循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)

第44卷第5期■專題綜述*張?zhí)烊虎佗冖?高正良①②?,鄧丹④??屬上海市養(yǎng)志康復(fù)醫(yī)院基礎(chǔ)研究中心，上海201619；③復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海市重大傳染病和生物安全循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells,CTCs)發(fā)現(xiàn)，尤其是在近20多年來，伴隨CTCs生物學(xué)1CTCs基礎(chǔ)生物學(xué)腫瘤轉(zhuǎn)移和散播是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。CTCs是從原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤中脫落并進(jìn)入血對疾病進(jìn)展至關(guān)重要[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移和散播是一個到達(dá)遠(yuǎn)端組織[2]。概括而言，CTCs的形成和轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷上皮–間質(zhì)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞微環(huán)境也隨之改變[3]。一旦CTCs離開循環(huán)后在遠(yuǎn)端組織中成腫瘤轉(zhuǎn)移和散播[4-5](圖1)。顯然，CTCs是腫瘤轉(zhuǎn)移的中間階段和載體，但是具有腫瘤干細(xì)胞特征和起始能力的CTCs只是少數(shù)，最終形成克隆、造成轉(zhuǎn)移和散E-mail:dengdan1234567@12播新病灶的則更罕見。即便是在腫瘤高度擴(kuò)散的情況下，單個患者的轉(zhuǎn)移病灶通常也不超過數(shù)百個，不是每個CTC都能夠起始新的病灶，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和散播[6-7]。相反，在外周循環(huán)中，大多數(shù)CTCs由于受到物理壓力、氧化應(yīng)激、免疫攻擊以及生長因子和細(xì)胞因子的饑餓或者刺激，而死于循環(huán)和轉(zhuǎn)移過程[8-9]；少部分CTCs成功進(jìn)入遠(yuǎn)端組織，在新的微環(huán)境中暫停號，部分休眠CTCs被喚醒激活，重新進(jìn)入細(xì)胞腺癌和前列腺癌中，休眠的CTCs甚至可以導(dǎo)致早期診斷偏差及治療數(shù)年后的復(fù)發(fā)，并產(chǎn)生繼發(fā)性CTCs[11]。CTC簇是指具有穩(wěn)定細(xì)胞間連接、可以共同穿過血流的含有兩個及兩個以上細(xì)胞的CTC團(tuán)，或三個及更多CTCs聚集而成的循環(huán)腫瘤微栓塞(circulatingtumormicroem腫瘤微環(huán)境是由浸潤的免疫細(xì)胞及與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)等組成，對腫瘤細(xì)胞的起始、生長、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移具有重大影響[14-15]。CTC簇的形成可以是皮細(xì)胞、周細(xì)胞等的存在，可以增加細(xì)胞簇中CTCs的生存力，抵抗或逃避壓力和免疫攻擊，境”而獲得獨(dú)特的生存優(yōu)勢[18-19]。體外使用微流理，更好地解析微環(huán)境對CTCs轉(zhuǎn)移的影響并進(jìn)行抗轉(zhuǎn)移藥物的篩選[20]。盡管CTC簇在外周循環(huán)中十分稀少，遠(yuǎn)少于單個CTC的數(shù)量，但是CTC簇細(xì)胞中Oct4、Nanog和Sox2等多能性轉(zhuǎn)錄因子在基因組上的結(jié)具有明顯的干細(xì)胞特征，因而具有更強(qiáng)(20～100第44卷第5期■專題綜述成和較強(qiáng)轉(zhuǎn)移潛能的決定性因素[22]。當(dāng)外科手術(shù)存在CTM時(shí)，CTCs轉(zhuǎn)移增加，外周血中CTCsCTC簇還可以迅速發(fā)生可逆性重塑，形成鏈狀結(jié)耐藥性和復(fù)發(fā)息息相關(guān)[25]。單細(xì)胞分析表明，ITH的程度，并對預(yù)后和耐藥的研究具有重要意義[1]。腫瘤細(xì)胞傳播的路徑(淋巴管或血管)、入環(huán)境互相作用或隨機(jī)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng))、壓力(比如腫瘤治療)不同，都可能導(dǎo)致CTCs的異質(zhì)性，甚至采血部位不同檢測到的異質(zhì)性也會不同[26-27]。究表明EpCAM-和/或CK-的CTCs的存在[28-29]，使得分離純化代表性的CTCs亞群變得更加具有挑戰(zhàn)。而患有雌激素受體(ER)+/人類表皮生長因子CTCs能夠共存，并相互動態(tài)轉(zhuǎn)換[30]。腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)程序的激活是腫瘤轉(zhuǎn)移、散播過程中的關(guān)鍵事件，也是CTCs異質(zhì)性產(chǎn)生的一個重要環(huán)節(jié)。從原發(fā)性腫瘤中脫落的單個腫瘤細(xì)胞侵入血管并流向全身，部分細(xì)胞失去上皮特征，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征；在離開血液進(jìn)入遠(yuǎn)端組織時(shí)，再經(jīng)歷間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化EMT能夠?qū)е旅撀涞哪[瘤細(xì)胞(CTCs)上皮標(biāo)志瘤侵襲和EMT的特征[32-33]。EMT過程中E型鈣黏蛋白(E-cadherin)丟失，細(xì)胞間黏附破壞，β-聯(lián)蛋白(β-catenin)核定位增加，而在間質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)組織和癌細(xì)胞中高度表達(dá)的N型鈣黏蛋白(N-cadherin)升高[34]。