細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)

內(nèi)容第一節(jié)玻璃器皿及塑料制品的清洗與消毒第二節(jié)培養(yǎng)操作的根本要領(lǐng)和要求第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的根本技術(shù)編輯ppt第一節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料

制品的清洗與消毒編輯ppt一、清洗目的：在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)有害物質(zhì)包括：微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營(yíng)養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品玻璃器皿、膠塞、塑料制品編輯ppt1、玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個(gè)步驟清洗后的玻璃器皿要求：干凈透明無(wú)油跡不能殘留任何物質(zhì)編輯ppt清洗：自來(lái)水洗，烘干泡酸自來(lái)水洗去離子水洗三蒸水洗烘干新瓶子均按該程序清洗，培養(yǎng)材料染菌的瓶子經(jīng)高壓滅菌后也按該程序清洗。酸液〔洗液〕：濃硫酸+重鉻酸鉀編輯ppt浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉。編輯ppt新的初次使用的玻璃器皿先用自來(lái)水簡(jiǎn)單刷洗，然后用5％稀鹽酸液浸泡過(guò)夜，以中和其中的堿性物質(zhì)培養(yǎng)瓶浸泡后還需要裝滿蒸餾水后上高壓?。【庉媝pt再次使用的玻璃器皿：用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。原因：常附有大量剛使用過(guò)的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉。編輯ppt刷洗：用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿外表附著較牢的雜質(zhì)。刷洗要適度，過(guò)度會(huì)損害器皿外表光澤度編輯ppt浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中的過(guò)程注意：浸泡時(shí)器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時(shí)間：一般為過(guò)夜，不應(yīng)少于6小時(shí)配制、浸泡時(shí)應(yīng)注意平安，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露局部。

編輯ppt沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或清潔液的殘跡。浸泡后的沖洗過(guò)程：需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，蒸餾水浸泡過(guò)夜，自來(lái)水沖洗5遍，一蒸水5遍，二蒸水3遍，培養(yǎng)瓶要求二蒸水也用流水，烤干備用。編輯ppt2、膠塞的清洗新購(gòu)置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來(lái)水沖洗，再做常規(guī)處理.常規(guī)清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘〔以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)〕，自來(lái)水沖洗，蒸餾水沖洗2-3次，晾干備用。編輯ppt3、塑料制品的清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無(wú)毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，翻開(kāi)包裝即可用，多為一次性物品。必要時(shí)用2%NaOH浸泡過(guò)夜，用自來(lái)水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來(lái)水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。培養(yǎng)板、塑料離心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在烤箱中枯燥?。【庉媝pt二、包裝：目的：以便消毒及儲(chǔ)存，防止落人灰塵及消毒后再次被污染。包裝紙〔盒〕外表用油性記號(hào)筆標(biāo)明物品名稱、消毒日期等！！編輯ppt各種用品的包裝器皿的包裝分為半包裝和全包裝培養(yǎng)瓶?jī)蓚€(gè)一組全包，包裝前蓋上螺旋蓋子。吸管在與膠頭相接端塞上棉花裝入吸管筒。青霉素小瓶倒扣在飯盒中，全包。濾器上下口半包裝再用報(bào)紙包，最后用布包好。大的容器如錐形瓶，加上棉塞后半包裝。槍頭、EP管裝在相應(yīng)的盒子中，全包。手術(shù)器械放在飯盒中，全包。離心管加蓋子后全包編輯ppt三、消毒、滅菌防止培養(yǎng)物污染可通過(guò)消毒滅菌〔將已存在的微生物去除〕滅菌sterilization：應(yīng)用理化方法殺死所有病原微生物、非病原微生物和芽胞。消毒disinfection：應(yīng)用理化方法殺死微生物，只要求到達(dá)無(wú)傳染性的目的，不要求全部殺死。編輯ppt無(wú)菌germfree：沒(méi)有活菌。防腐antisepsis：應(yīng)用理化方法防止和抑制微生物生長(zhǎng)繁殖。抑菌〔bacteriostasis〕：抑制體內(nèi)或體外細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。常用的抑菌劑為抗生素編輯ppt1、消毒滅菌的方法★物理方法:濕熱〔高壓蒸汽〕、干熱、紫外線。射線、過(guò)濾、離心沉淀等方法殺滅或去除微生物?！锘瘜W(xué)方法:使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等殺滅微生物。

