核酸化學 核苷酸代謝課件

王志宇廣州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學部廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院廣東省中醫(yī)藥科學院核酸化學NucleicAcids王志宇廣州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學部核酸化學NucleicA第一節(jié)概述核酸(nucleicacid)

以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。

DNA（Deoxyribonucleicacid)脫氧核糖核酸RNA（Ribonucleicacid)核糖核酸第一節(jié)概述核酸(nucleicacid)1868年FridrichMiescher從膿細胞中提取“核素”1944年

Avery等人證實DNA是遺傳物質1953年

Watson和Crick發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結構1968年Nirenberg發(fā)現(xiàn)遺傳密碼1975年Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)逆轉錄酶1981年Gilbert和Sanger建立DNA測序方法1985年Mullis發(fā)明PCR技術1990年美國啟動人類基因組計劃(HGP)

1994年中國人類基因組計劃啟動2001年美、英等國完成人類基因組計劃基本框架一、核酸的發(fā)現(xiàn)和研究工作進展1868年FridrichMiescher從膿細胞中提取二、核酸的分類及分布、功能(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脫氧核糖核酸

核糖核酸90%以上分布于細胞核，其余分布于核外如線粒體，葉綠體，質粒等。分布于胞核、胞液。攜帶遺傳信息，決定細胞和個體的基因型(genotype)。參與細胞內DNA遺傳信息的表達。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。二、核酸的分類及分布、功能(deoxyribonucleic第二節(jié)核酸的分子組成第二節(jié)核酸的分子組成一、元素組成主要元素組成：C、H、O、N、P(9~11%)與蛋白質比較，核酸一般不含S，而P的含量較為穩(wěn)定，占9-11%。

二、基本構成單位：核苷酸(nucleotide)核苷酸由戊糖、磷酸和含氮堿三部分構成一、元素組成主要元素組成：C、H、O、N、P(9~11%)(一）戊糖pentose

脫氧核糖（DNA）deoxy’ribose

核糖（RNA）ribose(一）戊糖pentose（二）堿基base

1)嘌呤purine腺嘌呤（A）adenine鳥嘌呤（G）guanine2)嘧啶pyrimidine胞嘧啶（C）

cytosine胸腺嘧啶（T）thymine尿嘧啶（U）uracil（二）堿基base1)嘌呤purine腺嘌呤（A）ade嘌呤(purine)腺嘌呤(adenine,A)鳥嘌呤(guanine,G)嘌呤(purine)腺嘌呤(adenine,A)鳥嘌嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)核酸化學核苷酸代謝ppt課件堿基的結構特征嘌呤堿和嘧啶堿分子中都含有共軛雙鍵體系，在紫外區(qū)有吸收（260nm左右）。堿基的結構特征嘌呤堿和嘧啶堿分子中都含有共軛雙鍵體系，在紫外核酸化學核苷酸代謝ppt課件核苷nucleoside糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵。核糖核苷：AR,GR,UR,CR脫氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR核苷nucleoside糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N核苷酸(ribonucleotide)的結構與命名核苷和磷酸以磷酸酯鍵連接核苷酸(ribonucleotide)的結構與命名核苷和磷酸5‘核苷酸3’核苷酸2'核苷酸5‘核苷酸3’核苷酸RNADNA腺苷一磷酸/腺苷酸（AMP）AdenosineMonophosphateAdenylicAcid脫氧腺苷酸（dAMP）deoxy-鳥苷酸（GMP）guanosineguanylicacid脫氧鳥苷酸（dGMP）deoxy-胞苷酸（CMP）cytidinecytidylicacid脫氧胞苷酸（dCMP）

deoxy-尿苷酸（UMP）uridineuridylicacid脫氧胸苷酸（dTMP）thymidylicacidRNADNA腺苷一磷酸/腺苷酸（AMP）Adenosin核酸化學核苷酸代謝ppt課件ATP的性質ATP分子的最顯著特點是含有兩個高能磷酸鍵。ATP水解時,可以釋放出大量自由能。ATP是生物體內最重要的能量轉換中間體。ATP水解釋放出來的能量用于推動生物體內各種需能的生化反應。ATP也是一種很好的磷?；瘎Ａ柞；磻牡孜锟梢允瞧胀ǖ挠袡C分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有較高的能量（活化分子），是許多生物化學反應的激活步驟。ATP的性質ATP分子的最顯著特點是含有兩個高能磷酸鍵。AcAMP和cGMPcAMP(3’,5’-環(huán)化腺苷酸)和cGMP(3’,5’-環(huán)化鳥苷酸)的主要功能是作為細胞的第二信使。cAMP和cGMP的環(huán)狀磷酯鍵是一個高能鍵。在pH7.4,cAMP和cGMP的水解能約為43.9KJ/mol，比ATP水解能高得多。cAMP和cGMPcAMP(3’,5’-環(huán)化腺苷酸)和cGM核酸化學核苷酸代謝ppt課件核酸化學核苷酸代謝ppt課件①是核酸DNA、RNA的合成原料（NTP和dNTP)

②直接為生命活動提供能量(NTP)

③核苷酸衍生物是許多生物合成中的活化中間產物(如UDP-GA、 PAPS、CDP、膽堿）

④腺苷酸構成酶的輔助因子(如FMN、FAD、NADH）

⑤調節(jié)體內代謝調節(jié)(cAMPcGMP)核苷酸的功能①是核酸DNA、RNA的合成原料（NTP和dNTP)

②直第三節(jié)核酸的分子結構第三節(jié)核酸的分子結構一、一級結構（primarystructure）一級結構是指核酸分子中核苷酸的排列順序及連接方式。核苷酸的排列順序代表了遺傳信息。1、核苷酸的連接方式：3