遷移CTC簇保留了細(xì)胞間連接和間質(zhì)特征，顯示出更高的轉(zhuǎn)移潛能[22,35]。血小板不僅可以黏附圍繞CTCs形成細(xì)胞纖維蛋白-血小板聚集體，以對抗剪切應(yīng)力、氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)，保護(hù)CTCs；而且活化的血小板可以通過分泌生長因子和細(xì)胞因子(如TNF-α和β)促進(jìn)EMT的發(fā)生，增加CTCs的侵襲性、活動性和轉(zhuǎn)移潛力[17,36]。脆弱細(xì)菌、糞腸球菌、大腸桿菌和核纖梭菌等微生物產(chǎn)生的代謝物和細(xì)胞因子也可以促進(jìn)CTCs的增殖、遷移及EMT的發(fā)生，其產(chǎn)生的毒素也能夠從上皮細(xì)胞中清除E-cadherin，引發(fā)EMT，促進(jìn)CTCs進(jìn)入靜息或休眠狀態(tài)，逃避攻擊，得以存活[37-38]。然而，EMT對于轉(zhuǎn)移灶的建立并不是必需的，是否激活或部分激活EMT程序取決于細(xì)胞所處的環(huán)境[31]，因而使得部分CTCs在保留上皮致高度的可塑性和異質(zhì)性。大多數(shù)CTC簇中含有瘤細(xì)胞[6,33]。2CTCs的分離純化和分子分析血液中CTCs的數(shù)量稀少，如何從大量的血細(xì)胞中高效分離純化CTCs是其生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用的關(guān)鍵前提。盡管CTCs早在1869年已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)報(bào)道，但是直到二十世紀(jì)五六十年代，過濾、沉淀分離純化CTCs的方法才出現(xiàn)[39-40]，珠方法，到1998年才問世[41-42]。從血液樣本中分離純化CTCs的方法有多種(圖3)：按照分離原理可分為基于物理特征(如大小和形狀、密度、可變形性、細(xì)胞表面電荷等)和基于生物特征(表面蛋白標(biāo)記、胞內(nèi)蛋白標(biāo)記、細(xì)胞遷移能力等)的方法；按照分離策略可分為對CTCs的正向選擇量又可以分為單細(xì)胞分離或多細(xì)胞富集[7,28,43]。不同的分離純化方法的效果以及分離后CTCs存活和可培養(yǎng)狀態(tài)不同，后期能夠開展的研究和應(yīng)用項(xiàng)目也會不同，給CTCs分離純化方法、方大增加了高效分離純化具有種群代表性的CTCs的難度。分離純化技術(shù)必須設(shè)計(jì)合理且足夠靈敏，才能夠有效獲取包括CTC簇在內(nèi)的稀有異將CTC按照尺寸和形狀、可變形性、密度和細(xì)胞表面電荷等物理特征進(jìn)行分離是較為簡便快捷的分離方法。在裂紅處理后，血液樣本大小約20~30μm，比白細(xì)胞(8~12μm)及其他有核血液細(xì)胞都大，形態(tài)也截然不同。因此通過選擇不同大小和形狀的孔，可以將二者分離，不過這種簡捷的過濾技術(shù)常伴隨部分較大白細(xì)胞的殘留[4,44]。ISET循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲儀(Rarecells)是基于第44卷第5期■專題綜述腫瘤細(xì)胞大小的分離方法。非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌的研究表明該方法的處理細(xì)胞量較大，可以得到較為準(zhǔn)確的CTCs計(jì)數(shù)[45-46]。初步分離純化的CTCs可以用抗全細(xì)胞角蛋白(PanCK)、EpCAM、CD45/CD66b/CD34/CD11b/CD14、波形蛋白(Vim)和CD45等的商業(yè)免疫熒光試劑盒進(jìn)一步鑒定分析[47]。血液樣本也可以與ScreenCellFC稀釋緩沖液混合裂紅，并固定白細(xì)胞和CTCs，通過ScreenCell微孔膜過濾器過濾截留收集CTCs；然后可將濾膜置于載玻片上，進(jìn)行蘇木精-曙紅(H＆E)染色觀察。具有惡性特征的CTCs通?！?0μm，細(xì)胞核致密，核/胞質(zhì)比≥0.75[5,48]。以CTChip?FR生物芯片為核心技術(shù)的ClearCell?FX平臺是世界上最早的自動化細(xì)胞檢索系統(tǒng)之一。它不依賴于細(xì)胞表面標(biāo)記，而是基于迪恩流動分餾(Dean?owfractionation,DFF)渦旋原理，利用CTCs與正常血細(xì)胞受力的差異將CTCs溫和而快速地分離出來，因此，能夠在相對較短的時(shí)間內(nèi)從血液中富集完整有活力的CTCs[49-50]。與微濾裝置不同，柔性微型彈簧陣列(?exiblemicrospringarray細(xì)胞大小和變形性，利用固定在兩個聚二甲基硅氧烷(PDMS)的密封O形圈之間的柔性微型彈簧陣列進(jìn)行CTCs的選擇性富集。該方法利用壓樣品預(yù)處理，利用微陣列直接從全血中快速富集CTCs后用杜氏磷酸緩沖鹽溶液反向洗脫收集CTCs[4,44]。Parsortix系統(tǒng)利用CTCs的變形特置間形成的一定尺寸的間隙對CTCs進(jìn)行攔截后逆流回收捕獲，可以兼容自動染色功能進(jìn)行細(xì)能夠存活并應(yīng)用于下游研究和分析[51]。流體芯片則利用并行流體通道網(wǎng)絡(luò)，形成56320個捕獲室，較小的血細(xì)胞(如紅細(xì)胞)和大多數(shù)白細(xì)胞會逸出，而較大的CTCs則被捕獲留存在腔室內(nèi)[52]。改性埃洛石納米管(HNT)也可以用于分離純化CTCs：有黏附蛋白時(shí)，帶負(fù)電荷的十二烷酸鈉官能化可以增強(qiáng)HNT對CTCs的吸附和捕獲，降低白細(xì)胞的黏附；沒有黏附蛋白時(shí)，癸基三甲基溴化銨官能化導(dǎo)致HNT帶電降低，減少CTCs的黏附，增強(qiáng)白細(xì)胞的黏附達(dá)到正向選擇和負(fù)向耗竭的雙重效果[53]。OncoBio-One)的原理是密度梯度離心，被成功應(yīng)用于乳腺癌CTCs的分離純化[25,54]。最常用的基于CTCs生物學(xué)特征的分離方法是免疫親和技術(shù)，大多使用特定表面標(biāo)記物，如上皮細(xì)胞標(biāo)志物和細(xì)胞骨架蛋白標(biāo)志物(細(xì)胞角蛋白CKs和EpCAM)的免疫親和作用將CTCs與其他細(xì)胞區(qū)分開[55]。不過由于CTC簇混合了上皮-間質(zhì)特征，這種基于上皮標(biāo)記物的方法潛在地會低估CTC簇的數(shù)量，不能有效檢測出間質(zhì)樣細(xì)胞[56]?