編輯ppt2、消毒滅菌的本卷須知

★干熱消毒：一般在烤箱中進(jìn)行，需加溫到160℃，保持90－120min方能殺死芽孢。注意??！消毒完畢后不可馬上將烤箱門(mén)翻開(kāi)，以免冷空氣突然進(jìn)人，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外事故。編輯ppt★濕熱消毒：一般使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行消毒。注意：1、不能裝太滿，保持消毒器內(nèi)氣體流通。2、在加熱升壓之前，翻開(kāi)排氣閥門(mén)，使加熱后消毒器內(nèi)的殘留冷空氣排出??！關(guān)閉排氣閥門(mén)，開(kāi)始升壓，待到達(dá)所需要的壓力時(shí)，開(kāi)始記錄時(shí)間，并控制壓力恒定。

編輯ppt3、一般物品：布類、金屬器械、玻璃器皿等消毒的要求是15磅20min；常規(guī)使用液體：消毒15磅15min。4、橡膠和塑料用品：如濾器、EP管、離心管等高壓10磅15min。

編輯ppt★紫外線消毒：主要用于實(shí)驗(yàn)室房間里的空氣、操作臺(tái)外表及桌椅等消毒。時(shí)間為30分鐘－2小時(shí)左右?！镞^(guò)濾除菌消毒：適用于組織細(xì)胞培養(yǎng)使用的液體如血清、合成培養(yǎng)液、酶及含有蛋白質(zhì)具有生物活性的液體等。編輯ppt3、常用設(shè)施的消毒及滅菌培養(yǎng)室：紫外線照射、乳酸熏蒸臺(tái)面：紫外線照射、70%乙醇擦拭培養(yǎng)箱：新潔爾滅擦拭培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等：用報(bào)紙包好高壓蒸汽滅菌滴管、槍頭等：裝載相應(yīng)的容器中用報(bào)紙包好高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)板：紫外線照射12小時(shí)以上。培養(yǎng)基：過(guò)濾除菌、編輯ppt第二節(jié)培養(yǎng)操作根本要領(lǐng)和要求防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。由于體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的無(wú)菌。一、培養(yǎng)前準(zhǔn)備1、制定出分門(mén)別類的操作卡片。如“分裝血清〞、“組織塊貼壁初代培養(yǎng)〞、“傳代培養(yǎng)〞、等等。各卡片上記有需用器材和物品名稱、要求及數(shù)量等，好處是實(shí)驗(yàn)者可按卡片收集所用物品，清點(diǎn)無(wú)誤后，把用品放置于操作場(chǎng)地，然后進(jìn)行消毒。編輯ppt2、操作野消毒：現(xiàn)多用紫外線燈滅菌，效果很好。用30瓦紫外線管燈，操作箱消毒20一30分鐘即可；操作室空間大，需消毒30～50分鐘。在用紫外線燈照射期間，在操作臺(tái)面上勿置培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液等物，以免受射線影響(必要時(shí)可用紙張覆蓋)。紫外線只有直接殺菌作用，工作野用品過(guò)多或重疊放置，物品相互遮擋射線，會(huì)降低消毒效果編輯ppt3、洗手和著裝：原那么上和外科手術(shù)相同。在利用無(wú)菌箱工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，洗刷時(shí)一定要清洗到肘部。75％酒精，進(jìn)行擦洗消毒；必要時(shí)亦可用0.2％的新潔爾滅洗滌消毒。進(jìn)行培養(yǎng)工作時(shí)，如利用凈化臺(tái)，僅戴口罩和工作帽，著一般工作服即可。在無(wú)菌室內(nèi)工作需著消毒衣帽。編輯ppt二、火焰消毒：在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無(wú)菌操作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈或煤氣燈。以后操作，如安裝吸管帽、啟開(kāi)或封閉瓶口等，都需經(jīng)過(guò)火焰燒灼進(jìn)行。已吸取過(guò)營(yíng)養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼！因吸管頭中殘留營(yíng)養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時(shí)會(huì)把有害物帶入培養(yǎng)液中。消毒火焰要求無(wú)色或微藍(lán)色，而紅黃色或發(fā)黑的火苗，表示燃燒不完全或含有雜質(zhì)，有害物能混入培養(yǎng)液內(nèi)。因此酒精燈需用96％的不含雜質(zhì)的酒精，絕不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精。編輯ppt三、培養(yǎng)操作本卷須知1、進(jìn)行培養(yǎng)操作時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染時(shí)機(jī)。2、不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒觸及部，如不便消毒時(shí)，應(yīng)取備品更換。3、布局：原那么上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央(圖4-1)。工作由始至終要保持一定順序性。編輯ppt編輯ppt4、組織或細(xì)胞在末做處理之前，勿過(guò)早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在使用前，不要過(guò)早開(kāi)瓶；用過(guò)之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口。5、培養(yǎng)用瓶開(kāi)瓶以后，皆應(yīng)保持45度斜位或平放，吸取營(yíng)養(yǎng)液BSS、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。6、工作中不能面向操作野講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。編輯ppt

