個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南

#標本的長距離運送應(yīng)符合生物安全要求，具有高度傳染性和嚴重危害公眾健康的病原體的運送更應(yīng)該嚴格要求，如在HIV標本運送中就應(yīng)注意要獲得相應(yīng)部門批準并由具有資質(zhì)的人員專程護送。采用三層容器對標本進行包裝，隨標本應(yīng)附有與標本唯一性編碼相對應(yīng)的送檢單。送檢單應(yīng)標明受檢者姓名、標本種類等信息，并應(yīng)放置在第二層和第三層容器之間。第-層容器：直接裝標本，應(yīng)防滲漏。標本應(yīng)置于帶蓋的試管內(nèi)，試管上應(yīng)有明顯的標記，標明標本的唯一性編碼或受檢者姓名、種類和采集時間。在試管的周圍應(yīng)墊有緩沖吸水材料，以免碰碎。第二層容器：容納并保護第一層容器，可以裝若干個第一層容器。要求不易破碎、帶蓋、防滲漏、容器的材料要易于消毒處理。第三層容器：容納并保護第二層容器的運輸用外層包裝箱。外面要貼上醒目的標簽，注明數(shù)量、收樣和發(fā)件人及聯(lián)系方式，同時要注明''小心輕放、防止日曬、小心水浸、防止重壓''等字樣，還應(yīng)易于消毒。用于病毒載量檢測的樣品應(yīng)在-20°C以下運輸。DBS樣品可室溫（18?25C）運送。每一件包裝的體積以不超過50mL為宜。對于以空氣為媒介傳播的微生物如：結(jié)核分枝桿菌，特別是耐藥結(jié)核病可疑者的痰標本和/或培養(yǎng)物的運送，應(yīng)建立確保感染性物質(zhì)安全包裝和運輸?shù)南到y(tǒng)。分枝桿菌培養(yǎng)物應(yīng)放入固體培養(yǎng)基內(nèi)運輸，要放入螺口管內(nèi)水密保存。培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)物及液體培養(yǎng)基內(nèi)的培養(yǎng)物不得運輸?？墒褂?ml的小冷凍管，含有一定斜面的培養(yǎng)基。如果預(yù)計運輸時間很短（即不到1周），細菌的運輸無需培養(yǎng)基和液體。（5）樣本運送溫度和時間的要求對于靶核酸為DNA的樣本，如是在無菌條件下采集，可以在室溫下運送，建議采集后，8h內(nèi)送至實驗室。當欲檢測的靶核酸為RNA時，如果樣本能夠在iomin內(nèi)運送到實驗室，則可室溫運送，如所需運送時間較長，則應(yīng)將樣本置于冰上，必須保證樣本與冰屑充分接觸，且冰屑應(yīng)達到樣本的高度，建議采集后4h內(nèi)送到分子檢測實驗室。樣本運送溫度和時間的要求除考慮DNA或RNA的穩(wěn)定性外，還與樣本類型有關(guān)。冰凍組織樣本最好保證其在運送過程中不發(fā)生融化，石蠟包埋組織則可在室溫下運送。樣本保存溫度和時間的要求樣本接收后，最好能立即進行檢測，如果不能立即檢測，必須對樣本進行適當?shù)谋４?，保存方式和期限視樣本種類及檢測目的不同而定。通常而言，用于DNA檢測時，樣本可在2?8°C保存72h。用于RNA檢測時，樣本一旦采集送達實驗室后，如不能立即提取，應(yīng)凍存于.70C。臨床體液樣本的長期保存(>2周)在保存于-70°C。已提取純化的RNA最好在乙醇沉淀后保存在-70°Co但是，除DNA或RNA的穩(wěn)定性外，還與樣本類型有關(guān)。如果樣本中含有紅細胞，應(yīng)盡可能去除紅細胞后，再進行凍存。石蠟包埋組織則可在2-8C長期保存。常見樣本采集、運送和保存的要求血液采血前檢查患者兩只手臂，選擇一處未穿刺過的區(qū)域，止血帶壓迫時間不能過長，最好不要超過2min,以避免淤血和血液凝縮。最好采用封閉式真空采血管，既有利于樣本的采集、運送和保存，又便于防止血液交叉污染，要避免從血管插管內(nèi)取血，因插管易被污染，造成檢測的假陽性。溶血是檢驗科血液樣本檢測最常見的干擾，臨床血液采集人員在樣本采集過程中應(yīng)特別注意操作手法，防止錯誤操作的出現(xiàn)，避免溶血。血液樣本采集后必須加塞、管口向上、垂直放置，減少管中內(nèi)容物震蕩，促進凝血完全，并防止樣本蒸發(fā)、污染或外濺等。