；诿庖哂H和原理的CellSearchSystem是目前最為常用的CTCs臨床檢測系統(tǒng)，由CellPrep功能單元、CellSearch試劑盒和CellSpotter分析儀組成。作為較成熟的系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定、可重復(fù)，缺點(diǎn)是靈敏度受到統(tǒng)計(jì)因素和血量等限制，且只能檢測上皮樣CTCs[4,57]。AdnaTestBreastCancerSelect系統(tǒng)和改進(jìn)版AdnaTestCTCAR-V7mRNA則被用于乳腺癌和去勢抵抗性前列腺癌CTCs的檢測分析，利用磁珠偶聯(lián)的腫瘤特異性抗體和EpCAM抗體的免疫親和作用捕捉外周血中的CTCs，然后通過磁性顆粒濃縮器(MPC)進(jìn)行富集[58-59]。此外還有IsoFlux系統(tǒng)、HB-Chip、EasySep、磁免疫脂質(zhì)體(MIL)等技術(shù)體系，均是基于免疫親和原理，利用EpCAM、CD45和腫瘤細(xì)胞、白細(xì)胞、造血干細(xì)胞、血小板的特異性標(biāo)志物抗體單獨(dú)或聯(lián)合與免疫磁珠偶聯(lián)，提高富集程度和敏感性[18,60-61]。霉親和素與相關(guān)細(xì)胞表面抗原抗體進(jìn)行CTCs的插入靜脈，經(jīng)過30min即可對EpCAM和/或細(xì)胞導(dǎo)線與EpCAM等抗體共價(jià)偶聯(lián)，直接從癌癥患者的手臂靜脈內(nèi)分離CTCs[64-65]。Vita-Assay培養(yǎng)板則是基于侵入性CTCs與組織或腫瘤微環(huán)境模擬物(細(xì)胞黏附基質(zhì)或CAM)的高強(qiáng)度黏附力來識別捕捉CTCs的，能將血液中的CTCs富集到100萬倍[66]?？傮w而言，分離純化是CTCs領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和關(guān)鍵，其技術(shù)方法一直在快速進(jìn)展和優(yōu)化迭代中。比如基于病毒轉(zhuǎn)染報(bào)告基因的CTCs分離純化方法：通過病毒轉(zhuǎn)染端粒酶特異、復(fù)制選擇性的GFP報(bào)告基因腺病毒比如TelomeScan(OBP-401;rAd-GFP)或者TelomeScanF35(OPB-1101;rAdF35-142T-GFP)在CTCs細(xì)胞中特異性地產(chǎn)生可以用來識別的GFP信號[67-68]。綜合應(yīng)用物理和生物學(xué)特性的分離方法，發(fā)揮二者優(yōu)勢，規(guī)避各自的劣勢。比如：將Ficoll-PaquePLUS密度梯度分離技術(shù)與流式細(xì)胞檢測結(jié)合，用Ficoll-PaquePLUS密度梯度純化富集肝癌病人全血樣品中的CTCs細(xì)胞，然后利用肝特異性標(biāo)志物抗體三聯(lián)免疫熒光染色后進(jìn)行流式細(xì)胞分析和分選[69]；或者是將過濾分離純化與RNA原位雜交(RNA-ISH)分析方法結(jié)合，比如CanPatrol技術(shù)[70]；還有將微孔硅芯片、熒光成像和穿孔技術(shù)等結(jié)合，比如PunchVyCACTCs分離成功率可以達(dá)到80%~90%[71]。CTCs分離純化后，可以用H&E染色、免疫熒光染色、ELISA、PAGE、流式細(xì)胞分析等技術(shù)對CTCs進(jìn)行計(jì)數(shù)、鑒定和分析，也可以使用免疫染色結(jié)合熒光原位雜交(FISH)、實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)和各種組學(xué)等檢測基因組畸變，評估基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平等。不過，回收CTCs和所含核酸的數(shù)量、質(zhì)量受到體內(nèi)外和分離純化過程的影響，給常規(guī)分析帶來一定的挑戰(zhàn)，而采用全基因組測序(WGS)或全外顯子測序(WES)對CTCs群體進(jìn)行分析，可以解決諸如細(xì)胞丟失或遺傳物質(zhì)受損等問題，獲得高質(zhì)量的測序文庫[72]。CTCs基因組的擴(kuò)增有三種常用的方法：簡并寡核苷酸引發(fā)的聚合酶鏈反應(yīng)(DOP-PCR)、多重置換擴(kuò)增(MDA)和多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(MALBAC)。DOP-PCR可以用于擴(kuò)增單個細(xì)胞來源的DNA，但基因組覆蓋率低(約10％)，可以用于拷貝數(shù)的評估，但不足以實(shí)現(xiàn)良好的單核苷酸變異檢測(SNV)。與DOR-PCR剛好相反，MDA技術(shù)可以有效檢測突變，但是基因組覆蓋范圍不均衡，不適合拷貝數(shù)分析。MALBAC方法可以獲得較高且均勻的基因組覆蓋率(93％)，對于拷貝數(shù)變異檢測很有用，但假陽性率高，不適合檢測點(diǎn)突變[73-75]。CTC轉(zhuǎn)錄組的分析方法學(xué)進(jìn)展也很快，包括能夠擴(kuò)增全長轉(zhuǎn)錄本或3端區(qū)域的Smart-seq2、CEL-seq、STRT序列等方法[76-77]。隨著微流控和單將會越來越簡捷、可靠和強(qiáng)大。3CTCs與腫瘤精準(zhǔn)、個體化醫(yī)學(xué)究方面具有巨大的潛力[78-79]。腫瘤“液體活檢”進(jìn)展信息，包括早期腫瘤診斷、風(fēng)險(xiǎn)評估和分期、療效、預(yù)后、復(fù)發(fā)檢測和監(jiān)控等[80]。主要檢測對象包括細(xì)胞形式的CTCs(簇)、非細(xì)胞形式循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、microRNA和RNA以及cfDNA、CTCs和胞外囊泡等代表著腫瘤液體活檢的最前沿和重要進(jìn)展，在腫瘤診斷、預(yù)后等cfDNA和胞外囊泡比CTCs的分離更加簡捷，但cfDNA和胞外囊泡等適用的分析比較有限，比如cfDNA主要用于基因組突變的分析[83]，CTCs第44卷第5期■專題綜述則可以開展諸多其他分析，包括細(xì)胞形態(tài)、免疫表型和重要表位分析，腫瘤細(xì)胞克隆異質(zhì)性與進(jìn)化分析，表觀遺傳組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組分析[16,84]。