第三節(jié)根本培養(yǎng)操作技術(shù)編輯ppt一、傳代培養(yǎng)法當(dāng)初代培養(yǎng)成功，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖形成單層細(xì)胞后，進(jìn)而擴(kuò)展集合，占滿一切空間，此時(shí)需要進(jìn)行別離培養(yǎng)。這一操作稱傳代或再培養(yǎng)。80%集合或剛集合細(xì)胞是理想傳代階段。為什么要進(jìn)行傳代？編輯ppt1、貼壁細(xì)胞傳代編輯ppt貼壁細(xì)胞編輯ppt貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板、96孔板編輯ppt++++++++++++細(xì)胞的貼附過(guò)程貼附物質(zhì)帶正電荷細(xì)胞帶負(fù)電荷編輯ppt成纖維細(xì)胞：梭形、三角形、2-3個(gè)突起上皮細(xì)胞：扁平、多角形、園核可連成單層編輯ppt材料和試劑★Hela細(xì)胞★RPMI1640生長(zhǎng)液、碳酸氫鈉、雙抗EDTA消化液〔0.02%〕★培養(yǎng)瓶、無(wú)菌吸液管〔5ml、1ml〕、彎頭毛細(xì)滴管、廢液缸編輯ppt圖5-6消化法傳代培養(yǎng)步驟編輯ppt【程序】(1)吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液；(2)向瓶?jī)?nèi)參加EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限；(3)置溫箱中2～5分鐘(或在室溫中，把培養(yǎng)瓶放在倒立顯微鏡臺(tái)上鏡下觀察)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化；(4)吸除消化液編輯ppt(5)用吸管吸取營(yíng)養(yǎng)液〔已經(jīng)參加雙抗并調(diào)好pH值〕參加培養(yǎng)瓶，輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液；吹打勿用力過(guò)猛，以免傷害細(xì)胞；(6)計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后(如非實(shí)驗(yàn)用，不計(jì)數(shù)亦可)，把細(xì)胞懸液分成等份分裝入數(shù)個(gè)培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。編輯ppt2、懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

編輯ppt懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞編輯ppt編輯ppt材料和試劑★HL-60細(xì)胞★RPMI1640生長(zhǎng)液、碳酸氫鈉、雙抗★培養(yǎng)瓶、無(wú)菌吸液管〔5ml、1ml〕、彎頭毛細(xì)滴管、廢液缸編輯ppt二、操作步驟l、選生長(zhǎng)良好的HL-60細(xì)胞一瓶輕輕參加等量的生長(zhǎng)液。2、用無(wú)菌吸液管輕輕吹打，使HL-60細(xì)胞均勻懸浮然后吸出一半的細(xì)胞懸液加人另一個(gè)培養(yǎng)瓶中。3、如果細(xì)胞比較濃，可按1:3分配傳代培養(yǎng)。編輯ppt二、初代培養(yǎng)法