,5

磷酸二酯鍵2、核酸的基本結構形式：多核苷酸鏈信息量：4n末端：5

端、3

端多核苷酸鏈的方向：5ˊ端→3ˊ端(由左至右)3、表示方法：結構式、線條式、文字縮寫一、一級結構（primarystructure）一級結構是核酸化學核苷酸代謝ppt課件

堿基組成分析——Chargaff規(guī)則：[A]=

[T]；[G]

[C]

堿基的理化數(shù)據(jù)分析：A-T、G-C以氫鍵配對較合理DNA纖維的X-線衍射圖譜分析DNA雙螺旋結構的研究背景堿基組成分析——Chargaff規(guī)則：[A]=[T

二、DNA的空間結構（一）DNA的二級結構（secondarystructure）1、堿基組成規(guī)則(Chargaff規(guī)則)[A]=[T]，[G]=[C]；

[A]+[G]=[T]+[C](嘌呤與嘧啶的總數(shù)相等)有種屬特異性無組織、器官特異性不受年齡、營養(yǎng)、性別及其他環(huán)境等影響

二、DNA的空間結構（一）DNA的二級結構（secondDNA分子由兩條DNA單鏈組成。DNA的雙螺旋結構是分子中兩條DNA單鏈之間基團相互識別和作用的結果。雙螺旋結構是DNA二級結構的最基本形式。

DNA雙螺旋結構的特點doublehelixmodelDNA分子由兩條DNA單鏈組成。

DNA雙螺旋結構的特點dDNA雙螺旋結構的要點（1）DNA分子由兩條多聚脫氧核糖核苷酸鏈(簡稱DNA單鏈)組成。兩條鏈沿著同一根軸平行盤繞，形成右手雙螺旋結構。螺旋中的兩條鏈方向相反，即其中一條鏈的方向為5′端→3′端，而另一條鏈的方向為3′端→5′端。DNA雙螺旋結構的要點（1）DNA分子由兩條多聚脫氧核糖核苷（2）嘌呤和嘧啶堿基位于螺旋的內側，磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側。堿基環(huán)平面與螺旋軸垂直，糖基環(huán)平面與堿基環(huán)平面成90°角。（2）嘌呤和嘧啶堿基位于螺旋的內側，磷酸和脫氧核糖基位于螺旋（3）螺旋橫截面的直徑約為2nm，每條鏈相鄰兩個堿基平面之間的距離為0.34nm，每10個核苷酸形成一個螺旋，其螺矩（即螺旋旋轉一圈的高度）為3.4nm。（3）螺旋橫截面的直徑約為2nm，每條鏈相鄰兩個堿基平面之間（4）維持兩條DNA鏈相互結合的力是鏈間堿基對形成的氫鍵。堿基結合具有嚴格的配對規(guī)律:A與T結合，G與C結合，這種配對關系，稱為堿基互補。A和T之間形成兩個氫鍵，G與C之間形成三個氫鍵。在DNA分子中，嘌呤堿基的總數(shù)與嘧啶堿基的總數(shù)相等。（4）維持兩條DNA鏈相互結合的力是鏈間堿基對形成的氫鍵。堿核酸化學核苷酸代謝ppt課件（5）螺旋表面形成大溝(majorgroove)及小溝(minorgroove)，彼此相間排列。小溝較淺；大溝較深，是蛋白質識別DNA堿基序列的基礎。（6）氫鍵維持雙鏈橫向穩(wěn)定性，堿基堆積力維持雙鏈縱向穩(wěn)定性。（5）螺旋表面形成大溝(majorgroove)及小溝(m（二）二級結構：雙螺旋結構模型(doublehelixmodel)1、Watson-Crick雙螺旋結構模型(B-DNA)（1）反平行雙鏈：脫氧核糖-磷酸骨架位于外側，堿基對位于內側（2）堿基互補配對：AT配對（兩個氫鍵），GC配對（三個氫鍵）；堿基對平面垂直縱軸（3）右手雙螺旋：螺距為3.4nm，直徑為2.0nm，10bp/圈（二）二級結構：1、Watson-Crick雙螺旋結構模型(（4）表面功能區(qū)：小溝較淺；大溝較深，是蛋白質識別DNA堿基序列的基礎

（5）維持結構穩(wěn)定的力量：氫鍵維持雙鏈橫向穩(wěn)定，堿基堆積力維持螺旋縱向穩(wěn)定3、其他螺旋形式Z-DNA（左手雙螺旋）

A-DNA（4）表面功能區(qū)：小溝較淺；大溝較深，是蛋白質識別DNA堿基DNA雙螺旋結構的多樣性Aform:右手螺旋大溝變深小溝變淺11bp/螺旋螺距2.9nm直徑2.6nmZform:左手螺旋只有一條溝槽窄而深12bp/螺旋螺距4.5nm直徑1.8nmDNA雙螺旋結構的多樣性Aform:Zform:DNA雙螺旋的穩(wěn)定性DNA雙螺旋結構在生理條件下很穩(wěn)定。維持這種穩(wěn)定性的因素包括：兩條DNA鏈之間形成的氫鍵，堿基堆積力。雙螺旋結構內部形成的疏水區(qū)，消除了介質中水分子對堿基之間氫鍵的影響；介質中的陽離子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基團的負電荷，降低了DNA鏈之間的排斥力等。改變介質條件和環(huán)境溫度，將影響雙螺旋的穩(wěn)定性。DNA雙螺旋的穩(wěn)定性DNA雙螺旋結構在生理條件下很穩(wěn)定。