此外，目前臨床上常用的穿刺取樣給患者帶來巨大的疼痛和不便，并且可能無法獲得所需的腫瘤細(xì)胞，取樣過程的侵入性還有增加癌轉(zhuǎn)移的潛在風(fēng)險(xiǎn)。相比而言，基于CTCs的液體活檢在臨床檢測中具有很大的優(yōu)細(xì)、動態(tài)和個性化的信息，從而支持、指導(dǎo)精準(zhǔn)、個體化醫(yī)療決策和實(shí)踐[65,85]。CTCs的不同特性與癌癥類型、分期和治療應(yīng)答緊密關(guān)聯(lián)，如CTCs的物理屬性、計(jì)數(shù)、微CTCs計(jì)數(shù)和濃度變化則與腫瘤負(fù)荷有關(guān)，具有部分EMT表型的CTCs與腫瘤的進(jìn)展、預(yù)后及早期復(fù)發(fā)相關(guān)[86-87]。因此CTCs在腫瘤精準(zhǔn)、個體理策略，以及直接靶向CTCs作為消除轉(zhuǎn)移亞群重要指導(dǎo)價(jià)值[88-89]。事實(shí)上，隨著技術(shù)的進(jìn)展，CTCs分析日益成為評估腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的首選方法，每7.5mL血液含有5個以上CTCs成為判定腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的領(lǐng)域共識[90]。不僅如此，具有高轉(zhuǎn)移潛能的CTC(簇)通常具有總體基因組DNA低甲基化和局部位點(diǎn)的超甲基化的特點(diǎn)，因此通過分析CTCs的CpG島的甲基化模式可以幫助確定腫瘤的來源[21,83,91]。同時(shí)，類似于DNA甲基化這提供了新的路徑和可能[92]。CTCs分析的價(jià)值在的推廣應(yīng)用[93-94]。腫瘤類器官等培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)合更加拓展了CTCs的臨床應(yīng)用路徑和價(jià)值。已知的CTCs臨床前模型有單層細(xì)胞培養(yǎng)、三維細(xì)胞球培養(yǎng)、三維腫瘤類器官和CTCs衍生的外植體(CDX/PDX)模型等[95-96]。來源于CTCs的培養(yǎng)物可用于藥物篩物庫的建立等(圖4)。通過培養(yǎng)和后續(xù)分析，可以對具有轉(zhuǎn)移能力的CTCs進(jìn)行功能解析，深入物敏感性篩選[97]。4結(jié)語自澳大利亞病理學(xué)家托馬斯·阿什沃思于1869年首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道CTCs，歷經(jīng)百余年，特別是近20年來，隨著CTCs分離純化技術(shù)的快速進(jìn)展，CTCs生物學(xué)研究取得巨大進(jìn)步，CTCs的生突破促進(jìn)了基于CTCs的腫瘤液體活檢技術(shù)的快醫(yī)學(xué)對疾病診療動態(tài)監(jiān)控監(jiān)測的迫切、巨大需求；而CTCs與新興二代、三代組學(xué)、多組學(xué)及類器官等技術(shù)的結(jié)合將廣泛拓展CTCs在腫瘤精[1]CASTRO-GINERF,ACETON.Trackingcancerprogression:fromcirculatingtumorcellstometastasis[J].GenomeMed,2020,12(1):31.[2]OLMEDAD,CEREZO-WALLISD,RIVEIRO-FALKENBACHE,etal.Whole-bodyimagingoflymphovascularnichesidenti?espre-metastaticrolesofmidkine[J].Nature,2017,546(7660):676-680.[3]ZHONGX,ZHANGH,ZHUY,etal.Circulatingtumorcellsincancerpatients:developmentsandclinicalapplicationsforimmunotherapy[J].MolCancer,2020,19(1):15.[4]FABISIEWICZA,GRZYBOWSKAE.CTCclustersincancerprogressionandmetastasis[J].MedOncol,2017,34(1):12.[5]MASCALCHIM,MADDAUC,SALIL,etal.Circulatingtumorcellsandmicroembolicandifferentiatemalignantandbenignpulmonarylesions[J].JCancer,2017,8(12):2223-2230.[6]TAYOUNT,FAUGEROUXV,OULHENM,etal.CTC-derivedmodels:awindowintotheseedingcapacityofcirculatingtumorcells(CTCs)[J].Cells,2019,8(10):1145.[7]GARCIASA,WEITZJ,SCHOLCHS.Circulatingtumorcells[J].MethodsMolBiol,2018,1692:213-219.[8]GOMISRR,GAWRZAKS.Tumorcelldormancy[J].MolOncol,2017,11(1):62-78.[9]VERA-RAMIREZL,HUNTERKW.Tumorcelldormancyasanadaptivecellstressresponsemechanism[J].F1000Res,2017,6:2134.[10]KANGY,PANTELK.Tumorcelldissemination:emergingbiologicalinsightsfromanimalmodelsandcancerpatients[J].CancerCell,2013,23(5):573-581.[11]ZHANGZ,SHIRATSUCHIH,LINJ,etal.ExpansionofCTCsfromearlystagelungcancerpatientsusingamicro?uidicco-culturemodel[J].Oncotarget,2014,5(23):12383-12397.[12]OKABET,TOGOS,FUJIMOTOY,etal.Mesenchymalcharacteristicsandpredictivebiomarkersoncirculatingtumorcellsfortherapeuticstrategy[J].Cancers,2020,12(12):3588.