血漿樣本如進行RNA檢測，采樣后必須對全血樣本進行離心，如使用的為無分離膠的采血管，血漿應(yīng)在4h內(nèi)離心并轉(zhuǎn)移到另一試管中；如使用的為帶分離膠的采血管，可直接送至實驗室。血清樣本/全血樣本用于RNA檢測的樣本應(yīng)使用含有RNA穩(wěn)定劑的采血管進行采樣，特別是用于RNA轉(zhuǎn)錄子檢測的樣本，必須使用含有RNA穩(wěn)定劑的采血管。樣本采集后送至實驗室之前，均應(yīng)暫放在2-8C臨時保存。對于靶核酸為DNA的樣本，如是在無菌條件下采集，可以在室溫下運送，建議采集后，8h內(nèi)送至實驗室。用于DNA檢測的可在2-8C保存72h,如72h內(nèi)不能檢測，則保存在-2(TC以下。如為RNA,10分鐘以內(nèi)的短時間運送可在室溫下進行，如更長時間，應(yīng)在加冰條件下運送，41】內(nèi)送至實驗室，如不能立即檢測，則應(yīng)存放于-70°C以下。如需長期保存的DNA樣本，3個月以內(nèi)存放于-20°C以下；3個月以上置于-70°C以下。如需長期保存的RNA樣本，應(yīng)置于?70°C以下，反復(fù)凍融不超過3次。不要在“無霜”冰箱中儲存血液樣本，因無霜冰箱在每天自動除霜過程中會發(fā)生溫度變化。干血斑(DBS)樣本適合用于DNA檢測但并不推薦作為完整RNA檢測的樣本類型。一旦風干，DBS不能單獨放在密封的袋子中，袋子中殘留的潮氣利于微生物的繁殖。應(yīng)將DBS放入預(yù)置干燥劑的容器內(nèi)，同時放置濕度指示卡，隨時監(jiān)測容器內(nèi)濕度變化。為了避免交叉感染，多個DBS樣本應(yīng)該用薄玻璃紙片、蓋玻片或采用其它方式彼此隔開。濾紙上的樣本可在室溫穩(wěn)定存在，因此可用于常溫運輸。組織組織樣本采集的方式有新鮮組織、活檢組織和手術(shù)切除樣本等。手術(shù)樣本進行基因突變檢測的優(yōu)點是可以提供足夠的腫瘤組織用于檢測，但是由于手術(shù)過程需要麻醉，目前又缺乏手術(shù)中組織核酸穩(wěn)定的標準技術(shù)，手術(shù)過程中可能存在組織缺氧，可能會導(dǎo)致局部組織pH降低從而使核酸量下降。臨床分子檢測所需的組織大約在1?2g,但由于不同組織之間DNA、RNA的含量變化較大，最佳的樣本量仍需根據(jù)組織的性質(zhì)決定。骨髓、淋巴結(jié)和脾等組織細胞數(shù)較多，樣本的需要量相對較小。細胞含量較少的組織如肌肉、脂肪組織并不是基因組DNA檢測的最佳選擇，且樣本需要量大于1?2g。一般情況下，只要獲得的組織樣本沒有大量脂肪浸潤，大于lθmg的樣本便可獲得＞10pg的RNA、DNAo由于不同組織的蛋白種類和含量存在差異，針對不同組織核酸提取試劑也有所不同。采集組織樣本后，應(yīng)使用浸于生理鹽水中的無菌紗布或濾紙包裹，以避免組織樣本的脫水。不同組織樣本中DNA和RNA的穩(wěn)定性有所不同。總的來說，樣本采集后，不推薦將組織樣本放置在22-25°C條件下。最理想的方法為，將組織迅速置于液氮中保存或放在核酸保存液中。如果條件有限，可以將組織樣本立即置于冰上，特別是進行RNA檢測時。用于原位分子檢測如熒光原位雜交(Fluorescentinsituhybridization,FISH)的樣木置于眼佳切割溫度包埋劑(ODtimalCuttingTenmeratureCompound,OCT)中并保持冰凍狀態(tài)直到檢測。由于組織樣本通常需先進行病理學(xué)分析，在分析完成后應(yīng)盡早將組織樣本置于穩(wěn)定劑中，以避免核酸降解。這一點在檢測RNA轉(zhuǎn)錄子中尤為重要。用于DNA提取的組織應(yīng)迅速冷凍，并在冰上運送。一般來講，組織中的DNA在2?8°C可穩(wěn)定保存24h,-20°C至少2周，-70°C至少保存2年。用于DNA提取的組織送達實驗室后，應(yīng)立即保存在.20°C或立即進行DNA提取，長期保存應(yīng)置于-70°Co用于RNA提取的新鮮組織樣本，應(yīng)該置于穩(wěn)定液中迅速保存在-70°Co立即置于.70°C冰凍的組織RNA可至少保存2年。如需進行原位分子檢測(如FISH),冰凍組織應(yīng)在檢測前一直置于OCT中并保存在-70°Co如果樣本是干冰或冰浴保存運輸?shù)?