天然存在的DNA分子最顯著的特點是很長，分子質量很大，一般在106～1010。大腸桿菌染色體由400萬堿基對(basepair，bp)組成的雙螺旋DNA單分子。其長度為1.4×106nm，相當于1.4mm，而直徑為20nm，相當原子的大小。黑腹果蠅最大染色體由6.2×107bp組成，長2.1cm多瘤病毒的DNA由5100bp組成，長1.7mm天然存在的DNA分子最顯著的特點是很長，分子質（二）DNA的三級結構雙螺旋進一步扭曲,形成一種比雙螺旋更高層次的空間構象。包括：線狀DNA形成的紐結、超螺旋和多重螺旋、環(huán)狀DNA形成的結、超螺旋和連環(huán)等（二）DNA的三級結構雙螺旋進一步扭曲,形成一種比雙螺旋更高大多數(shù)原核生物：1）共價封閉的環(huán)狀雙螺旋分子2）超螺旋結構：雙螺旋基礎上的螺旋化正超螺旋(positivesupercoil):盤繞方向與雙螺旋方同相同負超螺旋(negativesupercoil):盤繞方向與雙螺旋方向相反大多數(shù)原核生物：正超螺旋(positivesuperco右手左手右手左手（三）DNA在真核生物細胞核內的組裝核小體(nucleosome)：由DNA和組蛋白構成。DNA：以負超螺旋纏繞在組蛋白上組蛋白核心：H2B,H2A,H3,H4H1組蛋白在核小體之間（三）DNA在真核生物細胞核內的組裝核小體(nucleosoDNA的存在形式DNA的存在形式核酸化學核苷酸代謝ppt課件DNA雙螺旋片段染色質纖維伸展形染色質片段密集形染色質片段整個染色體串珠狀核小體DNA雙螺旋片段染色質纖維伸展形染色質片段密集形染色質片段整（三）DNA的功能DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復制和轉錄的模板。它是生命遺傳的物質基礎，也是個體生命活動的信息基礎?；驈慕Y構上定義，是指DNA分子中的特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。（三）DNA的功能DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息三、RNA的分子結構三、RNA的分子結構RNA的結構特點RNA是單鏈分子，因此在RNA分子中，嘌呤的總數(shù)不一定等于嘧啶的總數(shù)。RNA分子中，部分區(qū)域也能形成雙螺旋結構，不能形成雙螺旋的部分，則形成單鏈突環(huán)。這種結構稱為“發(fā)夾型”結構。在RNA的雙螺旋結構中，堿基的配對情況不象DNA中嚴格。G除了可以和C配對外，也可以和U配對。G-U配對形成的氫鍵較弱。不同類型的RNA,其二級結構有明顯的差異。tRNA中除了常見的堿基外，還存在一些稀有堿基，這類堿基大部分位于突環(huán)部分.RNA的結構特點RNA是單鏈分子，因此在RNA分子中，嘌呤的核酸化學核苷酸代謝ppt課件（一）信使RNA的結構與功能*真核生物mRNA的結構特點1.大多數(shù)真核mRNA的5′末端均在轉錄后加上一個7-甲基鳥苷，同時第一個核苷酸的C′2也是甲基化，形成帽子結構：m7GpppNm-。2.大多數(shù)真核mRNA的3′末端有一個多聚腺苷酸(polyA)結構，稱為多聚A尾。（一）信使RNA的結構與功能*真核生物mRNA的結構特點1帽子結構和多聚A尾的功能5′-cap的功能(1)防止mRNA被核酸酶降解。(2)為mRNA翻譯活性所必需。(3)與蛋白質合成的正確起始有關。帽子結構和多聚A尾的功能5′-cap的功能(1)防止mR3′-polyA:polyA的殘基數(shù)20~200個，或更多。polyA的功能(2)與翻譯有關，沒有polyA翻譯活性降低。(3)與mRNA從細胞核轉移到細胞質有關。(1)保護mRNA，免受核酸外切酶的作用。3′-polyA:polyA的殘基數(shù)20~200個，或更hnRNA內含子(intron)mRNA

外顯子(exon)*真核生物mRNA成熟過程hnRNA內含子mRNA外顯子*真核生物mR*mRNA的功能把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補配對原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質的氨基酸排列順序。DNAmRNA蛋白轉錄翻譯原核細胞細胞質細胞核DNA內含子外顯子轉錄轉錄后剪接轉運mRNAhnRNA翻譯蛋白真核細胞*mRNA的功能DNAmRNA蛋白轉錄翻譯原核細胞（二）tRNA的結構與功能*

tRNA的一級結構特點含10~20%稀有堿基，如DHU3′末端為-CCA-OH5′末端大多數(shù)為G

具有T

C雙氫尿嘧啶(DHU)假尿嘧啶()次黃嘌呤(I)（二）tRNA的結構與功能*tRNA的一級結構特點雙氫尿嘧*tRNA的二級結構——三葉草形

氨基酸臂

DHU環(huán)反密碼環(huán)額外環(huán)

TΨC環(huán)氨基酸臂額外環(huán)*tRNA的二級結構氨基酸臂額外環(huán)*tRNA的功能：活化、搬運氨基酸到核糖體，參與蛋白質的翻譯。*tRNA的功能：活化、搬運氨基酸到核糖體，參與蛋白質的翻1、分子較小，含較多的稀有堿基和非標準堿基配對2、5’端一般為鳥嘌呤核苷酸，3’端為CCA-OH3’。3、二級結構為“三葉草”型（cloverleafpattern）小結反密碼環(huán)：反密碼環(huán)中部的三個堿基可以與mRNA的三聯(lián)體密碼形成堿基互補配對，解讀遺傳密碼，稱為反密碼子（anticodon）。I常出現(xiàn)于反密碼子中1、分子較小，含較多的稀有堿基和非標準堿基配對2、5’端一般ACCDHU環(huán)T

