人教版生物選修一專題5《DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)》課件

專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)1DNA的粗提取與鑒定課題1DNA的粗提取與鑒定課題12一、基礎(chǔ)知識(shí)1、DNA粗提取的原理（1）DNA在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaCl的濃度的變化而改變的。當(dāng)NaCl的物質(zhì)的量濃度為

0.14mol／L時(shí),DNA的溶解度最低。（2）DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精溶液。：DNA的溶解性和耐受性（3）蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60－80°C的高溫，而DNA在80°C以上才會(huì)變性。洗滌劑可以瓦解細(xì)胞膜，但對(duì)DNA沒有影響。一、基礎(chǔ)知識(shí)1、DNA粗提取的原理（1）DNA在NaCl溶32、DNA的鑒定原理：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。注意:二苯胺要現(xiàn)配現(xiàn)用,否則會(huì)影響鑒定結(jié)果。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1、實(shí)驗(yàn)材料的選取原則上只要含DNA的生物材料都可以，但是選取DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功率更大。2、DNA的鑒定原理：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染42、破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液在雞血細(xì)胞液中加入一定量蒸餾水并用玻棒攪拌，過濾后收集濾液；切碎洋蔥，加入一定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，過濾后收集濾液。血細(xì)胞在蒸餾水中大量吸水而張裂；洗滌劑瓦解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽溶解DNA物質(zhì)；選用尼龍布進(jìn)行過濾。注意：2、破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液在雞血細(xì)胞液中加入一定量5高中生物3、去除濾液中的雜質(zhì)方案一原理：DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；方法：用NaCl反復(fù)溶解和析出DNA。方案二原理：蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解DNA；方法：加嫩肉粉（含木瓜蛋白酶）。方案三原理：蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。方法：將濾液放在60—75℃的恒溫水浴箱中。（三個(gè)方案）高中生物3、去除濾液中的雜質(zhì)方案一原理：DNA在不同濃度Na6高中生物4、DNA析出與鑒定試管2支，編號(hào)甲乙→各加5mL2mol/L的NaCl溶液→甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均勻→沸水浴5min→觀察顏色變化濾液與等體積的冷卻酒精（體積分?jǐn)?shù)95%）混合均勻，靜置2～3分鐘，析出的白色絲狀物就是DNA。析出：鑒定：高中生物4、DNA析出與鑒定試管2支，編號(hào)甲乙→各加5mL27多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2高中生物多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2高中生物8一、基礎(chǔ)知識(shí)高中生物1、PCR原理：與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似一、基礎(chǔ)知識(shí)高中生物1、PCR原理：與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似9高中生物在PCR技術(shù)中：①擴(kuò)增方向：DNA的合成方向總是從子鏈的5’端

向3’端延伸。②解旋：利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合。③酶:耐高溫的Taq—DNA聚合酶，高溫不會(huì)失活。④條件：一定的緩沖溶液下才能進(jìn)行，需提供DNA模板、兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶，同時(shí)要控制溫度。高中生物在PCR技術(shù)中：①擴(kuò)增方向：DNA的合成方向總是從子10高中生物2、PCR的反應(yīng)過程：每個(gè)循環(huán)包括：變性——復(fù)性——延伸要經(jīng)歷三十多次循環(huán)①變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。②復(fù)性（退火）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。高中生物2、PCR的反應(yīng)過程：每個(gè)循環(huán)包括：變性——復(fù)性—11③延伸DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈。高中生物