，接到樣本后?yīng)立即保存在-70°C,以防止樣本溶解，并在RNA提取前將樣本一直保存在-70°C；如果在運送過程中已經(jīng)融化則應(yīng)在4h內(nèi)提取RNA,已提取純化的RNA最好在乙醇沉淀后保存在?70°C。在提取前應(yīng)避免反復(fù)凍融，如可能發(fā)生反復(fù)凍融，可首先將組織樣本在異硫氤酸服或其他核酸提取液中勻漿處理。用于RNA檢測的固相組織特別是腫瘤組織，富含內(nèi)源性核酸酶，如果不能即刻檢測需要保存在?70°Co有血的組織在冷凍之前需要用無菌生理鹽水洗凈。不論樣本要保存多久，都需要將樣本保存在-70°C或.7(TC以下，因為RNA酶即使在-20°C也可以降解RNAo胚胎樣本(產(chǎn)前檢測樣本)胚胎樣本包括絨毛膜活檢(CVS)樣本、培養(yǎng)的絨毛膜活檢細胞、羊水、從羊水中培養(yǎng)的細胞以及其它來源于胚胎的細胞樣本。胚胎樣本的標簽上必須注明母親的全名和胚胎樣本的類型。母體血液樣本應(yīng)一同送檢，以排除胚胎樣本受到母體細胞/DNA的污染。通常胚胎樣本應(yīng)同時進行細胞培養(yǎng)作為樣本的備份，直至檢測完成，并確認樣本巳無保存必要。孕期15周后采集的羊水樣本無需進行細胞培養(yǎng)備份。CVS樣本采樣后必須清除母體組織，特別是子宮內(nèi)膜蛻膜組織。在去除母體組織后，標準的CVS樣本應(yīng)至少為15mg。CVS樣本應(yīng)在無菌組織培養(yǎng)液或生理鹽水中運送。羊水樣本需采集至少10ml以上。來源于羊水或CVS樣本的培養(yǎng)細胞應(yīng)置于充滿細胞培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中，細胞匯合率需＞75%。CVS樣本應(yīng)當在解剖顯微鏡下評價母體組織的污染情況。如未受母體組織污染，應(yīng)當在收到樣本的當天進行DNA提取。如果樣本受母體組織污染，應(yīng)盡可能去除。如樣本無法在當天進行處理,應(yīng)當在2?8°C保存至第二天，即進行DNA提取。羊水樣本應(yīng)當在收到樣本當天進行DNA提取，如當天無法進行處理，應(yīng)當在2.8°C保存至第二天，即進行DNA提取。培養(yǎng)的CVS或羊水來源的細胞，應(yīng)首先在倒置顯微鏡下觀察細胞匯合率。一般而言，細胞匯合率應(yīng)超過75%,如果細胞匯合率不足75%,應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)細胞。骨髓穿刺樣本/細針穿刺細胞骨髓穿刺應(yīng)當使用含EDTA抗凝的注射器進行，不建議使用肝素抗凝。如進行DNA提取，骨髓穿刺樣本可在處理前臨時儲存在2-8°C,并在72h內(nèi)完成核酸提取。如進行RNA檢測，應(yīng)盡早將骨髓穿刺樣本置于RNA穩(wěn)定劑中。如條件不允許，可將骨髓樣本立即置于冰上，送至實驗室。如無法將樣本保存在穩(wěn)定劑中或無法冰凍，應(yīng)在4h內(nèi)進行RNA提取。如需長期保存的樣本，在去除紅細胞后可在-20°C儲存幾個月。無論何種類型的樣本，均不推薦在核酸提取前凍融含有紅細胞的樣本。胸腹水首次穿刺抽到積液后，應(yīng)棄掉第一管樣本及所用注射器，然后更換新的一次性注射器抽取。穿刺采集后留取中段液體于帶蓋的無菌試管內(nèi)，因積液易凝集，應(yīng)采用EDTA抗凝，同時注意防止外傷性血液的進入。穿刺獲得胸腹水樣本直接分離提取有核細胞用于檢測，如不能立即檢測可在-20C存放72h,長期保存應(yīng)存放-70°Co用于RNA檢測的樣本在樣本采集后迅速放到冰上，并在4h內(nèi)提取RNA,如果樣本不能立即處理，應(yīng)在紅細胞去除后將其立即冷凍。冷凍的樣本在運送過程中應(yīng)放在干冰上。用于突變基因檢測時離心后得到的細胞塊樣本的運送和保存與活檢組織樣本相同。痰液痰液樣本應(yīng)采集早晨第一口痰，深咳可獲得較好的痰樣本：先用無菌水反復(fù)漱口，以去除口內(nèi)大部分雜菌，經(jīng)深呼吸數(shù)次后用力咳痰，咳出的深部痰液置于無菌管內(nèi)，應(yīng)避免口腔、鼻腔分泌物的污染，推薦使用廣口無菌采集器收集痰?！