisms.

/projects/SNP/

7GeneSNPs:Adatabaseofpolymorphismsinhumangenesthatarearoleinsusceptibilitytoenvironmentalexposure.

/genesnps/

8PharmGKB:Adatabaseofpharmacogenomicsresearch.

/index.jsp

9GeneCards:Adatabaseofhumangenesthatincludesgenomic,proteomictranscriptomicinformation,aswellasorthologies,diseaserelationships,geneexpressionandgenefunction.

/

5HumanGenomeVariationDatab常用的候選基因分析軟件和工具GeneSeeker

http://www.cmbi.ru.nl/GeneSeeker/GFSST

Endeavour

http://www.esat.kuleuven.be/endeavour

POCUShttp://www.hgu.mrc.ac.uk/Users/Colin.Semple/

G2D

http://www.ogic.ca/projects/g2d_2/

SUSPECTS

http://www.genetics.med.ed.ac.uk/suspects/

TOM

http://www-micrel.deis.unibo.it/~tom/

BioMercator

http://moulon.inra.fr/~bioinfo/BioMercator

GFINDer

http://www.bioinformatics.polimi.it/GFINDer/

PROSPECTR

http://www.genetics.med.ed.ac.uk/prospectr/

QTLMixer

http://qtl.pzr.uni-rostock.de/qtlmix.php

CoGenT++

http://cgg.ebi.ac.uk/cogentpp.html

SNPs3D

http://www.SNPs3D.org

PhD-SNP

http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/PhD-SNP/

……常用的候選基因分析軟件和工具GeneSeekerhtt一個(gè)基因可以具有多個(gè)不同的表達(dá)模式一個(gè)蛋白質(zhì)可以具幾種不同的結(jié)構(gòu)和功能衍生物現(xiàn)以脂蛋白酯酶基因(LPL)為例進(jìn)行說明LPL是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，目前發(fā)現(xiàn)其具有四種剪切模式4AlternativeSplicingDatabase(ASD)splicepatterns(SP)forLPL.doc一個(gè)基因可以具有多個(gè)不同的表達(dá)模式現(xiàn)以脂蛋白酯酶基因(LPLGeneticControlofGeneExpressioninVariousTissues.NEnglJMed2009;360:1759-68.GeneticNEnglJMed三、人類遺傳物質(zhì)的差異基因多態(tài)性1.人類自身遺傳物質(zhì)99.8%是完全一致的2.人類自身遺傳物質(zhì)的差異大約為0.2%其中：在核苷酸堿基水平上約占0.80%比如：堿基的替換、點(diǎn)突變、堿基的插入或缺失、SNPs等

在基因組結(jié)構(gòu)水平上約占0.20%

(包括片段的插入、缺失、倒置、移位、互換等)比如：2-1000bp片段：微衛(wèi)星、小衛(wèi)星等1kbp-亞顯微結(jié)構(gòu)：拷貝數(shù)量多態(tài)性等顯微-亞染色體結(jié)構(gòu)：片段的非整倍體等整條染色體-全基因組：染色體互換或非整倍性等

3.30億個(gè)堿基對中95%為非編碼序列，5%為蛋白編碼序列三、人類遺傳物質(zhì)的差異基因多態(tài)性1.人類自身遺NatGenet.2007,39(7Suppl):S7-S15NatGenet.2007,SingleNucleotidePolymorphisms

(SNPs)SingleNucleotidePolymorphism微衛(wèi)星(MicrosatelliteMarkers)Variablenumbersoftandemrepeats(2,3,4)basesUniqueprimersfor400markersStutterduetoslippageofpolymeraseMarker-dependent,variablestuttermorphologyAlsoCalled--ShortTandemRepeat(STR)微衛(wèi)星(MicrosatelliteMarkers)VFourColorDetectionwithFilterSetIIFourColorDetectionwithFiltMegaBACEGenotypeMegaBACEGenotypeFatherMotherChildtgtcatgctagattCACACAggttcgtagtcagtgtcatgctagattCACACACACACACAggttcgtagtcagFatherMotherChildtgtcatgctagat微衛(wèi)星運(yùn)用例證1：原發(fā)性習(xí)慣性流產(chǎn)遺傳位點(diǎn)的研究微衛(wèi)星運(yùn)用例證1：原發(fā)性習(xí)慣性流產(chǎn)遺傳位點(diǎn)的研究基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫與運(yùn)用課件基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫與運(yùn)用課件基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫與運(yùn)用課件ReproductiveSciencesVol.17No.6June2010578-584ReproductiveSciencesVol.17微衛(wèi)星運(yùn)用例證2：親子鑒定母子父微衛(wèi)星運(yùn)用例證2：親子鑒定母子父基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫與運(yùn)用課件CopyNumberVariants(CNVs)CopyNumberVariants(CNVs)野生型DNA片段DNA片段的缺失