[13]ZEIDMANI,BUSSJM.Transpulmonarypassageoftumorcellemboli[J].CancerRes,1952,12(10):731-733.[14]GRETENFR,GRIVENNIKOVSI.Inflammationandcancer:triggers,mechanisms,andconsequences[J].Immunity,2019,51(1):27-41.[15]LUC,RONGD,ZHANGB,etal.Currentperspectivesontheimmunosuppressivetumormicroenvironmentinhepatocellularcarcinoma:challengesandopportunities[J].MolCancer,2019,18(1):130.[16]HWANGWL,HWANGKL,MIYAMOTODT.Thepromiseofcirculatingtumorcellsforprecisioncancertherapy[J].BiomarkMed,2016,10(12):1269-1285.[17]GARRIDO-NAVASC,DEMIGUEL-PEREZD,EXPOSITO-HERNANDEZJ,etal.Cooperativeandescapingmechanismsbetweencirculatingtumorcellsandbloodconstituents[J].Cells,2019,8(11):1382.[18]AlVAA,FRIEDLANDERT,CLARKM,etal.Circulatingtumorcellsaspotentialbiomarkersinbladdercancer[J].JUrol,2015,194(3):790-798.[19]HONGY,FANGF,ZHANGQ.Circulatingtumorcellclusters:Whatweknowandwhatweexpect(review)[J].IntJOncol,2016,49(6):2206-2216.[20]LINZ,LUOG,DUW,etal.Recentadvancesinmicrofluidicplatformsappliedincancermetastasis:circulatingtumorcells'(CTCs)isolationandtumor-on-a-chip[J].Small,2020,16(9):e1903899.[21]GKOUNTELAS,CASTRO-GINERF,SZCZERBABM,etal.Circulatingtumorcellclusteringshapesdnamethylationtoenablemetastasisseeding[J].Cell,2019,176(1/2):98-112e14.[22]CHEUNGKJ,PADMANABANV,SILVESTRIV,etal.Polyclonalbreastcancermetastasesarisefromcollectivedisseminationofkeratin14-expressingtumorcellclusters[J].ProcNatlAcadSciUSA,2016,113(7):E854-E863.[23]SCHUSTERE,TAFTAFR,REDUZZIC,etal.Bettertogether:circulatingtumorcellclusteringinmetastaticcancer[J].TrendsCancer,2021,7(11):1020-1032.[24]AUSH,STOREYBD,MOOREJC,etal.Clustersofcirculatingtumorcellstraversecapillary-sizedvessels[J].ProcNatlAcadSciUSA,2016,113(18):4947-4952.[25]LIMSB,LIMCT,LIMWT.Single-cellanalysisofcirculatingtumorcells:whyheterogeneitymatters[J].Cancers,2019,11(10):1595.[26]SUNYF,GUOW,XUY,etal.Circulatingtumorcellsfromdifferentvascularsitesexhibitspatialheterogeneityinepithelialandmesenchymalcompositionanddistinctclinicalsigni?canceinhepatocellularcarcinoma[J].ClinCancerRes,2018,24(3):547-559.[27]KELLERL,PANTELK.Unravellingtumourheterogeneitybysingle-cellpro?lingofcirculatingtumourcells[J].NatRevCancer,2019,19(10):553-567.[28]FERREIRAMM,RAMANIVC,JEFFREYSS.Circulatingtumorcelltechnologies[J].MolOncol,2016,10(3):374-394.[29]QIUJ,XUX,ZHANGK,etal.Re?ningcancermanagementusingintegratedliquidbiopsy[J].Theranostics,2020,10(5):2374-2384.[30]JORDANNV,BARDIAA,WITTNERB,etal.HER2expressionidenti?esdynamicfunctionalstateswithincirculatingbreastcancercells[J].Nature,2016,537(7618):102-106.[31]RODRIGUEZ-AZNARE,WIESMüLLERL,SAINZBJR,etal.EMTandstemness-keyplayersinpancreaticcancerstemcells[J].Cancers,2019,11(8):1136.[32]PORUKKE,BLACKFORDAL,WEISSMJ,etal.Circulatingtumorcellsexpressingmarkersoftumor-initiatingcellspredictpoorsurvivalandcancerrecurrenceinpatientswithpancreaticductaladenocarcinoma[J].ClinCancerRes,2017,23(11):2681-2690.