莺细竦奶禈颖緫?yīng)該是未經(jīng)唾液污染的，需要作革蘭染色和鱗狀上皮細胞鏡檢，平均每低倍鏡視野多于10個鱗狀上皮細胞表明混有唾液，說明樣本是不合格的。用于DNA檢測的痰樣本應(yīng)當收集在無菌容器中。痰樣本運輸前應(yīng)放置于陰涼處，最好是放置于2.8°C冰箱內(nèi)。如果痰樣本在收集與處理過程之間有可能長時間暴露于室溫，為促成粘液和有機碎屑的均質(zhì)化以及確保運輸過程中的無污染，可加入0.6%的漠化十六烷毗隴或1%的氯化十六烷基毗陡，體積與痰樣本相當。如果樣本在30min以內(nèi)不能運送，應(yīng)該冷凍保存；如果運送時間超過30min,應(yīng)在2?8°C運送。接到樣本后如果不能及時檢測應(yīng)立即冷凍保存，結(jié)核分枝桿菌在樣本中穩(wěn)定存在的時間較其他微生物稍長,對于既做培養(yǎng)又做分子檢測的樣本應(yīng)立即進行處理。樣本在-70°C至少可以保存1年。尿液尿液的采集應(yīng)特別注意避免尿道口分泌物、糞便等混入。應(yīng)清潔外陰，收集中段尿，必要時采用導(dǎo)尿術(shù)采集樣本，避免污染。尿液在膀胱內(nèi)應(yīng)停留6~8h以上，使細菌有足夠時間繁殖。晨尿是早晨起床后第一次排出的尿液，由于尿液在膀胱中滯留時間較長，所以晨尿較為濃縮，適于多種微生物檢測。隨機尿是在任意時間采集的尿液樣本，是尿液分析最常用的樣本類型，但是可能會出現(xiàn)由于尿液被稀釋而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，因此隨機尿不能準確反映患者狀況。甲醛固定的石蠟包埋組織(FFPET)對于FFPET樣本而言,用檢測DNA的組織蠟塊可在室溫條件下保存。但是,如進行RNA檢測，建議不要使用FFPET樣本。(四)臨床分子診斷樣本的接收各臨床分子診斷實驗室均應(yīng)建立嚴格的標本驗收制度和不合格標本拒收制度，對每項檢測項目均制定相應(yīng)的接收標準。對符合要求的標本，接收后立即進行檢測，不符合要求的標本應(yīng)拒收，并建議重新采集標本。對于每個接收的合格標本均應(yīng)分配一個唯一的標識碼，通過這一標識碼可以將不同患者的不同標本區(qū)分開來。對于某些具有高度傳染性的標本必須經(jīng)過嚴格的安全控制并且在高度密閉、具有處理感染性材料能力的實驗室內(nèi)、由經(jīng)過培訓(xùn)的、穿戴防護衣、戴口罩、防護眼鏡的工作人員在生物安全柜中打開，用后的包裹應(yīng)及時進行消毒。簡單快捷并且有效的滅活病毒、細菌及真菌的抱子，又不影響后期分子檢測是相當重要的，既能保證檢測人員的安全，又可以保證高質(zhì)量的檢測結(jié)果。用于腫瘤組織基因突變檢測的樣本，在分子檢測前須由病理醫(yī)師進行鏡下腫瘤細胞評估，然后富集腫瘤細胞用于核酸提取。腫瘤細胞所占比例應(yīng)達到所用擴增檢測方法的要求。（五）純化后的DNA和RNA的保存DNA如果純化后的DNA無DNA酶的污染,則可在TE緩沖液中室溫保存26周；2-8°C保存一年；-20°C保存7年；-70°C保存7年以上。懷疑可能存在DNA酶污染的樣本，則保存在-20C以下。RNARNA易于降解，在-20C條件下，RNA酶也可能發(fā)揮作用。因此，純化后的RNA應(yīng)當經(jīng)過乙醇沉淀，并在-70C以下保存。四分析中質(zhì)量保證（一）實驗室設(shè)計要求1.基本原則涉及臨床基因擴增技術(shù)的實驗室分區(qū)、空氣流向、人員工作流向、設(shè)備配置等應(yīng)符合《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導(dǎo)則》。本指南僅對實驗室分區(qū)和功能的要點進行規(guī)定。2.實驗室分區(qū)和功能的要點實驗室原則上應(yīng)設(shè)置4個獨立的工作區(qū)域，包括試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)和擴增產(chǎn)物分析區(qū)，需設(shè)在不同的房間或區(qū)域。