環(huán)反密碼環(huán)5’額外環(huán)氨基酸臂：3`末端的CCA-OH3`單鏈用于連接該tRNA轉運的氨基酸。

二氫尿嘧啶環(huán)（DHU）：識別氨酰-tRNA合成酶TΨC環(huán)：識別核蛋白體（核糖體）4、“倒L”型三級結構ACCDHU環(huán)T環(huán)反密碼環(huán)5’額外環(huán)氨基酸臂：3`末端的C（三）rRNA的結構與功能原核生物（以大腸桿菌為例）真核生物（以小鼠肝為例）小亞基30S40SrRNA16S1542個核苷酸18S1874個核苷酸蛋白質21種占總重量的40%33種占總重量的50%大亞基50S60SrRNA23S5S2940個核苷酸120個核苷酸28S5.85S5S4718個核苷酸160個核苷酸120個核苷酸蛋白質31種占總重量的30%49種占總重量的35%核蛋白體的組成*rRNA的功能:組成核蛋白體，作為蛋白質合成的場所。（三）rRNA的結構與功能原核生物（以大腸桿菌為例）真核生物核酸化學核苷酸代謝ppt課件（四）其他小分子RNA及RNA組學除了上述三種RNA外，細胞的不同部位存在的許多其他種類的小分子RNA，統(tǒng)稱為非mRNA小RNA(smallnon-messengerRNAs,snmRNAs),或非編碼蛋白質的RNA(non-codingRNA,ncRNA)。種類：核內小RNA；核仁小RNA；胞質小RNA；催化性小RNA；小片段干涉RNA功能：參與hnRNA和rRNA的加工和轉運。ncRNA在在基因表達以及應激信號傳導等方面起著重要的調節(jié)作用。因此，有人也將其稱為調節(jié)RNA（regulatoryRNA）。（四）其他小分子RNA及RNA組學除了上述三種RNA外，細胞小片段干擾RNA（siRNA；又稱“引導RNAs”，guideRNAs）：一些小的雙鏈RNA可以高效、特異的阻斷體內特定基因表達，促使mRNA降解，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNAinterference，RNAi，也譯作RNA干預或干涉）。它是體內抵御外在感染的一種重要保護機制。小片段干擾RNA（siRNA；又稱“引導RNAs”，guiRNAi的作用機制：包括起始階段和效應階段。（1）在起始步驟，生物宿主將外源基因表達的雙鏈RNA進行切割，產生具有特定長度（19-21nt）和序列的小片段RNA；（2）在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將siRNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3'端12個堿基的位置切割mRNA。RNAi的作用機制：包括起始階段和效應階段。（1）在起始步驟RNA組學研究細胞中snmRNAs的種類、結構和功能。同一生物體內不同種類的細胞、同一細胞在不同時間、不同狀態(tài)下snmRNAs的表達具有時間和空間特異性。RNA組學:RNA組學研究細胞中snmRNAs的種類、結構和功能。同一生第四節(jié)核酸的理化性質第四節(jié)核酸的理化性質

一、酸性化合物

兩性解離，但酸性強電泳行為——泳向正極（pH7-8）

二、高分子性質

粘度DNA>RNA

超離心沉降凝膠過濾分子大小單位：分子量（道爾頓，D）、堿基對數(shù)目（bp）、離心沉降常數(shù)（S）

沉淀行為——加鹽（中和電荷）；乙醇一、酸性化合物兩性解離，但酸性強二、高分子性質DNA和RNA中的糖苷鍵與磷酸酯鍵都能用化學法和酶法水解。并且堿基和核糖之間的糖苷鍵更易被水解，其中嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵對酸更不穩(wěn)定。在很低pH條件下DNA和RNA都會發(fā)生磷酸二酯鍵水解。在高pH時，RNA的磷酸酯鍵易被水解，而DNA的磷酸酯鍵不易被水解。

一、核酸的水解－酸堿水解DNA和RNA中的糖苷鍵與磷酸酯鍵都能用化學法和酶法水解。一二、紫外吸收二、紫外吸收1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0OD260的應用1.DNA或RNA的定量OD260的應用紫外吸收

最大吸收波長：260nm

核酸定量分析核酸定性分析

三、變性、復性、分子雜交1、DNA變性（DNAdenaturation）：DNA變性是指在理化因素作用下，DNA分子中的氫鍵斷裂，堿基堆積力遭到破壞，雙螺旋結構解體，雙鏈分開形成單鏈的過程。

紫外吸收最大吸收波長：260nm三、變性、復性、分DNA的變性(denaturation)方法：過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等。變性后其它理化性質變化：OD260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸堿滴定曲線改變；生物活性改變DNA變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂DNA的變性(denaturation)方法：過量酸，堿，加DNA變性DNA變性增色效應：DNA變性時其溶液OD260增高的現(xiàn)象。增色效應：DNA變性時其溶液OD260增高的現(xiàn)象。當DNA的稀鹽溶液加熱到80-100℃時，雙螺旋結構即發(fā)生解體，兩條鏈彼此分開，形成無規(guī)線團。8090100100%50%OD260（254）