[33]AGNOLETTOC,CORRàF,MINOTTIL,etal.Heterogeneityincirculatingtumorcells:therelevanceofthestem-cellsubset[J].Cancers,2019,11(4):483.[34]SERRANOMJ,ORTEGAFG,ALVAREZ-CUBEROMJ,etal.EMTandEGFRinCTCscytokeratinnegativenon-metastaticbreastcancer[J].Oncotarget,2014,5(17):7486-7497.[35]LAMBERTAW,PATTABIRAMANDR,WEINBERGRA.Emergingbiologicalprinciplesofmetastasis[J].Cell,2017,168(4):670-691.[36]BESTMG,SOLN,IN'TVELDSGJG,etal.Swarmintelligence-enhanceddetectionofnon-small-celllungcancerusingtumor-educatedplatelets[J].CancerCell,2017,32(2):238-252e9.[37]WYNENDAELEE,VERBEKEF,D'HONDTM,etal.Crosstalkbetweenthemicrobiomeandcancercellsbyquorumsensingpeptides[J].Peptides,2015,64:40-48.[38]SUNJY,YINTL,ZHOUJ,etal.Gutmicrobiomeandcancerimmunotherapy[J].JCellPhysiol,2020,235(5):4082-4088.■專題綜述[39]SALGADOI,HOPKIRKJF,LONGRC,etal.Tumourcellsintheblood[J].CanMedAssocJ,1959,81:619-622.[40]ALEXANDERRF,SPRIGGSAI.Thedifferentialdiagnosisoftumourcellsincirculatingblood[J].JClinPathol,1960,13:414-424.[41]RACILAE,EUHUSD,EUHUSAJ,etal.Detectionandcharacterizationofcarcinomacellsintheblood[J].ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(8):4589-4594.[42]LIUP,JONKHEIJMP,TERSTAPPENLWMM,etal.MagneticparticlesforCTCenrichment[J].Cancers,2020,12(12):3525.[43]THIELEJA,BETHELBK,KRáLíCKOVáM,etal.Circulatingtumorcells:?uidsurrogatesofsolidtumors[J].AnnuRevPathol,2017,12:419-447.[44]HAROUAKARA,ZHOUMD,YEHYT,etal.Flexiblemicrospringarraydeviceforhigh-throughputenrichmentofviablecirculatingtumorcells[J].ClinChem,2014,60(2):323-333.[45]BRONCYL,PATERLINI-BRéCHOTP.Clinicalimpactofcirculatingtumorcellsinpatientswithlocalizedprostatecancer[J].Cells,2019,8(7):676.[46]TAMMINGAM,ANDREEKC,HILTERMANNTJN,etal.Detectionofcirculatingtumorcellsinthediagnosticleukapheresisproductofnon-small-celllungcancerpatientscomparingCellSearch?andISET[J].Cancers,2020,12(4):896.[47]VANDERTOOMEE,GROOTVP,GLAVARISSA,etal.AnalogousdetectionofcirculatingtumorcellsusingtheAccuCyte?-CyteFinder?systemandISETsysteminpatientswithlocallyadvancedandmetastaticprostatecancer[J].Prostate,2018,78(4):300-307.[48]COCOS,ALAMAA,VANNII,etal.Circulatingcell-freeDNAandcirculatingtumorcellsasprognosticandpredictivebiomarkersinadvancednon-smallcelllungcancerpatientstreatedwith?rst-linechemotherapy[J].IntJMolSci,2017,18(5):1035.[49]LEEY,GUANG,BHAGATAA.ClearCell?FX,alabel-freemicro?uidicstechnologyforenrichmentofviablecirculatingtumorcells[J].CytometryA,2018,93(12):1251-1254.[50]YINJ,WANGZ,LIZ,etal.Characterizationofcirculatingtumorcellsinbreastcancerpatientsbyspiralmicro?uidics[J].CellBiolToxicol,2019,35(1):59-66.[51]HVICHIAGE,PARVEENZ,WAGNERC,etal.Anovelmicrofluidicplatformforsizeanddeformabilitybasedseparationandthesubsequentmolecularcharacterizationofviablecirculatingtumorcells[J].IntJCancer,2016,138(12):2894-2904.[52]RIAHIR,GOGOIP,SEPEHRIS,etal.Anovelmicrochannel-baseddevicetocaptureandanalyzecirculatingtumorcells(CTCs)ofbreastcancer[J].IntJOncol,2014,44(6):1870-1878.