四個區(qū)域空間上必須是完全相互獨立的，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應(yīng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。各區(qū)的功能是：（1）試劑儲存和準備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應(yīng)混合液的制備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。（2）標本制備區(qū)：各種類型樣本的預(yù)處理，例如組織的固定、細胞分離、血漿離心、石蠟包埋組織樣本的制備切片等，核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管。（3）擴增區(qū)：cDNA合成、DNA擴增。（4）產(chǎn)物分析區(qū)：擴增片段的測定，包括測序產(chǎn)物的純化、測序、基因芯片、點雜交、酶切電泳、質(zhì)譜分析等各種產(chǎn)物分析的形式。（5）區(qū)域的適當增加及合并：實驗室可根據(jù)所采用技術(shù)平臺的多少、檢驗項目數(shù)量和工作量及樣本特點，適當增加分區(qū)。不同的產(chǎn)物分析平臺，如有出現(xiàn)交叉污染的可能，則應(yīng)分開，如測序與基因芯片雜交不宜放在一個區(qū)域內(nèi)。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當合并。例如使用實時熒光PCR儀，擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并；采用樣本混合、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，則標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。（二） 檢測方法和試劑的選擇如使用商品試劑，應(yīng)當使用經(jīng)SFDA注冊批準的試劑。如使用自制試劑，應(yīng)當建立實驗室配制試劑的SOPo（三） 設(shè)備維護和校準實驗室應(yīng)設(shè)立常用儀器的維護及校準制度，以保證檢測工作正常運轉(zhuǎn)。必須經(jīng)國家法定部門定期（每年至少1次）校準的儀器至少包括：溫度計，高壓滅菌器。溫濕度計須經(jīng)計量部門校準。其他精密儀器及出具實驗結(jié)果的儀器，如加樣器、生物安全柜、離心機、擴增儀、實時熒光PCR儀、雜交儀、測序儀、質(zhì)譜儀等也必須定期（每年1次）校準，可由生產(chǎn)廠家校準。實驗室應(yīng)保留校準的記錄。加樣器也可由實驗室自校。（四） 人員培訓(xùn)檢測技術(shù)人員需進行上崗培訓(xùn)和在崗持續(xù)培訓(xùn)。上崗培訓(xùn)是實驗室人員需接受醫(yī)政醫(yī)管局指定機構(gòu)進行的個體化醫(yī)學(xué)檢測實驗室人員培訓(xùn)，并取得上崗證，方能從事個體化醫(yī)學(xué)實驗室檢測。如檢測技術(shù)涉及臨床基因擴增技術(shù)的，還應(yīng)取得臨床基因擴增檢測實驗室人員上崗證。在崗持續(xù)培訓(xùn)指在工作中耍根據(jù)需要接受復(fù)培訓(xùn)，實驗室技術(shù)人員至少每2年1次，除接受檢測基本培訓(xùn)內(nèi)容外，要求了解相關(guān)技術(shù)、質(zhì)控及安全要求的新進展。（五）試劑的性能驗證根據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法》（試行），跟美國大體一致，體外診斷試劑也可分為I類、II類、III類，其中II類、III類要求進行性能驗證，國內(nèi)現(xiàn)有的個體化診斷項目也絕大多數(shù)屬于此類。性能驗證的內(nèi)容包括：精密度或重復(fù)性（定性和定量）、準確度（定性為方法學(xué)比較或與標準樣本盤比較）、線性（定量）、可報告范圍（定量）、檢出限（定性）、參考區(qū)間（定量）、抗干擾能力等。精密度或重復(fù)性評價精密度是指重復(fù)檢測條件下，獲得的測量結(jié)果間的一致程度。精密度是一個方法或檢測系統(tǒng)的性能指標中最重要的，也是準確度的前提。