Tm

變性溫度范圍①②③℃融解溫度（meltingtemperature,Tm）：DNA熱變性過程中，紫外吸收達到最大值的一半時溶液的溫度稱為融解溫度（Tm）或解鏈溫度、變性溫度。實驗室常用的方法——熱變性當DNA的稀鹽溶液加熱到80-100℃時，雙螺旋結構即發(fā)生解影響Tm值的因素(1)溶液的性質(2)DNA的性質和組成大腸桿菌DNA在不同濃度KCl溶液下的熔融溫度曲線影響Tm值的因素(1)溶液的性質(2)DNA的性質和組成大腸GC含量越高，Tm越大GC含量越高，Tm越大

（1）變性后理化性質改變DNA溶液的粘度降低浮力密度增加旋光偏振光改變紫外吸收增加（高色效應）高色效應（hyperochromiceffect）：DNA變性后，在260nm處的紫外吸收增高，稱為高色效應或增色效應。

（2）變性后的DNA一級結構沒有改變。（1）變性后理化性質改變（2）變性后的DNA一級結構沒有（3）融解溫度（meltingtemperature,Tm）：DNA熱變性過程中，紫外吸收達到最大值的一半時溶液的溫度稱為融解溫度（Tm）GC含量越高，Tm越大DNA越長，Tm越大溶液離子強度增高，Tm值增加DNA越純，相變范圍越小

（3）融解溫度（meltingtemperature,Tm2、DNA復性DNA復性(renaturation)的定義:在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構象，這一現(xiàn)象稱為復性。熱變性的DNA經緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火(annealing)

。減色效應（hypochromiceffect）:DNA復性時，其溶液OD260降低。2、DNA復性DNA復性(renaturation)的定義:DNA復性DNA復性在DNA變性后的復性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關系，在適宜的條件（溫度及離子強度）下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。核酸分子雜交(hybridization)在DNA變性后的復性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或核酸的雜交核酸的雜交核酸化學核苷酸代謝ppt課件DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復性不同來源的DNA分子核酸分子雜交的應用:研究基因的位置確定兩種核酸序列的相似性檢測樣品中的特異序列基因芯片技術的基礎DNA-DNA變性復性不同來源的DNA分子核核酸探針（nucleicacidprobe）:能特異性的探測帶某一特定序列的DNA或RNA分子的標記核酸分子。核酸探針（nucleicacidprobe）:能特異性的3、核酸分子雜交(hybridization)由不同來源的核酸單鏈形成雜化雙鏈的過程分子雜交技術的應用：基因克隆篩選、酶切圖譜制作、特定基因序列的定量和定性、突變分析、疾病診斷等3、核酸分子雜交(hybridization)由不同來源的核酸的構象和分離ρ：超螺旋DNA>環(huán)狀DNA>線狀DNA>蛋白質

DNA沉降四、沉降特性

超螺旋DNA核酸的構象和分離ρ：超螺旋DNA>環(huán)狀DNA>線狀DNA>五、凝膠電泳核酸研究中最常用的方法優(yōu)點：簡單、快速、靈敏、成本低。通過凝膠電泳（1）可進行核酸分離，知道核酸的純度。（2）測定分子大小。（3）估計核酸的構象。五、凝膠電泳核酸研究中最常用的方法優(yōu)點：簡單、快速、靈敏凝膠電泳兼有分子篩效應和電荷效應1．瓊脂糖凝膠電泳（agarosegelelectrophoresis）

瓊脂糖凝膠電泳的遷移率主要與分子大小、膠濃度、核酸構象、電流等有關。2．聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis）用于分析RNA或Mr小于1000bp的DNA片段適用于大分子核酸，一般用于DNA分析。凝膠電泳兼有分子篩效應和電荷效應1．瓊脂糖凝膠電泳（agaDNAmarker(DL-15000)：15000，10000，7500，5000，2500，1000，250DNAmarker(DL-2000)：2000，1000，750，500，250，100DNAmarker(DL-15000)：15000，10第五節(jié)核酸酶(nucleases)核酸酶是指所有可以水解核酸的酶第五節(jié)核酸酶(nucleases)核酸酶是指所有可以水解核

一、種類1、根據(jù)底物分類DNase、RNase；單鏈核酸酶、雙鏈核酸酶、雜合雙鏈核酸酶2、根據(jù)催化部位分類：外切核酸酶和內切核酸酶外切酶：5′端→3′端或3′端→5′端核酸外切酶。內切酶：限制性核酸內切酶和非限制性核酸內切酶。限制性核酸內切酶(restrictionendonucleases)：能夠識別DNA分子的特定核苷酸序列，并在識別位點或其周圍斷開DNA雙鏈的一類核酸酶一、種類1、根據(jù)底物分類2、根據(jù)催化部位分類：外切核酸酶和限制性內切酶舉例限制性內切酶舉例核酸化學核苷酸代謝ppt課件參與DNA的合成與修復及RNA合成后的剪接等重要基因復制和基因表達過程負責清除多余的、結構和功能異常的核酸，同時也可以清除侵入細胞的外源性核酸在消化液中降解食物中的核酸以利吸收體外重組DNA技術中的重要工具酶生物體內的核酸酶負責細胞內外催化核酸的降解

二、核酸酶的功能參與DNA的合成與修復及RNA合成后的剪接等重要基因復制和基

三、核酶催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脫氧核苷酸片段，也能序列特異性降解RNA。催化性RNA(ribozyme)