意義：初代培養(yǎng)或原代培養(yǎng)，是從供體獲取組織后的首次培養(yǎng)。其最大優(yōu)點(diǎn)是：組織和細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大的變化，具有二倍體遺傳性狀，在供體來(lái)源充分、生物條件穩(wěn)定的情況下(年齡、性別)，在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)。初代培養(yǎng)細(xì)胞是研究基因表達(dá)的理想系統(tǒng)。采用初代培養(yǎng)細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)，如藥物測(cè)試等效果也很好；初代培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系(株)必須經(jīng)過(guò)的階段。編輯ppt

1、原那么：幼體組織尤其是胚胎組織比年老個(gè)體的組織容易培養(yǎng)；分化程度低的組織比分化程度高的容易生長(zhǎng)；腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。一般在無(wú)特定要求時(shí)，取易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)，成功率高?！惨弧橙〔木庉媝pt本卷須知：取材之后，最好立即培養(yǎng)，如因故不能培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)把組織切成1立方厘米左右的小塊，置于培養(yǎng)液中，4℃貯存；存放時(shí)間不宜超過(guò)24小時(shí)。從體內(nèi)取材時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格保持無(wú)菌，取腫瘤和其它病理組織時(shí)容易帶菌，為減少污染，可用含500~1000單位／毫升的青、鏈霉素BSS液，漂洗5~10分鐘后再做培養(yǎng)處理。編輯ppt1、鼠組織取材各種組織取材編輯ppt2．取皮膚：人皮膚是常用的培養(yǎng)材料，對(duì)供體無(wú)特定要求時(shí)，可利用手術(shù)時(shí)取材：請(qǐng)術(shù)者手術(shù)時(shí)切取l~2cm2皮膚，即滿足培養(yǎng)要求。取皮膚時(shí)可在上臂和大腿內(nèi)側(cè)等處，先用肥皂洗凈取材部位皮膚，用75％酒精擦拭消毒2~3次(勿用碘酒)。取材方法可按如下兩種方法：一是用注射器針尖輕輕斜刺入表皮內(nèi)2毫米左右，向上挑起一個(gè)小的皮丘，然后用手術(shù)刀緊貼針尖下方，切下直徑2~3毫米小片，深度以創(chuàng)面微見(jiàn)血跡為度；二是用拇指和食指把取皮部皮膚緊捏起，在繃起的皮膚外表，用手術(shù)刀輕輕片取一小片表皮，大小和深度同前。編輯ppt3．取體液：血液白細(xì)胞是常用的培養(yǎng)材料，一般多用靜脈取血法。亦可從耳垂或指尖取血。從無(wú)名指肚取血很好，血多，消毒和取血都方便，刺口恢復(fù)很快不易感染。從手指取2~3滴血即夠一次培養(yǎng)，血用量多時(shí)需從靜脈采取。為防止凝血，常用肝素等抗凝劑；吸出血后拔掉針，立即把血注入無(wú)菌容器中備用。取骨髓組織、羊水、胸水和腹水可委托臨床有關(guān)科室，按不同手術(shù)規(guī)程取材。編輯ppt〔二〕組織的別離目的：為獲取多量生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，必須把組織細(xì)胞分散開(kāi)，使細(xì)胞解離出來(lái)；能到達(dá)單細(xì)胞水平更好，同時(shí)并不使細(xì)胞受傷害，細(xì)胞能很好生長(zhǎng)。分散組織的方法有離心法、機(jī)械法和化學(xué)法三種；編輯ppt1．離心別離法培養(yǎng)物為血液、羊水、腹水和胸水等細(xì)胞懸液時(shí)，可采用離心法別離。一般用低速500~1000轉(zhuǎn)／分速度，離心5~10分鐘即可。如懸液量大，離心時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，但如離心速度過(guò)大和時(shí)間太長(zhǎng)，易壓擠細(xì)胞使之受損或死亡。編輯ppt淋巴細(xì)胞別離法原理：淋巴細(xì)胞分層液(LyphocyteSeparationMedium)效果很好。分層液是根據(jù)細(xì)胞比重不同，使各類細(xì)胞相互分開(kāi)的。紅細(xì)胞比重1.092，淋巴細(xì)胞和大單核等白細(xì)胞比重為1.070；分層液適用于別離血中淋巴細(xì)胞。