[53]MITCHELLMJ,CASTELLANOSCA,KINGMR.Surfactantfunctionalizationinducesrobust,di?erentialadhesionoftumorcellsandbloodcellstochargednanotube-coatedbiomaterialsunder?ow[J].Biomaterials,2015,56:179-186.[54]MüLLERV,STAHMANNN,RIETHDORFS,etal.Circulatingtumorcellsinbreastcancer:correlationtobonemarrowmicrometastases,heterogeneousresponsetosystemictherapyandlowproliferativeactivity[J].ClinCancerRes,2005,11(10):3678-3685.[55]HAROUAKAR,KANGZ,ZHENGS,etal.Circulatingtumorcells:advancesinisolationandanalysis,andchallengesforclinicalapplications[J].PharmacolTher,2014,141(2):209-221.[56]JOOSSESA,GORGESTM,PANTELK.Biology,detection,andclinicalimplicationsofcirculatingtumorcells[J].EMBOMolMed,2015,7(1):1-11.[57]ALLARDWJ,MATERAJ,MILLERMC,etal.Tumorcellscirculateintheperipheralbloodofallmajorcarcinomasbutnotinhealthysubjectsorpatientswithnonmalignantdiseases[J].ClinCancerRes,2004,10(20):6897-6904.[58]AKTASB,TEWESM,FEHMT,etal.Stemcellandepithelial-mesenchymaltransitionmarkersarefrequentlyoverexpressedincirculatingtumorcellsofmetastaticbreastcancerpatients[J].BreastCancerRes,2009,11(4):R46.[59]ARMSTRONGAJ,HALABIS,LUOJ,etal.Prospectivemulticentervalidationofandrogenreceptorsplicevariant7andhormonetherapyresistanceinhigh-riskcastration-resistantprostatecancer:ThePROPHECYstudy[J].JClinOncol,2019,37(13):1120-1129.[60]CHENJ,CHENL,DUS,etal.Highsensitivedetectionofcirculatingtumorcellbymultimarkerlipidmagneticnanoparticlesandclinicalveri?cations[J].JNanobiotechnology,2019,17(1):116.[61]QUEZ,LUOB,ZHOUZ,etal.Establishmentandcharacterizationofapatient-derivedcirculatinglungtumorcelllineinvitroandinvivo[J].CancerCellInt,2019,19:21.[62]LEEAW,LINFX,WEIPL,etal.Binary-blendfibber-basedcaptureassayofcirculatingtumorcellsforclinicaldiagnosisofcolorectalcancer[J].JNanobiotechnology,2018,16(1):4.[63]SAUCEDO-ZENIN,MEWESS,NIESTROJR,etal.Anovelmethodfortheinvivoisolationofcirculatingtumorcellsfromperipheralbloodofcancerpatientsusingafunctionalizedandstructuredmedicalwire[J].IntJOncol,2012,41(4):1241-1250.[64]GORGESTM,PENKALLAN,SCHALKT,etal.Enumerationandmolecularcharacterizationoftumorcellsinlungcancerpatientsusinganovelinvivodeviceforcapturingcirculatingtumorcells[J].ClinCancerRes,2016,22(9):2197-2206.[65]HEY,SHIJ,SCHMIDTB,etal.Circulatingtumorcellsasabiomarkertoassistmoleculardiagnosisforearlystagenon-smallcelllungcancer[J].CancerManagRes,2020,12:841-854.[66]TULLEYS,ZHAOQ,DONGH,etal.Vita-Assay?methodofenrichmentandidenti?cationofcirculatingcancercells/CirculatingTumorCells(CTCs)[J].MethodsMolBiol,2016,1406:107-119.[67]KOJIMAT,HASHIMOTOY,WATANABEY,etal.Asimplebiologicalimagingsystemfordetectingviablehumancirculatingtumorcells[J].JClinInvest,2009,119(10):3172-3181.[68]TOGOS,KATAGIRIN,NAMBAY,etal.Sensitivedetectionofviablecirculatingtumorcellsusinganovelconditionallytelomerase-selectivereplicatingadenovirusinnon-smallcelllungcancerpatients[J].Oncotarget,2017,8(21):34884-34895.