作為序列特異性的核酸內切酶降解mRNA。三、核酶催化性DNA(DNAzyme)人第六節(jié) 核酸的核苷酸序列測定第六節(jié) 核酸的核苷酸序列測定1994：3億美元測定一個人類基因組(1:10)1984：30億美元測定一個人類基因組未來目標：1000/100美元測定一個人類基因組!2004：3千萬美元測定一個人類基因組(1:100)2006：1百50萬美元測定一個人類基因組(1:2000)2008：50萬美元測定一個人類基因組(1:6000)DNA測序技術的發(fā)展1994：3億美元測定一個人類基因組(1:10)1984：3測序技術的發(fā)展雙脫氧末端終止法(Sanger測序法)1970s同位素標記，手工1980s熒光標記，自動1990s毛細管電泳合成測序法（第二代測序）焦磷酸測序（Pyrosequencing,Roche/454）合成測序（Sequencing-By-Synthesis,Illumina/Solexa）連接測序（Sequencing-By-Ligation,ABI/SOLiD）單分子測序技術（第三代測序）HelicosPacificBiosciencesOxfordNanopore測序技術的發(fā)展雙脫氧末端終止法(Sanger測序法)KeyGenomicsTechnologies1975-SouthernDNA雜交技術1977-Sanger雙脫氧鏈終止法測序技術

Maxam、Gilbert’s化學法DNA測序技術1980-自動化原位寡核苷酸合成儀1985-Cetus公司的Mullis發(fā)明PCR技術1992-Affymetrix公司（Fodor的集團）的基因芯片1995-ABI公司第一代全自動測序儀2006-第二代DNA測序儀上市2007-單分子測序技術（Singlemoleculesequencingtechniques）KeyGenomicsTechnologies1975第一代測序技術雙脫氧鏈終止法測序

通過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈，由于合成的互補鏈可在不同位置隨機終止反應，產生只差一個核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測DNA分子的順序。化學降解法測序將一個DNA片段的5'端磷酸基作放射性標記，再分別采用不同的化學方法修飾和裂解特定堿基，從而產生一系列長度不一而5'端被標記的DNA片段，這些以特定堿基結尾的片段群通過凝膠電泳分離，再經放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的DNA的堿基序列。

第一代測序技術雙脫氧鏈終止法測序第一代DNA測序技術

成熟的DNA測序技術始于20世紀70年代中期

1977年Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法

同一時期,Maxam和Gilbert報道了通過化學降解測定DNA序列的方法20世紀90年代初出現(xiàn)的熒光自動測序技術將DNA測序帶入自動化測序的時代這些技術統(tǒng)稱為第一代DNA測序技術第一代DNA測序技術成熟的DNA測序技術始于20世紀70雙脫氧鏈終止法ddNTP沒有3’羥基，在鏈的延伸過程中如果插入，就會終止鏈的延伸。單鏈模板在DNA聚合酶、引物、4種dNTP存在的反應體系中能合成雙鏈。如果這一反應體系中存在ddNTP，互補鏈合成過程就會終止于該ddNTP插入位點。雙脫氧鏈終止法ddNTP沒有3’羥基，在鏈的延伸過程中如果插5ˊPP5ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊPOH3ˊP325ˊ5ˊPOH3ˊHODNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP雙脫氧鏈終止法待測序的雙鏈片段制備單鏈DNA加入反應體系5ˊPP5ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊPOH3ˊP325ˊddGTPddATPddTTPddCTP5ˊ

32P-GTCATGTGCTAG5ˊ

32PGTCATGTGCTA5ˊ

32PGTCATGTGCT5ˊ

32PGTCATGTGC5ˊ

32PGTCATGTG5ˊ

32PGTCATGT5ˊ

32PGTCATG5ˊ

32PGTCAT5ˊ

32PGTCA5ˊ

32PGTC5ˊ

32PGT5ˊ

32PG聚合產物分別在4個泳道電泳一次能確定300-500個核苷酸序列ddGTPddATPddTTPddCTP5ˊ32P-化學降解法放射性同位素標記5'末端限制性內切酶處理變性四個反應體系化學降解法放射性同位素標記5'末端限制性內切酶處理核酸化學核苷酸代謝ppt課件一次最多只能分析250個核苷酸一次最多只能分析250個核苷酸

熒光自動測序技術基于Sanger測序原理

用不同熒光標記的ddNTP

熒光自動測序技術基于Sanger測序原理自動化測序

與鏈終止法測序原理相同。只是用不同的熒光色彩標記ddNTP。如ddATP標記紅色熒光。ddTTP標記綠色熒光。ddCTP標記藍色熒光，ddGTP標記黃色熒光。由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色，而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基.自動化測序核酸化學核苷酸代謝ppt課件核酸化學核苷酸代謝ppt課件第二代測序技術

以高通量低成本為主要特征的第二代測序，不再需要大腸桿菌進行體內擴增，而是直接通過聚合酶或者連接酶進行體外合成測序。根據(jù)其原理又可分為兩類：聚合酶合成測序和連接酶合成測序。第二代測序技術以高通量低成本為主要特征的第二代測序，Roche公司推出的454技術開辟了高通量測序的先河。該技術通量可達Sanger測序的幾百倍，而成本卻只有幾十分之一，因此一經推出，便受到了國際上基因組學專家的廣泛關注。

Illumina公司推出的Solexa遺傳分析儀是合成技術的進一步發(fā)展與延伸。該技術借助高密度的DNA單分子陣列，使得測序成本和效率均有了較大改善。同時Solexa公司提出的可逆終止子也是該技術獲得認可的原因之一。與454相比，Solexa擁有更高的通量，更低的成本。雖然片段長度較短仍是主要的技術瓶頸，但是對于已有基因組的物種來說，Solexa理所當然成為第二代測序技術的首選。1、聚合酶合成測序法Roche公司推出的454技術開辟了高通量測一、樣品處理將大片段的DNA分子片段化（超聲或氮氣）瓊脂糖凝膠電泳回收500-800bp的片段二、文庫制備