（1） 定性檢測在定性檢測中，精密度是指一個陽性或陰性樣本，重復(fù)多次測定得到陽性或陰性結(jié)果的比率。在評價定性測定時，不能使用強陽性或陰性樣本，只能使用接近臨界濃度的樣本。具體做法是：使用一份接近臨界濃度的陽性標本，進行20次以上的重復(fù)檢測，計算出現(xiàn)陽性或陰性結(jié)果的次數(shù)，陽性率需不小于95%0（2） 定量檢測在定量檢測中，可將精密度評價理解為是對檢測體系隨機誤差的一種度量，無法用數(shù)字來表示，只能通過不精密度如標準差和變異系數(shù)來評估，標準差或變異系數(shù)越小精密度越好。定量檢測的準確度評價，有兩種方法：一是如這種待評估方法為標準方法，則使用該方法直接重復(fù)檢測標準物質(zhì)，直接比較檢測結(jié)果的標準差和標準方法中規(guī)定的重復(fù)性限；二是如已有其他標準方法，則將待評估方法直接與標準方法進行比較，兩種方法同時對一系列的標準物質(zhì)或臨床常規(guī)樣品分別進行分析，檢查兩種方法檢測結(jié)果的標準差或方差是否有統(tǒng)計學(xué)差異。實驗室可根據(jù)檢測項目和臨床耍求來設(shè)定允許的定量結(jié)果不精密度范圍。準確度評價準確度是指測定結(jié)果與真實結(jié)果之間的接近程度。（1） 定性檢測在定性檢測中，準確度是指樣本陽性或陰性測定結(jié)果與其真實結(jié)果的一致性程度，可以采用陽性符合率和陰性符合率來表示。通常是將待驗證方法與一公認（金標準方法或參考方法）或?qū)嶒炇乙言谑褂玫姆椒ㄍ瑫r檢測日常工作標本（至少有50例陽性樣本），然后比較兩種方法之間結(jié)果的差異，不一致的結(jié)果再用第三種或金標準方法確認，通過計算陽性符合率和陰性符合率來評價定性測定的準確度。實驗室根據(jù)檢測項目和臨床要求來設(shè)定對陽性符合率和陰性符合率的要求，一般來說，陽性符合率和陰性符合率應(yīng)＞95%0（2） 定量檢測在定量檢測中，準確度評價主要是評價測定的定量結(jié)果與真實定量結(jié)果的偏倚，以結(jié)果和真實值之間的差異表示。定量檢測的準確度評價，有兩種方法：一是可使用待驗證方法對已知標準值的標準物質(zhì)進行分析，將檢測結(jié)果與已知標準值進行比較。二是同時使用待評估項目與標準方法或參考方法對同一批次樣品（包括測定線性范圍高中低濃度樣本）進行分析，然后將不同方法得到的結(jié)果進行對比分析。實驗室可根據(jù)檢測項目和臨床要求來設(shè)定允許的定量結(jié)果偏倚范圍。線性與可報告范圍驗證線性是指在檢測體系的檢測范圍以內(nèi)，測量值與預(yù)測值之間的關(guān)系。線性與準確度密不可分，高準確度是線性分析的必要條件。線性分析有兩種常見方法，我們可以直接分析已知濃度樣品，也可將一定濃度樣本進行系列稀釋，根據(jù)稀釋因子來研究檢測值與逐步下降的預(yù)期估計濃度之間是否存在線性?？蓤蟾娣秶悄軌驁蟾娴目煽康淖畹秃妥罡邫z測結(jié)果，一般由廠家/方法建立者提供，驗證實驗室可通過“多點法''進行簡單驗證，推薦至少使用4個，最好是5個不同濃度水平樣品進行驗證。這些不同濃度樣品中需包含一個接近檢出限的零水平濃度和一個接近或稍高于最高檢出限的濃度，重復(fù)測量4次，以測量值均值為y軸，指定值為x軸繪制圖形進行分析，觀察各點是否通過直線。檢出限（LoD）驗證檢出限是指可被檢測體系重復(fù)檢測出待測物質(zhì)的最低濃度水平。不同類型的標本，測定下限可能會有所不同。在定性和定量檢測中，檢出限的評價方式相同。檢出限的建立一般由廠家、方法建立者完成，實驗室可驗證廠家/方法建立者給出的檢出限是否正確，具體做法是：采用濃度為LoD的樣本檢測至少20次,如產(chǎn)生95%的陽性結(jié)果。則符合要求驗證通過，不符合要求則聯(lián)系廠家/方法建立者，或自行建立LoD。參考區(qū)間驗證參考區(qū)間是指上、下參考限之間的參考值分布范圍，醫(yī)學(xué)參考值區(qū)間通俗的講就是“正常人''各項生理指標正常波動的范圍，主要用于劃分正常與異常人群。在定性檢測中，通常以正常人群結(jié)果為陰性報告結(jié)果，以異常人群結(jié)果為陽性報告結(jié)果，因此不需對參考區(qū)間進行驗證。