DNA片段的插入ABCABCABNACBDNA片段的倒置BACGHIGHICDNA片段的移位GABHCIDNA片段的互換DNA片段多態(tài)性野生型DNA片段DNA片段的缺失DNA片段的插入ABCABManyvariantswithsmalleffects,asmallernumberwithintermediateeffectsandrelativelyfewwithlargeeffects.NatRewGenet,2005,[6(2)]109-118AnL-shapedorexponentialdistributionofvariantseffectsizeshaswidesupport.Manyvariantswithsmalleffec88%oftrait-associatedSNPs(TASs)wereintronic(45%)orintergenic(43%),

12%locatedin,oroccurintightlinkagedisequilibriumwith,protein-codingregionsofgenes.NEnglJMed2010;363:166-76.PNAS,2009[106(23)]9362-936788%oftrait-associatedSNPs(四、SNPs概論1.定義：單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP,發(fā)音為“snip”)是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。2.特征：是最常見的一種變異，約占所有已知多態(tài)性的40%；分布廣，1個(gè)/300~1000個(gè)堿基對,總數(shù)可能＞2470萬；由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所導(dǎo)致；轉(zhuǎn)換的發(fā)生率較高，SNP中轉(zhuǎn)換型變異者約占2/3；(可能是因?yàn)镃pG二核苷酸上的胞嘧啶殘基最易發(fā)生突變，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶)SNP基本上表現(xiàn)為二等位多態(tài)性；根據(jù)SNP在基因中的位置，可分為基因編碼區(qū)SNPs(Coding-regionSNPs,cSNPs)、基因周邊SNPs(PerigenicSNPs,pSNPs)以及基因間SNPs(IntergenicSNPs,iSNPs)等三類；四、SNPs概論

位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(codingSNP,cSNP)比較少，又可分為2種：同義(synonymous)cSNP和非同義(non-synonymous)cSNP，參與蛋白質(zhì)編碼；位于非編碼區(qū)內(nèi)的SNP比較多，其變異率是cSNP的5倍，參與基因表達(dá)的調(diào)控；先形成的SNP在人群中常有較高的頻率，而后形成的SNP頻率較低；3.現(xiàn)有SNP在白色、黑色和黃色人種中的分布頻率＜20%，占7%；實(shí)驗(yàn)無法證實(shí)者，占17%；在一個(gè)人種中頻率≥20%，占76%；在二個(gè)人種中頻率≥20%，占53%；在三個(gè)人種中頻率≥20%，占27%；位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(codingSNP,cSNP)比OccurrenceofSNPsintheHumanPopulationandTheirRepresentationintheCurrentCollectionNatureGenetics2001,27:234-236

OccurrenceofSNPsintheHuma基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫與運(yùn)用課件4.SNPs網(wǎng)上資源主要有:NIH的dbSNP多態(tài)性數(shù)據(jù)庫:/SNP德國的HGBAS網(wǎng)站的人類SNP數(shù)據(jù)庫:hgbas.cgr.ki.sei日本建立的JSTSNP數(shù)據(jù)庫:snp.ims.utolkyo.ac.jpNIH的與癌癥和腫瘤相關(guān)的候選SNP數(shù)據(jù)庫:/GAIFastSNPSearch:.twPerlegenBrowser:UCSCGenomeBioinformaticsSite:美國Utah大學(xué)SNP數(shù)據(jù)庫：美國波士頓兒童醫(yī)院SNP數(shù)據(jù)庫：SNP聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫：英國Sanger研究所：www.sanger.ac.ukHapMapHomepage:EnsemblGenomedatabasesandtools:……4.SNPs網(wǎng)上資源主要有:5.NIH的dbSNP多態(tài)性數(shù)據(jù)庫:/SNP

dbSNP的挑選方式和不足：60%的“候選”SNPs是通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法預(yù)測出來的即通過比較重疊克隆中的DNA序列痕跡來確定“候選”SNPs。因此，大多數(shù)的dbSNP是頻率未知的“候選”SNPs。