[69]LIUHY,QIANHH,ZHANGXF,etal.Improvedmethodincreasessensitivityforcirculatinghepatocellularcarcinomacells[J].WorldJGastroenterol,2015,21(10):2918-2925.[70]WUS,LIUS,LIUZ,etal.Classi?cationofcirculatingtumorcellsbyepithelial-mesenchymaltransitionmarkers[J].PLoSOne,2015,10(4):e0123976.[71]STEVENSM,OOMENSL,BROEKMAATJ,etal.VyCAP'spunchertechnologyforsinglecellidentification,isolation,andanalysis[J].CytometryA,2018,93(12):1255-1259.[72]ROSSIE,ZAMARCHIR.Single-cellanalysisofcirculatingtumorcells:Howfarhavewecomeinthe-omicsera?[J].FrontGenet,2019,10:958.[73]LIANGJ,CAIW,SUNZ.Single-cellsequencingtechnologies:currentandfuture[J].JGenetGenomics,2014,41(10):513-528.[74]CHENC,XINGD,TANL,etal.Single-cellwhole-genomeanalysesbylinearampli?cationviatransposoninsertion(LIANTI)[J].Science,2017,356(6334):189-194.[75]NAVINNE.Cancergenomics:onecellatatime[J].GenomeBiol,2014,15(8):452.[76]HASHIMSHONYT,SENDEROVICHN,AVITALG,etal.CEL-Seq2:sensitivehighly-multiplexedsingle-cellRNA-Seq[J].GenomeBiol,2016,17:77.NATARAJANKN,MIAOZ,JIANGM,etal.Comparativeanalysisofsequencingtechnologiesforsingle-celltranscriptomics[J].GenomeBiol,2019,20(1):70.[88]CHENS,EL-HELIEBIA,KRONEIST.Biologicalandmolecularcharacterizationofcirculatingtumorcells:acreativestrategyforprecisionmedicine?[J].AdvClinChem,2017,82:71-103.LIW,WANGH,ZHAOZ,etal.Emergingnanotechnologiesforliquidbiopsy:thedetectionofcirculatingtumorcellsandextracellularvesicles[J].AdvMater,2019,31(45):e1805344.[89]LINJ,ZHENGJ,WUA.Ane?cientstrategyforcirculatingtumorcelldetection:surface-enhancedRamanspectroscopy[J].JMaterChemB,2020,8(16):3316-3326.CHENVL,XUD,WICHAMS,etal.Utilityofliquidbiopsyanalysisindetectionofhepatocellularcarcinoma,determinationofprognosis,anddiseasemonitoring:asystematicreview[J].ClinGastroenterolHepatol,2020,18(13):2879-2902e9.[90]SCIOLIMG,STORTIG,D'AMICOF,etal.Theroleofbreastcancerstemcellsasaprognosticmarkerandatargettoimprovethee?cacyofbreastcancertherapy[J].Cancers,2019,11(7):1021.[91]SHENSY,SINGHANIAR,FEHRINGERG,etal.SensitiveALIX-PANABIERESC,PANTELK.Liquidbiopsy:fromdiscoverytoclinicalapplication[J].CancerDiscov,2021,11(4):858-873.tumourdetectionandclassificationusingplasmacell-freeDNAmethylomes[J].Nature,2018,563(7732):579-583.YEQ,LINGS,ZHENGS,etal.Liquidbiopsyinhepatocellularcarcinoma:circulatingtumorcellsandcirculatingtumorDNA[J].MolCancer,2019,18(1):114.[92]PIXBERGCF,SCHULZWA,STOECKLEINNH,etal.CharacterizationofDNAmethylationincirculatingtumorcells[J].Genes,2015,6(4):1053-1075.AHNJC,TENGPC,CHENPJ,etal.Detectionofcirculatingtumorcellsandtheirimplicationsasabiomarkerfordiagnosis,prognostication,andtherapeuticmonitoringinhepatocellularcarcinoma[J].Hepatology,2021,73(1):422-436.[93]CASANOVA-SALASI,ATHIEA,BOUTROSPC,etal.Quantitativeandqualitativeanalysisofblood-basedliquidbiopsiestoinformclinicaldecision-makinginprostatecancer[J].EurUrol,2021,79(6):762-771.VASANTHARAJAN