在定量檢測中，如果以某一量值的結(jié)果為臨界值來進行劃分，在臨界值以上和以下的結(jié)果對臨床有不同的意義，那么需要對量值的參考區(qū)間進行驗證。參考區(qū)間的建立一般由廠家/方法建立者完成，實驗室可驗證廠家/方法建立者給出的檢出限是否正確，具體做法有三種：一是直接分析法：直接比較廠家/方法建立者進行參考區(qū)間建立研究時的相關(guān)分析、分析前因素是否與本實驗室一致。如參考人群的地理因素、人口因素等是否與本實驗室測試對象人群一致，如大體一致，可認為相符并直接使用該參考區(qū)間，但這種方法比較粗糙；二是驗證實驗室可檢測少量本實驗室測試對象（如n=20）,將這部分參考個體檢測值與廠家/方法建立者的大型初始研究進行比較。如果這20個參考個體中檢測值落在廠家/方法建立者提供的參考區(qū)間以外的個數(shù)＜2（測試結(jié)果的10%）,則本實驗室可使用該參考區(qū)間；如20個參考個體中檢測值落在廠家/方法建立者提供的參考區(qū)間以外的個數(shù)23,驗證實驗室需重新收集參考個體進行檢測，若超過廠家/方法建立者提供的參考區(qū)間以外的個數(shù)W2,那么本實驗室可使用該參考區(qū)間，反之仍23則需重新分析兩組人群的生物特征差異，考慮自行建立參考區(qū)間。三是驗證實驗室檢測更大量本實驗室測試對象(如n=120),將這部分參考個體檢測值與廠家/方法建立者的大型初始研究進行比較。這個方法因參考個體數(shù)量的增加而更具科學(xué)性。五分析后質(zhì)量保證檢測結(jié)果應(yīng)包括的信息結(jié)果的報告原則上，結(jié)果報告應(yīng)將檢測結(jié)果的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)榍逦鬃x且能被醫(yī)師和患者理解的形式進行報告。除非是對結(jié)果說明很有必要，否則不需要將臨床醫(yī)生不理解或需要非常專業(yè)知識才能理解的原始數(shù)據(jù)圖如實時熒光PCR擴增曲線圖、電泳圖、雜交圖等放在報告內(nèi)。結(jié)果的報告應(yīng)包含以下信息：實驗室、患者、標本編號及標識，具體如下：患者的姓名、性別、年齡；送檢科室或單位名稱；標本采集時間和實驗室接收標本時間；標本的編號或條碼；檢測項目；標本類型和標本的前處理過程(如冰凍、石蠟包埋、肝素抗凝等)；檢測方法和主要設(shè)備等。結(jié)果檢測結(jié)果：如為基因突變，應(yīng)使用標準化的基因命名，推薦使用HGVS,HumanGenomeVariationSociety標準(/mutnomen)；如定量檢測，應(yīng)使用標準的計量單位，并注明項目的參考區(qū)間或檢測方法的線性或測定范圍；如為定性檢測可注明“陽性”或“陰性”，并給出正常應(yīng)為''陽性”還是陰性；檢測人、審核人、復(fù)核人簽字；結(jié)果報告日期和備注。結(jié)果的解釋必須對結(jié)果進行解釋，為用藥決策的個體化檢測可提出用藥方案的建議’具體包括：結(jié)果的一般臨床意義和對受試患者的臨床意義；如之前進行過檢測，需解釋與之前檢測結(jié)果之間的縱向關(guān)聯(lián)（如果有該情況）:推薦的進一步措施（例如下一步的檢測建議、遺傳咨詢等等）（如果有該情況）：樣本的狀態(tài)是否會影響檢測的準確性（如樣本接收時處于融化狀態(tài)、核酸部分降解等等）（如果有該情況）；所用試劑方法的檢測性能特點及相關(guān)的可能干擾檢測結(jié)果的干擾物質(zhì)（不強制要求）；引用有關(guān)本檢測及其臨床應(yīng)用的經(jīng)過同行評議的醫(yī)學(xué)文獻或網(wǎng)址（不強制要求）；如果該報告是補充或修訂報告，需要寫明報告的改變或更新情況（不強制要求）。（二） 報告時間的要求基因檢測所需時間依所檢測樣本性質(zhì)、檢測項目、所采用檢測技術(shù)平臺等而有所不同。實驗室應(yīng)明確檢測報告發(fā)出所需時間，并告訴醫(yī)生和患者。（三） 檢測后樣本的保存和處理樣本檢測后要進行一定時間的保留，以備必要時復(fù)查。