總數(shù)量約為2470萬個(gè)SNPs；

三大來源：SNP聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫：英國Sanger研究所：www.sanger.ac.uk美國WashingtonUniversity,St.Louis

設(shè)立的參照SNP(Reference_SNP)＞400萬個(gè),采用rs+數(shù)字編號來表示；

5.NIH的dbSNP多態(tài)性數(shù)據(jù)庫:www.ncbi.nl可從多個(gè)路徑查找SNPs:Humangenomeresources,mapview,Genebank等等；dbSNP的質(zhì)量：已經(jīng)證實(shí)的Ref_SNPs,大約有400萬個(gè)非人類的SNPs,大約有216萬個(gè)無法證實(shí)的SNPs,大約有184萬個(gè)在某一群體中不是多態(tài)性的,大約有152萬個(gè)在某一群體中頻率＜20%的,大約有126萬個(gè)被證實(shí)的其頻率＞20%的SNPs,大約有63萬個(gè)可從多個(gè)路徑查找SNPs:Humangenomeres五、SNPs數(shù)據(jù)庫構(gòu)建1.生物信息數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建與獲取圖1數(shù)據(jù)庫的建立：采用數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換技術(shù)將不同格式、來源的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為同一格式，從而建立單一的大數(shù)據(jù)庫。NatRevGenet.2003[4(5)]337-345五、SNPs數(shù)據(jù)庫構(gòu)建1.生物信息數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建與獲取圖1圖2連點(diǎn)和節(jié)點(diǎn)。運(yùn)用連點(diǎn)和節(jié)點(diǎn)方法將各自獨(dú)立的資源整合起來，對于一些重要的關(guān)聯(lián)信息比如同源基因，則采取特定數(shù)據(jù)庫的方式儲存起來。NatRevGenet.2003[4(5)]337-345圖2連點(diǎn)和節(jié)點(diǎn)。運(yùn)用連點(diǎn)和節(jié)點(diǎn)方法將各自獨(dú)立的資源整合圖3生物數(shù)據(jù)庫的結(jié)構(gòu)和獲取絕大多數(shù)生物數(shù)據(jù)庫采用三層結(jié)構(gòu)模式：第一層的數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)(底層)第二層的中間設(shè)備，包括獲取數(shù)據(jù)的軟件和網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(中層)第三層的網(wǎng)絡(luò)瀏覽器(高層)，即用戶。NatRevGenet.2003[4(5)]337-345圖3生物數(shù)據(jù)庫的結(jié)構(gòu)和獲取2.SNP生物信息分析2.1分析的參數(shù)或指標(biāo)挑選擬進(jìn)行分析的基因及其DNA序列的長度，比如5’端上游5000bp+整個(gè)基因序列+3’端下游5000bp,要求包含兩端的非轉(zhuǎn)錄區(qū)(UTR)。在上述堿基范圍內(nèi)，尋找獲取下列的信息：所有SNP的信息:位置、群體中的頻率標(biāo)記SNP(Tag_SNP)的情況:位置、群體中的頻率基因外顯子的信息:位置、方向、大小轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)信息:名稱、位置、數(shù)目甲基化位點(diǎn)CpG的信息:位置、數(shù)目進(jìn)化保守區(qū)的信息:名稱、位置、數(shù)目、大小單倍型信息:位置、數(shù)目、大小參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的序列簇信息:名稱、位置、數(shù)目、大小(比如增強(qiáng)子、沉默子和microRNAs結(jié)合域等)2.SNP生物信息分析2.2涉及的數(shù)據(jù)庫或網(wǎng)絡(luò)資源在/獲得SNP、CpG、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)信息在/獲得進(jìn)化保守區(qū)的信息在/index.html獲得基因外顯子的信息在/獲得標(biāo)記SNP(Tag_SNP)、單倍型的信息在/browser/index_v2.html獲得SNP、單倍型的信息在/cluster-buster/index.html獲得參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的序列簇信息………………2.2涉及的數(shù)據(jù)庫或網(wǎng)絡(luò)資源2.3