(1)取抗凝血假設(shè)干毫升；(2)按1:1參加無(wú)菌分層液(濾過(guò)除菌)后，800~1000轉(zhuǎn)離心；(3)無(wú)菌別離出白細(xì)胞(白細(xì)胞位于紅細(xì)胞上層，呈微白色)；(4)BSS漂洗1~2次，可用于培養(yǎng)或其它實(shí)驗(yàn)。注意：如用動(dòng)物血(如小鼠)，白細(xì)胞的比重與人不同；小鼠白細(xì)胞比重為l.080左右，需用相應(yīng)比重的分層液。編輯ppt2．機(jī)械分散法：切割別離法：在進(jìn)行組織塊培養(yǎng)時(shí)，可采用剪切法，一般多剪切成1mm3大小的塊。具體操作如下：編輯ppt無(wú)菌切取1cm3組織一塊，置入青霉素瓶或小燒杯中，左手斜持容器，右手持眼科尖剪或彎剪(剪柄較長(zhǎng)為好)伸入容器中，反復(fù)剪切組織至1mm3大小為止(成糊狀)。然后用吸管吸取Hanks液把附著在剪刀上的組織小塊沖下，并再補(bǔ)加3~5毫升Hanks液后，用吸管反復(fù)輕輕吸吹沖打片刻，低速離心、去上清、余下組織塊即可用于培養(yǎng)。剪刀剪切法可能對(duì)組織有一定損傷，但操作比較方便。編輯ppt壓擠法編輯ppt編輯ppt3．消化別離法：組織消化法是在把組織剪切成較小體積的根底上，應(yīng)用生化和化學(xué)手段進(jìn)一步分散組織的方法。最后成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，然后參加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)容器中后，細(xì)胞容易生長(zhǎng)增殖。各種消化劑的作用機(jī)制各不相同，根據(jù)組織的不同，可選用特定的消化手段。編輯ppt1．消化培養(yǎng)法(單細(xì)胞培養(yǎng)〕(三)原代細(xì)胞培養(yǎng)類型編輯ppt(1)準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺(tái)面，紫外線消毒20分鐘；注意：組織塊、胰蛋白酶、培養(yǎng)液等易受紫外線傷害的物品，最好在培養(yǎng)時(shí)再攜入操作野；如預(yù)先置入，需用紙張覆蓋，以免受射線影響；(2)處理組織：把組織塊置入燒杯中，用Hanks液漂洗2～3次，去除血污；如疑心組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30～60分鐘；(3)剪切：用眼科剪把組織塊切成2～3毫米大小的塊(用手術(shù)刀切割亦可)，以便于消化；編輯ppt(4)消化：參加比組織塊總量多30～50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞；或用恒溫水浴，或置)37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次，消化時(shí)間依組織塊的大小和組織的硬度而定。編輯ppt(5)別離：在消化過(guò)程中見(jiàn)消化液發(fā)混濁時(shí)，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過(guò)適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開(kāi)的組織塊(必要時(shí)可繼續(xù)進(jìn)行消化)；低速(500～1000轉(zhuǎn)／分)離心消化液5分鐘，吸出上清，參加適量含有血清的培養(yǎng)液(如用其它酶或EDTA等消化，需用Hanks液洗脫一兩次后，再參加培養(yǎng)液)；編輯ppt(7)計(jì)數(shù)：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過(guò)大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中；對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，pH要求在7.2～7.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說(shuō)明液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整；(8)培養(yǎng)：置入36.5度溫箱培養(yǎng)；如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時(shí)需更換新塞。編輯ppt編輯ppt2、組織塊培養(yǎng)法:

編輯ppt編輯ppt【程序】(1)剪切：把組織小塊(1cm3)置入小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗2～3次以去掉外表血污，吸凈Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切成lmm3塊為止；(2)擺布：用彎頭吸管吸取假設(shè)干小塊，置入培養(yǎng)瓶中；用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底上，小塊相互距離為0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布20～30塊；(3)輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，令瓶底向上；注意翻瓶時(shí)勿令組織小塊流動(dòng)，塞好瓶塞，置36.5℃溫箱2小時(shí)左右(勿超過(guò)4小時(shí))，使小塊微干涸；編輯ppt(4)培養(yǎng)：從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，開(kāi)塞，46度斜持培養(yǎng)瓶(瓶底仍向上)，向瓶底角部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶底上的組織小塊(組織小塊附著尚不牢，注意不要把組織塊沖走)；置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量增多后，再補(bǔ)加培養(yǎng)液。編輯ppt三、細(xì)胞計(jì)數(shù)一、原理

細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果以細(xì)胞數(shù)/毫升表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力。

用臺(tái)酚蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反響，也可測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力。

編輯ppt二、儀器、用品與試劑1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、試管、吸管

2、試劑：0.4％臺(tái)酚蘭(臺(tái)酚蘭0.4克加雙蒸水至100ml)3、材料：細(xì)胞懸液(細(xì)胞懸液的制備：用毛吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一小試管中，參加1滴臺(tái)盼藍(lán)染液〔0.4％〕或苯胺黑，混勻，靜置2－3min,活細(xì)胞不會(huì)被染色，而死細(xì)胞著藍(lán)色，這樣參加染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。)編輯ppt三、操作步驟

1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。3、靜置3分鐘。4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：〔細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)〕/ml＝〔四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)×稀釋倍數(shù)×104/ml編輯ppt說(shuō)明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以2于染液是1：1稀釋。公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板每一個(gè)大格的體積為：1.0mm〔長(zhǎng)〕×1.0mm〔寬〕×0.1mm〔高〕＝0.1mm3而1ml＝1000mm3。四、細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)1.要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否那么影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

編輯ppt3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)屢次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；4.數(shù)細(xì)胞的原那么是只數(shù)完整的細(xì)胞，假設(shè)細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，那么只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。5.操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑校衲敲匆匦掠?jì)數(shù)。

編輯ppt五、初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：

1.計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。

2.滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

3.滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。編輯ppt細(xì)胞計(jì)數(shù)原理編輯ppt編輯ppt四、細(xì)胞凍存1．原理：在不附加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中的水會(huì)結(jié)成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一系列變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。但如向細(xì)胞培養(yǎng)液中參加保護(hù)劑甘油或二甲基亞礬(DMSO)，可使冰點(diǎn)降低，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，可防止上述現(xiàn)象的發(fā)生。當(dāng)前最常用的保護(hù)劑仍為甘油和DMSO，它們對(duì)細(xì)胞無(wú)毒、分子量小、溶解度大、易穿透細(xì)胞，使用范圍在5％~15％之間，常用10％。編輯ppt2．要點(diǎn):為保持細(xì)胞最大存活率，一般都采用慢凍快融的方法。編輯ppt各種細(xì)胞對(duì)凍存速度的要求也不一樣；上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞耐受性可能大些，另外用什么防護(hù)劑適宜和用量多大，要依細(xì)胞而定，初代培養(yǎng)細(xì)胞用DMSO較好，一般細(xì)胞可用甘油；用量以較小為好。有人認(rèn)為人皮膚上皮細(xì)胞貯存在20％~30％甘油中很好。原那么上細(xì)胞在液氮中可貯存多年，但為妥善起見(jiàn)，凍存一年后，應(yīng)再?gòu)?fù)蘇培養(yǎng)一次，然后再繼續(xù)凍存。編輯ppt編輯ppt[程序](1)細(xì)胞處理：選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；收集細(xì)胞24小時(shí)前換液一次；(2)凍存液：先用培養(yǎng)液9分+DMSO1分(或甘油)配成10％的DMSO凍存液；按按常規(guī)法把細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)、令細(xì)胞密度達(dá)107／ml(一般用4瓶細(xì)胞)，(4)分裝：分裝入無(wú)菌凍存管中，每管加1.5毫升細(xì)胞懸液；(5)封口：擰緊凍存管蓋，仔細(xì)檢查，定要封嚴(yán)，必要時(shí)可浸入藍(lán)色液中觀察；編輯ppt〔6〕入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時(shí)因受熱發(fā)生爆炸傷人；紗袋一端系以線繩，末端扎有小牌，注明：細(xì)胞名稱，凍存日期，以便日后查找；(7)凍存：當(dāng)前已有專用細(xì)胞凍存器；在無(wú)凍存器的情況下，可用手工方法：4℃1h、-20℃2h、85℃1h、從把凍存物懸在液氮罐口開(kāi)始算起，按-1℃~-12℃／分鐘速度，在30~40分鐘內(nèi)，下降到液氮面，再停30分鐘后，直投入液氮中。注意：①操作時(shí)應(yīng)帶保護(hù)眼鏡和手套，以免液氮傷人；②細(xì)胞注入安瓶中后一定封嚴(yán)，最好使用塑料制螺口安額，但一定要擰緊螺帽。編輯ppt五、冷凍細(xì)胞復(fù)蘇方法