當對檢測結(jié)果提出質(zhì)疑時，只有對原標本進行復(fù)查才能說明初次檢驗是否有誤。標本的保存?zhèn)€體化檢測報告發(fā)出后的標本應(yīng)盡可能長期保存，或至少在患者的整個藥物治療期間，或保存半年以上，以便復(fù)查，也利于和新采集的標本進行對比分析。臨床醫(yī)師如果對檢驗結(jié)果有疑問，應(yīng)盡快反饋給實驗室。（1） 建立標本保存的規(guī)章制度，做好標本的標識并有規(guī)律地存放，保存好標本的原始標識；（2） 在標本保存前要進行必要的收集和處理，如離心分離血清或細胞成份等;對于敏感、重要的標本應(yīng)加鎖重點保管，專人專管；對超過保存時限的標本可清除以非省資源和空間；要建立配套的標本存放信息管理系統(tǒng)，監(jiān)控每個檢測樣本的有效存放和最終銷毀時間，并可通過患者信息快速定位找到樣本存放位置。標本的處理標本的處理和檢測標本的容器、檢驗過程中使用的材料的處理要符合《醫(yī)療廢物管理條例》和《醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法》，以及國家、地區(qū)的相關(guān)要求。對臨床實驗室的標本、培養(yǎng)物、被污染物要保存于專用的、有明顯生物危險標識的廢物貯存袋中，從實驗室取走前，要經(jīng)過高壓消毒，最后送到無公害化處理中心進行處理。六質(zhì)量保證標準操作程序(SOP)實驗室應(yīng)制訂包括以下內(nèi)容的SOP及相關(guān)記錄表格樣本的采集、運送、保存、接收、登記和處理；知情同意告知；檢測方法和步驟；試劑和耗材的選擇和保存(如為自制試劑，需詳細寫明試劑的制備過程以及各原料的來源)；試劑性能驗證；儀器的使用維護和校準；人員培訓(xùn)；結(jié)果報告與解釋；實驗室數(shù)據(jù)、相關(guān)文件記錄與保存；室內(nèi)質(zhì)量控制；室間質(zhì)量評價或?qū)嶒炇议g比對；保密程序。SOP編寫及修訂由各崗位人員起草，實驗室主任審定，根據(jù)實際使用過程發(fā)現(xiàn)的問題，隨時進行修訂。所有工作人員要在所從事工作的SOP文件上簽名表示已經(jīng)閱讀并掌握了有關(guān)內(nèi)容。實驗過程中應(yīng)嚴格執(zhí)行SOP,不得擅自修改。質(zhì)控品的耍求涉及人基因組的檢驗項目可包含如下質(zhì)控品：陰性質(zhì)控品：判斷假陽性反應(yīng)；陽性質(zhì)控品：判斷假陰性反應(yīng)；提取內(nèi)對照：監(jiān)測提取效率是否符合要求；擴增內(nèi)對照：監(jiān)測擴增效率是否符合要求。涉及人基因組以外的檢驗項目可包含如下質(zhì)控品：陰性質(zhì)控品：判斷假陽性反應(yīng)；陽性質(zhì)控品：判斷假陰性反應(yīng)；擴增內(nèi)對照：監(jiān)測擴增效率是否符合要求。室內(nèi)質(zhì)量控制定性項目室內(nèi)質(zhì)量控制對基因突變、基因多態(tài)性等定性檢測而言，一般用非統(tǒng)計學(xué)方法進行室內(nèi)質(zhì)量控制。常用的做法在每次檢測時同時設(shè)立試劑對照、陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控、弱陽性質(zhì)控，而且這些質(zhì)控樣本要與待檢樣本同時檢測。對于陰性質(zhì)控，可以選用已知的陰性樣本；對于陽性或弱陽性質(zhì)控樣本，可能是實驗室驗證過的己知陽性樣本，也可能是疾病相關(guān)的細胞系或體外構(gòu)建的含已知突變基因的質(zhì)粒。根據(jù)分子診斷的現(xiàn)狀，我們建議按照以下原則設(shè)定室內(nèi)質(zhì)量控制：(1)如果只檢測1個基因突變，且標本量不是特別大，不多于30份，定性測定有一份接近cut?off的弱陽性和一份陰性質(zhì)控樣本即可。陰陽性質(zhì)控樣本的設(shè)置數(shù)量隨檢測標本數(shù)的增加而按比例適當增加，例如臨床標本數(shù)量達到50?60份，則可將陽性和陰性質(zhì)控樣本的數(shù)量翻倍。質(zhì)控樣本應(yīng)隨機放置在臨床標本中間隨同臨床標本一起同時處理。(2)當同時檢測多個突變基