SNP信息分析方法和結(jié)果的評判分析方法：Cygwinanalysisprogram。該程序通過對基因序列的生物信息進(jìn)行綜合分析，尋找可能具有各種功能的多態(tài)性位點(diǎn)，為遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究提供參考數(shù)據(jù)或功能信息，對復(fù)雜性疾病易感基因的研究工作很有幫助。運(yùn)行的前提條件：1.在Perl語言環(huán)境中進(jìn)行分析。Perl是PracticalExtractionandReportLanguage(實(shí)用摘錄和報(bào)告語言)的簡稱，是一種最廣泛應(yīng)用于語法分析和WorldWideWeb的編程語言。2.擬分析的參數(shù)或指標(biāo)，必須進(jìn)行格式調(diào)整，滿足Cygwinanalysisprogram的要求。3.需要事先編寫好2個(gè)參數(shù)分析和整合程序。3.1運(yùn)行cross_ref_SCORED.pl可以得到重疊區(qū)域生物信息學(xué)文件3.2運(yùn)行merge_per_hap.pl可以得到整合了單倍型信息后的文件4.將基因外顯子信息加入其中，進(jìn)行重新排列后，獲得最終的生物學(xué)信息分析結(jié)果。2.3SNP信息分析方法和結(jié)果的評判生物信息學(xué)分析結(jié)果例證–中國漢族群體LPL基因SNP生物學(xué)信息ECR:EvolutionaryConservedRegions;Tag:標(biāo)記;轉(zhuǎn)錄因子:MYCMAX,NMY;Cluster:調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的序列簇;CpG:甲基化位點(diǎn)3’splicejunction:外顯子3’端剪切位點(diǎn);MAF:弱勢等位基因頻率生物信息學(xué)分析結(jié)果例證–中國漢族群體LPL基因SNP生物學(xué)六、SNP實(shí)驗(yàn)分析技術(shù)基于PCR技術(shù)與其它方法相結(jié)合的檢測方法(獲得較普遍的應(yīng)用)1.1通量相對較小者：

測序、限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、連接酶檢測反應(yīng)法(ligasedetectionreaction,LDR)。1.2通量相對較大者：

變性-高效液相色譜(DHPLC)、Pyrosequencing、Ecotilling、基因芯片/陣列分析技術(shù)(genechips)、微球法(Illumina)、質(zhì)譜分析、高分辨溶解曲線分析(HighResolutionMelting,HRM)。

六、SNP實(shí)驗(yàn)分析技術(shù)基于PCR技術(shù)與其它方法相結(jié)合的檢測方2.以分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測方法(沒有獲得較普遍的應(yīng)用)

寡核苷酸連接分析(OLA)、動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)、等位基因特異寡核苷酸片段分析(ASO)和突變錯(cuò)配擴(kuò)增檢驗(yàn)(MAMA)。3.以熒光定量PCR為基礎(chǔ)檢測方法(獲得較普遍的應(yīng)用)