454（GSFLX）測序技術包括接頭連接和磁珠純化

454的文庫接頭分A、B兩種，其中B接頭的5’端帶有生物素（Biotin）標記

經過磁珠結合與DNA變性之后，只有A+目的片段+B形式的連接產物得以富集一、樣品處理454（GSFLX）測序技術三、連接磁珠四、emRCR加入特定的礦物油和表面活性劑，再利用振蕩器劇烈振蕩，使反應體系形成油包水（water-in-oil）的穩(wěn)定乳濁液三、連接磁珠加入特定的礦物油和表面活性劑，再利用振蕩器劇烈振五、反應板準備、上機測序454測序的反應板稱為PTP（PicoTiterPlate），含有350萬個由光纖組成的小孔，每個孔的直徑為29μm，而測序磁珠的直徑為20μm，因此每個孔中僅能容納一個磁珠。五、反應板準備、上機測序454測序的反應板稱為PTP（Pic依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進入PTP板，每次只進入一種堿基。如果發(fā)生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經過一個合成反應和一個化學發(fā)光反應，最終將螢光素氧化成氧化螢光素，同時釋放出光信號。此反應釋放出的光信號實時被高靈敏度CCD捕獲到。一個磁珠＝一條讀長DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶5’-磷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)、熒光素讀長230-400bp依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進入PTP板，每次只進入一種樣品處理文庫制備連接磁珠emPCR反應板準備、上機測序總結樣品處理總結第三代測序技術

近期出現(xiàn)的Helicos公司的Heliscope單分子測序儀、PacificBiosciences公司的SMRT技術和OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的納米孔單分子技術，被認為是第三代測序技術。與前兩代技術相比，他們最大的特點是單分子測序。其中，Heliscope技術和SMRT技術利用熒光信號進行測序，而納米孔單分子測序技術利用不同堿基產生的電信號進行測序。第三代測序技術近期出現(xiàn)的Helicos公司的He表1三代測序技術特點的比較表1三代測序技術特點的比較核苷酸組成三部分核苷酸的分類與功能DNA二級結構特點核小體結構及特點RNA種類、組成及功能DNA/RNAOD260DNA變形、復性、Tm值分子雜交的應用DNA測序基本原理核苷酸組成三部分第五節(jié)核苷酸代謝第五節(jié)核苷酸代謝食物糖脂肪蛋白質核苷酸食物中的核苷酸大部分都將被分解，不被機體利用。人體內的核苷酸主要由機體細胞自身合成。營養(yǎng)必需物質食物糖脂肪蛋白質核苷酸食物中的核苷酸大部分都將被分解，不被機核苷酸酶核苷磷酸核苷磷酸化酶1-磷酸核糖堿基主要途徑從頭合成1補救途徑2重要中間物核糖核苷酸基本原料（AA，CO2，一碳單位，5-磷酸核糖等小分子物質）PRPP（核苷，堿基）脫氧核糖核苷酸還原酶NDP合成分解核苷酸合成在腦,紅細胞和骨髓中只能進行“補救途徑”。核苷酸代謝框架（5-磷酸核糖焦磷酸）核苷酸酶核苷磷酸核苷1-磷酸核糖堿基主要途徑從頭合成1補救途嘧啶核苷酸嘌呤核苷酸從頭合成途徑補救合成途徑最重要的中間物質和關鍵酶主要的酶用基本原料用半成品嘧啶核苷酸嘌呤核苷酸從頭合成途徑補救合成途徑最重要的中間物質第一節(jié)嘌呤核苷酸的代謝包括：ATPGTP途徑：1，從頭合成：

2，補救合成（重新利用）：磷酸核糖氨基酸CO2一碳單位利用：利用：嘌呤堿嘌呤核苷(denovosynthesis)(salvagepathway)一、嘌呤核苷酸的合成第一節(jié)嘌呤核苷酸的代謝包括：ATP途徑：1，從頭合NNN

N

天冬氨酸一碳單位（甲酰基-FH4）谷氨酰胺（酰胺基）一碳單位（甲?；?FH4）甘氨酸CO2嘌呤堿合成的元素來源：（一）嘌呤核苷酸的從頭合成123456789NNNN天冬氨酸一碳單位谷氨酰胺一碳單位機體利用氨基酸、二氧化碳、一碳單位及磷酸核糖等小分子物質為原料，經一系列酶促反應合成嘌呤核苷酸的過程。IMP甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、一碳單位、CO2、5-磷酸核糖AMPGMPGTPATP嘌呤核苷酸從頭合成途徑PRPP10步酶促反應第一階段第二階段第三階段ATP一磷酸次黃嘌呤核苷機體利用氨基酸、二氧化碳、一碳單位及IMP甘氨酸、天冬氨酸、R--5--PPRPPPRPP合成酶ATPAMP第一階段：PRPP的生成來自“磷酸戊糖途徑”R--5--PPRPPPRPP合成酶ATPAMP第一階段：P