編輯ppt[程序](1)從液氮罐中取出凍存管；有時(shí)凍存管因末封嚴(yán)，浸入了液氮，取出后因安額內(nèi)液氮迅速氣化而發(fā)生爆炸(力量有限)，因此應(yīng)帶防護(hù)眼鏡和手套；(2)迅速放入盛有36~37℃水的搪瓷罐中，扣上蓋并不時(shí)搖動(dòng)，盡快解凍，要在一分鐘內(nèi)溶解；(3)用70％酒精擦試消毒后，凈化臺(tái)上翻開(kāi)蓋，用吸管吸出細(xì)胞懸液，裝入離心管中，再補(bǔ)加10ml培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞懸浮；編輯ppt(4)低速離心(500~1000轉(zhuǎn)／分)5分鐘。(5)去上清，參加培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，再移裝入培養(yǎng)瓶中，置溫箱培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。注意：凍存細(xì)胞數(shù)量要充分，在融解后能允許做1：10倍或1：20倍的稀釋(細(xì)胞數(shù)／毫升)；一般每瓶細(xì)胞接種濃度為5×105／m1，因此凍存密度應(yīng)到達(dá)107／ml，在稀釋20倍時(shí)，仍能保持5×105／ml數(shù)量。編輯ppt六、細(xì)胞運(yùn)送一是用液氮或干冰保存，效果較好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸發(fā)均較快，適于空運(yùn)，比較麻煩；編輯ppt二為充液法：(1)選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，待達(dá)80％或90％集合時(shí)，去掉舊培養(yǎng)液換入新培養(yǎng)液，量要到達(dá)培養(yǎng)瓶的頸部(過(guò)滿易污染)，保存少許空間，塞緊瓶塞；空氣過(guò)多運(yùn)輸中氣泡運(yùn)動(dòng)易使細(xì)胞脫落；(2)妥善包裝和運(yùn)送；一般在不超過(guò)四五天到達(dá)目的地的情況下，對(duì)細(xì)胞活力無(wú)嚴(yán)重影響；(3)到達(dá)后，倒出大局部培養(yǎng)液，保存正常量，置37℃培養(yǎng)，次日傳代。編輯ppt七、收到細(xì)胞的處理方式1.收到細(xì)胞株包裹時(shí)，請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形，假設(shè)有請(qǐng)立即通知。細(xì)胞株請(qǐng)盡速開(kāi)始培養(yǎng)，或立即冷凍保存(置于–70°C，隔夜后，移到液氮)。2.冷凍細(xì)胞解凍程序:1〕依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之根底培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。2〕FBS(fetalbovineserum,胚牛血清),CS(calfserum,小牛血清)和HS(horseserum,馬血清)，對(duì)細(xì)胞而言差異極大，請(qǐng)務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。

編輯ppt3〕將培養(yǎng)基置于37°C水槽中回溫，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化后，回溫后噴以