TaqMan探針法、SNPlex基因分型法、分子信標(biāo)(Molecularbeacon)和FRET(HybProbe)。4.SNPs的功能性研究手段

比較成熟的對啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)SNPs功能性研究的技術(shù)包括：①報(bào)告基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。主要用于研究啟動(dòng)子SNPs對于mRNA轉(zhuǎn)錄效率的影響，通過觀察轉(zhuǎn)錄結(jié)局來判斷SNPs是否具有功能。報(bào)告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。通過把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形2.以分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測方法(沒有獲得較普遍的應(yīng)用)成嵌合基因或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行目的基因表達(dá)。作為報(bào)告基因，必須具有如下幾個(gè)特征：(1)全序列已被測定；(2)表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中不存在、且在受體細(xì)胞中無相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物即無背景；(3)可以對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行定量測定。②凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)(electrophoreticmobilityshiftassays,EMSA)?；驹硎堑鞍踪|(zhì)可以與末端標(biāo)記的核酸探針結(jié)合，電泳時(shí)這種復(fù)合物比無蛋白結(jié)合的探針在凝膠中泳動(dòng)的速度慢，即表現(xiàn)為相對滯后。該方法可用于檢測DNA結(jié)合蛋白、RNA結(jié)合蛋白，并可通過加入特異性的抗體（supershift）來檢測特定的蛋白質(zhì)，并可進(jìn)行未知蛋白的鑒定。但是由于許多轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白有相似或相同的DNA結(jié)合位點(diǎn)，這種體外分析獲取的結(jié)果不一定能真實(shí)地反映體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和DNA結(jié)合的狀況。成嵌合基因或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行放射自顯影蛋白質(zhì)A、B、C****凝膠電泳放射性標(biāo)記的DNA蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合****BDNA-蛋白質(zhì)結(jié)合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合*凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)的原理示意圖放射性標(biāo)記的DNA因與蛋白質(zhì)B結(jié)合，顧而在凝膠電泳中移動(dòng)速度變慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶。放射自顯影蛋白質(zhì)A、B、C****凝膠電泳放射性標(biāo)記的DNA③染色質(zhì)免疫沉淀分析(chromatinimmunoprecipitationassay,ChiP)?；驹硎窃诨罴?xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。它能真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白，是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的一種很好的方法。

然而，對于功能性研究結(jié)果的評價(jià)還需要綜合SNPs所在序列信息、進(jìn)化保守性、群體遺傳學(xué)、實(shí)驗(yàn)功能性研究、暴露評價(jià)(如基因-環(huán)境交互作用研究)和流行病學(xué)證據(jù)，最后依據(jù)可以獲得的各種證據(jù)來作出科學(xué)的評判。

一般情況下，可將SNPs是否具有功能效應(yīng)分為三類：功能性、潛在功能性和非功能性。③染色質(zhì)免疫沉淀分析(chromatinimmunopr5.幾種常用的SNPs擴(kuò)增分析技術(shù)及其特點(diǎn)5.1限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)

技術(shù)原理是檢測DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位點(diǎn)變異的突變?nèi)琰c(diǎn)突變(新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn))和一段DNA的重新組織(如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長度發(fā)生變化)等均可導(dǎo)致RFLP的產(chǎn)生。酶切反應(yīng)后凝膠電泳分析結(jié)果示意圖Marker123

2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpAAAGGG＝RestrictionsiteGG:完全酶切AG:部分酶切AA:不能酶切5.幾種常用的SNPs擴(kuò)增分析技術(shù)及其特點(diǎn)酶切反應(yīng)后凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)：方法簡單、容易操作、經(jīng)費(fèi)要求不高。缺點(diǎn)：樣品純度要求較高和用量大、過分依賴于限制性內(nèi)切酶的種類和數(shù)量、分析步驟繁瑣、工作量大、分型容易出錯(cuò)、通量較小。5.2TaqMan探針熒光定量PCR

技術(shù)原理：探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)如FAM、VIC等，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5’→3’外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。在探針的5’端使用不同的Report熒光基團(tuán)，單一PCR中可以檢測到多個(gè)探針的雜交與相應(yīng)熒光。只有與模板完全匹配的TaqMan探針在與等位基因發(fā)生特異性雜交后，利用Taq酶的5’外切酶活性作用使得探針的5’Report熒光能夠被檢測。優(yōu)點(diǎn)：方法簡單、容易操作、經(jīng)費(fèi)要求不高。5.2TaqManTaqMan探針法原理示意圖TaqMan探針法結(jié)果報(bào)告示意圖結(jié)果報(bào)告示意圖優(yōu)點(diǎn)：方法簡單、容易操作、靈敏，特異性高、可在同一管內(nèi)檢測多重PCR、避免了熒光染料對PCR反應(yīng)的影響、效率和準(zhǔn)確性高、通量大、分析和PCR擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行。缺點(diǎn)：探針設(shè)計(jì)有一定難度，需要驗(yàn)證效果，探針的合成和雙熒光標(biāo)記成本高。5.3變性-高效液相色譜(DHPLC)