從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。③延伸DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用高中生12準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方用微量移液器按配方在往微量離心管中加入各組分蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁混合反應(yīng)液離心10s將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好循環(huán)程序進(jìn)行反應(yīng)二、實(shí)驗(yàn)步驟：高中生物準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方用微量移液器按配方在往微量蓋嚴(yán)蓋子13高中生物三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1、反應(yīng)液稀釋：取2μLPCR反應(yīng)液，添加98μL蒸餾水；2、分光光度計(jì)調(diào)零：將100μL蒸餾水添加到比色杯中，在260nm處將分光光度計(jì)調(diào)整讀數(shù)為零。3、測(cè)定：將100μL反應(yīng)稀釋液倒入比色杯中，測(cè)定在260nm處的光吸收值。4、計(jì)算：DNA含量＝50×光吸收值×稀釋倍數(shù)DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰高中生物三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1、反應(yīng)液稀釋：DNA在260nm14血紅蛋白的提取和分離課題3高中生物血紅蛋白的提取和分離課題3高中生物15一、基礎(chǔ)知識(shí)：高中生物（一）凝膠色譜法（分配色譜法）：1、凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩）根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進(jìn)行分離。2、概念：一、基礎(chǔ)知識(shí)：高中生物（一）凝膠色譜法（分配色譜法）：16高中生物當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢；而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。3、原理：4、具體過程：高中生物當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)相對(duì)分子3、原理：4、17高中生物高中生物18（二）緩沖溶液：高中生物抵制外界酸、堿對(duì)溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。1、原理：由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成（如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等）。2、配制：調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。3、作用：（二）緩沖溶液：高中生物抵制外界酸、堿對(duì)溶液pH的干擾而19高中生物

在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)室中用的緩沖液是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）和材料的科學(xué)研究（活性）高中生物在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)室中用的緩沖液是磷酸緩沖液201、原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。(三)電泳：指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。高中生物2、分離方法：3、分離過程：1、原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，瓊脂21二、實(shí)驗(yàn)操作－－實(shí)驗(yàn)步驟樣品處理粗分離純化純度鑒定血液組成成分1.洗滌紅細(xì)胞2.釋放血紅蛋白3.分離血紅蛋白4.透析血紅蛋白高中生物二、實(shí)驗(yàn)操作－－實(shí)驗(yàn)步驟樣品處理粗分離純22血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細(xì)胞中________細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞的含量最高的化合物是_____________。該化合物是由_____________和____________構(gòu)成的，其中每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與O2和CO2結(jié)合的___________基團(tuán)。血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素血液組成成分閱讀思考：血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈223血液血漿水分固體物質(zhì)血漿蛋白無機(jī)鹽磷脂葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白兩個(gè)a－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈高中生物血液組成成分:血液血漿水分固體物質(zhì)血漿蛋白無機(jī)鹽血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞血241、樣品處理高中生物（1）紅細(xì)胞的洗滌除去血漿蛋白等雜蛋白，有利于后續(xù)步驟的分離純化。血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿5倍體積生理鹽水緩慢攪拌10min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色1、樣品處理高中生物（1）紅細(xì)胞的洗滌除去血漿蛋白等雜蛋白25高中生物（2）血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放。目的分析：蒸餾水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂(3)分離血紅蛋白分離過程紅細(xì)胞混合液高速離心10min離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)燒杯高中生物（2）血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破26高中生物(4)透析：在透析過程中，血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過半透膜擴(kuò)散進(jìn)入到pH＝7的磷酸緩沖液中。pH＝7的磷酸緩沖液維持血紅蛋白的正常特性。緩沖液量遠(yuǎn)多于血紅蛋白溶液量有利于雜質(zhì)分子充分地向外擴(kuò)散。高中生物(4)透析：在透析過程中，血紅蛋白溶液中的離子和小分27高中生物高中生物282、粗分離高中生物3、純化（1）凝膠色譜柱的制作：（2）凝膠色譜柱的裝填：教材圖5－19（3)樣品的加入和洗脫----透析除去分子較小的雜質(zhì)----凝膠色譜操作2、粗分離高中生物3、純化（1）凝膠色譜柱的制作：（2）凝膠29材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液裝填:（2）凝膠色譜柱的裝填：步驟操作要求①②③④⑤立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計(jì)算稱量凝膠固定色譜柱高中生物材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液（230(3)樣品的加入和洗脫基本過程：調(diào)節(jié)緩沖液面→加入蛋白質(zhì)樣品→調(diào)節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì)高中生物(3)樣品的加入和洗脫基本過程：高中生物31注意：正確的加樣操作1、不要觸及破壞凝膠面2、貼壁加樣3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)高中生物注意：正確的加樣操作1、不要觸及破壞凝膠面2、貼壁加樣3、使324、純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