OOHOHOHPOCH2

R—5—P5-磷酸核糖（來自磷酸戊糖途徑）活化過程ATPAMP

PRPP5-磷酸核糖-1-焦磷酸OO-OHOHPOCH2PPOOHOHOHPOCH2R—5—P（來自磷酸戊糖途徑PRPP5-PRAPRPP酰胺轉移酶GlnGluPPiCAIRAICARIMPGARFGARFGAMAIRSAICARFAICAR第二階段IMP的生成限速步驟PRPP5-PRAPRPP酰胺轉移酶GlnGluPPiCAINH2OOHOHPOCH25-磷酸核糖胺(5--PRA)OO-OHOHPOCH2PPPRPPGlnGlu限速步驟NH2OOHOHPOCH2OO-OHOHPOCH2PPPRP核酸化學核苷酸代謝ppt課件核酸化學核苷酸代謝ppt課件核酸化學核苷酸代謝ppt課件腺苷酸代琥珀酸天冬氨酸一磷酸黃嘌呤核苷腺苷酸代琥珀酸天冬氨酸一磷酸黃嘌呤核苷GTPATP第三階段：由IMP生成AMP和GMPIMP腺苷酸

代琥珀酸AMP天冬氨酸延胡索酸腺苷酸代琥珀合成酶腺苷酸代琥珀酸裂解酶GMP黃嘌呤核苷酸

(XMP)谷氨酰胺IMP脫氫酶GMP合成酶NAD＋NADH＋H＋聯(lián)合轉氨基中，轉氨偶聯(lián)嘌呤核苷酸循環(huán)脫氨作用GTPATP第三階段：由IMP生成AMP和GMPIMP腺苷酸ONNN

NIMPR-5-PNH2NNN

NR-5-PAONNN

NH2NR-5-PG天冬氨酸谷氨酰胺ONNNNIMPR-5-PNH2NNNNR-5-PAONAMP和GMP在激酶作用下，經過兩步磷酸化反應，進一步分別生成ATP和GTP。AMPADPATP

GAPGDPGTP激酶激酶激酶激酶ATPADPATPADPATPADPATPADP或經底物水平磷酸化AMP和GMP在激酶作用下，經過兩步AMP在磷酸核糖分子上逐步合成嘌呤環(huán)；PRPP是重要的中間代謝物，它不僅參與嘌呤核苷酸的從頭合成，而且參與嘧啶核苷酸的從頭合成及兩類核苷酸的補救合成。是5’-磷酸核糖的活性供體；關鍵酶為PRPP酰胺轉移酶。嘌呤核苷酸的合成要點在磷酸核糖分子上逐步合成嘌呤環(huán)；嘌呤核苷酸的合成要點調節(jié)要點：

調節(jié)的機制:反饋調節(jié)

PRPP酰胺轉移酶:限速酶、變構酶，有兩種形式：單體有活性，二聚體無活性。

ATP和GTP分別調控GTP與ATP的相對平衡。調節(jié)要點：紅細胞、腦骨髓、脾臟等組織不能從頭合成嘌呤核苷酸，只能利用現(xiàn)成的嘌呤堿或嘌呤核苷來合成嘌呤核苷酸。腺苷+ATPAMP+ADP腺苷激酶腺嘌呤磷酸核糖轉移酶（APRT）腺嘌呤+PRPPAMP+PPiHGIMPGMP+

PRPP+PPiHGPRT次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（二）嘌呤核苷酸補救合成途徑細胞利用游離堿基或核苷重新合成相應核苷酸的過程稱“補救途徑”紅細胞、腦骨髓、脾臟等組織不能從頭合成嘌呤核苷酸，只能利用現(xiàn)1.節(jié)省能量和減少氨基酸的消耗2.對缺乏從頭合成途徑的組織具有更重要的生理意義Lesch-Nyhan綜合癥的病因？？

HGPRT遺傳缺陷尿酸增加？？？

神經系統(tǒng)異常?。?.節(jié)省能量和減少氨基酸的消耗Lesch-Nyhan綜（三）脫氧核糖核苷酸的生成(N:A、G、C、U）還原反應是在核苷二磷酸水平（NDP）NDPNADPH+H+dNDP核糖核苷酸還原酶(RR)dNTP磷酸激酶NADP+OOHOHPOCH2PHBOOHHPOCH2PHB（三）脫氧核糖核苷酸的生成(N:A、G、C、U）還原反應NADPH是最終還原劑硫氧化還原蛋白還原酶體系：2SHS—S

核糖核苷酸還原酶NADPH是最終還原劑硫氧化還原蛋白還原酶體系：2SH

（四）嘌呤核苷酸抗代謝物抗代謝物是指一些人工合成的化合物在結構上分別與嘌呤（或嘧啶），氨基酸或葉酸類似，它們主要以競爭性抑制或“以假亂真”等方式干擾或阻斷核苷酸的合成代謝，從而阻斷核酸以及蛋白質的合成。（四）嘌呤核苷酸抗代謝物抗代謝物是指一些人工合成的化合物1，競爭抑制HGPRT，使PRPP分子中的R-5-P不能向嘌呤及次黃嘌呤轉移，阻斷嘌呤核苷酸的補救途徑。2，可在體內經核糖化生成6-MP核苷酸，抑制IMP

轉變?yōu)锳MP及GMP的反應。3，反饋抑制PRPP酰胺轉移酶而干擾磷酸核糖胺的形成，阻斷從頭合成。6-MP

的作用機制：1，競爭抑制HGPRT，使PRPP分子中的R-5-P不能6-核苷酸分解代謝概況核苷酸(堿基+戊糖+磷酸)堿基戊糖磷酸嘌呤堿嘧啶堿代謝終產物!!代謝產物!注意不同堿基代謝的異同點拆零過程二、嘌呤核苷酸的分解核苷酸分解代謝概況核苷酸堿基戊糖磷酸嘌呤堿嘧啶堿代謝終產物!核苷酸分解代謝的三個重要的酶核苷酸酶核苷磷酸化酶脫氨