原理是利用離子對反向高效液相色譜原理，通過一個(gè)DNA分離柱，進(jìn)行核苷酸片段的分離和分析。將DNA樣品注入到DNA分離柱上，在緩沖液中的橋分子三乙基胺(triethylammoniumacetate，TEAA)的輔助下而被吸附到固相柱基質(zhì)上；乙腈(acetonitrile)則可以破壞三乙基胺這一作用。隨著緩沖液中乙腈濃度逐漸升高，DNA依次從柱上洗脫下來。在合適的變性溫度下，有突變的異源雙鏈要比相應(yīng)的同源雙鏈柱保留時(shí)間短而被先洗脫下來；不同序列的DNA同源雙鏈的柱保留時(shí)間也有差異。因此，帶有突變序列的樣品呈現(xiàn)出異源和同源雙鏈混合物的峰型特點(diǎn)，而不含突變序列的樣品則只有同源雙鏈的峰型。優(yōu)點(diǎn)：方法簡單、容易操作、靈敏，特異性高、可在同一管內(nèi)檢測多

DHPLC能以三種方式操作:1.不變性溫度條件下(50℃)，色譜儀類似凝膠電泳儀，可分離分子量不同的雙鏈DNA分子或分析具有長度多態(tài)性的片段，類似RFLP分析，也可進(jìn)行定量RT-PCR及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性測定(MSI)。2.在充分變性溫度條件下(80℃)，單鏈DNA或RNA分子能被區(qū)分，適用于寡核苷酸探針合成純度分析和質(zhì)量控制。3.在部分變性的溫度條件下，變異型和野生型的PCR產(chǎn)物經(jīng)過變性復(fù)性過程，不僅分別形成同源雙鏈，同時(shí)也錯(cuò)配形成異源雙鏈，根據(jù)柱子保留時(shí)間的不同將同源雙鏈和異源雙鏈分離，從而識別變異型。優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性較高(未知突變大于96%，已知突變大于99%)、靈敏度高(少至5%的基因型)、操作容易、自動(dòng)化分析、結(jié)果重復(fù)性高，速度快、樣品通量高。缺點(diǎn)：DNA分離柱需要定期更換、成本較高、需要先做好PCR擴(kuò)增。DHPLC能以三種方式操作:1.不變性溫度5.4高分辨溶解曲線分析(HighResolutionMelting,HRM)

技術(shù)原理在PCR反應(yīng)前將LCGreen熒光染料與反應(yīng)Buffer、引物、模板DNA混合(使LCGreen染料飽和加入，LCGreen熒光染料對PCR不會(huì)有任何抑制作用)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；然后將PCR產(chǎn)物(96孔板或者384孔板)直接放入LightScanner或HR-1儀器中，在一定的溫度范圍內(nèi)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性，在此期間，儀器的光學(xué)檢測系統(tǒng)采集密集的熒光信號變化并繪制溫度熔解曲線，根據(jù)曲線準(zhǔn)確區(qū)分野生型、雜合突變、純和突變，軟件自動(dòng)分型。優(yōu)點(diǎn)：快速(5分鐘)、高通量、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性好、操作簡便。缺點(diǎn)：LCGreen熒光染料價(jià)格較高、需要先做好PCR擴(kuò)增。5.4高分辨溶解曲線分析(HighResolution左圖中A，LightScanner一次掃描多個(gè)PCR產(chǎn)物，直接判定純合突變并可以區(qū)分不同的SNP，溫度熔解順序?yàn)锳/A<T/T<C/C<G/G。左圖中B，LightScanner一次掃描多個(gè)PCR產(chǎn)物，直接判定雜合突變和純合突變并進(jìn)行不同SNP分型。HRM分析結(jié)果示意圖左圖中A，LightScanner一次掃描多個(gè)PCR產(chǎn)物，直5.5測序分析

測序的基本原理是Sanger末端終止法，在酶的作用下將原本是一條長達(dá)數(shù)百堿基的片斷擴(kuò)增成數(shù)百條片斷，彼此間相差一個(gè)堿基。用電泳分離這些片斷后，再通過測序儀將這些信號轉(zhuǎn)變成峰圖，從而最終形成客戶所看到的測序序列和測序的峰圖。優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確、是金標(biāo)準(zhǔn)。缺點(diǎn)：通量小、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、價(jià)格高、也會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤。5.5測序分析優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確、是金標(biāo)準(zhǔn)。5.6基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI－TOF)原理：通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后加入SNP序列特異延伸引物，在SNP

位點(diǎn)上，延伸1個(gè)堿基。將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空管,而后用瞬時(shí)納秒(10-9s)強(qiáng)激光激發(fā)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，核酸分子就會(huì)解吸附并轉(zhuǎn)變?yōu)閬喎€(wěn)態(tài)離子，產(chǎn)生的離子多為單電荷離子，這些單電荷離子在加速電場中獲得相同的動(dòng)能，進(jìn)而在一非電場漂移區(qū)內(nèi)按照其質(zhì)荷比率加以分離，在真空小管中飛行到達(dá)檢測器，離子質(zhì)量越小，就越快到達(dá)。特點(diǎn)：高通量、準(zhǔn)確性高、簡單、靈活、靈敏度高5.6基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI－TOF分析流程圖1分析流程圖1分析流程圖2分析流程圖2數(shù)據(jù)截圖1

數(shù)據(jù)截圖1數(shù)據(jù)截圖2數(shù)據(jù)截圖25.7常用SNP檢測技術(shù)小結(jié)質(zhì)譜分析法限制性片段長度多態(tài)性分析法實(shí)時(shí)熒光PCR分析法單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(SSCP)異源雙鏈分析法(HA)變性梯度凝膠電泳法(DGGE)DNA測序法(DNAsequencing)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)………………5.8飛行時(shí)間質(zhì)譜VSTaqman基因分型VSBeadstation基因分型.doc5.7常用SNP檢測技術(shù)小結(jié)質(zhì)譜分析法5.8飛行時(shí)間質(zhì)譜七、SNPs實(shí)驗(yàn)分析中的問題最常見和最嚴(yán)重的問題是基因型分型錯(cuò)誤(GenotypingErrors)a.1989年以來報(bào)道的與基因分型有關(guān)的論文數(shù)量。b.1989年以來與基因分型有關(guān)的領(lǐng)域及其百分率。NatRevGenetg2005[6(11)]847-859七、SNPs實(shí)驗(yàn)分析中的問題最常見和最嚴(yán)重的問題是基因型分型基因分型錯(cuò)誤和影響:一起案例GagneuxP,WoodruffDS,BoeschC.Furtivematinginfemalechimpanzees.Nature.1997May22;387(6631):358-359GagneuxP,BoeschC,WoodruffDS.MicrosatellitescoringerrorsassociatedwithnoninvasivegenotypingbasedonnuclearDNAamplifiedfromshedhair.MolEcol.1997Sep;6(9):861-868Retraction:Furtivematinginfemalechimpanzees.Nature.2001Nov29;414(6863):508.Alltypesofmolecularmarkerarepronetogenotypingerror,includingsequencedata.基因分型錯(cuò)誤和影響:一起案例GagneuxP,Wood1導(dǎo)致基因分型錯(cuò)誤的原因

NatRevGenet2005[6(11)]847-859DNA分子的相互影響樣本質(zhì)量差1導(dǎo)致基因分型錯(cuò)誤的原因NatRevGenet2生化和儀器假象生化和儀器假象Nullallele:anon-amplifyingallelethatisduetoamutationintheprimertargetsequence;Allelicdropout:thestochasticnon-amplificationofanallele,thatis,amplificationofonlyoneofthetwoallelespresentataheterozygouslocus;Mistakenallele:anallelethatdoesnotcorrespondtothetrueallele,excludingthenullallele,allelicdropoutandfalseallele.Falseallele:allele-likePCR-generatedartifact;Tm:meltingtemperature.人為因素Nullallele:anon-amplifying2減少基因分型錯(cuò)誤及其影響的措施

2.1通用建議首先，依據(jù)樣本質(zhì)量和擁有的研究技術(shù)來確定基因分型的可行性。其次，采用預(yù)實(shí)驗(yàn)來發(fā)現(xiàn)理論與實(shí)際的出錯(cuò)率以及是否可以耐受。最后，對實(shí)驗(yàn)的全過程進(jìn)行質(zhì)量控制。2.2降低分型流程中的錯(cuò)誤率★僅熟練的研究科學(xué)家或技術(shù)人員參與其中。★僅使用標(biāo)準(zhǔn)的和有效的操作指南?！锉M量減少人為因素或操作的影響?！锵到y(tǒng)性的采用適當(dāng)數(shù)量的陽性和陰性對照?！镞\(yùn)用5%-10%的樣本進(jìn)行盲性重復(fù)實(shí)驗(yàn)與分析。2減少基因分型錯(cuò)誤及其影響的措施2.3等位基因分型后的錯(cuò)誤率控制常用的手段有：Mendelianconsistency和Hardy-Weinbergequilibrium的檢驗(yàn)。用于上述檢驗(yàn)的軟件有如下幾種：評估出錯(cuò)的影響測試或計(jì)算基因分型的錯(cuò)誤率2.3等位基因分型后的錯(cuò)誤率控制評估出錯(cuò)的影響測試或計(jì)算L/Q,linkageorQTLstudies;P,pedigreeanalysis;PG/D,populationgeneticsordemography.NatRevGenet2005[6(11)]847-859對包含錯(cuò)誤的數(shù)據(jù)進(jìn)行再分析L/Q,linkageorQTLstudies;P2.4控制分型錯(cuò)誤和影響的流程示意圖NatRevGenet2005[(11)]847-9a.確定本分型的錯(cuò)誤率b.確定可接受的錯(cuò)誤率c.找出預(yù)實(shí)驗(yàn)沒能發(fā)現(xiàn)的出錯(cuò)因素并矯正d.確定數(shù)據(jù)分析時(shí)的出錯(cuò)率e.發(fā)表研究結(jié)果時(shí)，應(yīng)該告知錯(cuò)誤率的控制情況或質(zhì)控方式2.4控制分型錯(cuò)誤NatRevGenet2005[(1八、實(shí)際工作中SNPs的選擇原則1一般性原則

先功能性的SNPs：外顯子上的錯(cuò)義或同義突變位點(diǎn)；每一個(gè)外顯子兩端和內(nèi)含子中潛在性的剪切位點(diǎn)；基因的3’-端和5-’端序列中可能具有調(diào)節(jié)功能的位點(diǎn)；

先標(biāo)志性(Tag)的SNPs：它可以包含多個(gè)的SNPs的信息；

先選常見的SNPs：弱勢等位基因頻率＞5%;八、實(shí)際工作中SNPs的選擇原則1一般性原則基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫與運(yùn)用課件基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫與運(yùn)用課件......…………………......……………2擬分析的SNPs，必須進(jìn)行研究群體的頻率分布確認(rèn)例如LPL基因的rs18005902擬分析的SNPs，必須進(jìn)行研究群體的頻率分布確認(rèn)3MAF＜5%具有潛在功能或者在患者群體中＞5%的SNPs也應(yīng)選擇ForExample:NOD2mutationspredisposingtoCrohn’sdiseasewererecentlyfoundtooccuratafrequencyof6–12%amongcases,butat<5%amongcontrols(Hugotetal.,2001;Oguraetal.,2001).HugotJP,ChamaillardM,ZoualiH,LesageS,CézardJP,BelaicheJ,AlmerS,TyskC,O'MorainCA,GassullM,BinderV,FinkelY,CortotA,ModiglianiR,Laurent-PuigP,Gower-RousseauC,MacryJ,ColombelJF,SahbatouM,ThomasG.AssociationofNOD2leucine-richrepeatvariantswithsusceptibilitytoCrohn’sdisease.Nature.2001,411:599–603OguraY,BonenDK,InoharaN,NicolaeDL,ChenFF,RamosR,Br