4種植物酯酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏度研究

4種植物酯酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏度研究

目前，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)藥殘留嚴(yán)重超標(biāo)，這不僅直接影響到我國(guó)農(nóng)業(yè)品種的質(zhì)量和國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，而且給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)了嚴(yán)重問題?？梢哉f(shuō)，農(nóng)藥殘留問題是我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要限制因素。1976年Kumar等提出了α-乙酸萘酯在乙酰膽堿酯酶的作用下能夠水解生成乙酸和α-萘酚,當(dāng)酶受到有機(jī)磷農(nóng)藥的抑制后,水解速度下降,可根據(jù)產(chǎn)物顯色反應(yīng)的變化指示農(nóng)藥含量。動(dòng)物來(lái)源膽堿酯酶來(lái)源有限、保持期短,而植物酶源易得,提取和保存較為方便、檢測(cè)時(shí)間短、成本低,測(cè)量準(zhǔn)確度和精密度均較好。然而在已做的研究工作中尚未對(duì)不同來(lái)源的植物酯酶和不同條件下的檢測(cè)進(jìn)行系統(tǒng)的研究。本文以對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏度為指標(biāo),對(duì)4種塊莖果實(shí)中提取的植物酯酶進(jìn)行了篩選,擬選取適宜的植物酶源,再通過對(duì)4種有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行敏感性比較,得到其最低檢測(cè)限(LOD),以確定其作為農(nóng)藥殘留檢測(cè)用植物酯酶的可行性。1儀器和試劑1.1儀器和檢測(cè)設(shè)備TU-1810紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XMT-DA數(shù)顯調(diào)節(jié)儀(姚奧特儀表有限公司);CJJ78-1磁力加熱攪拌器;PHS-3C精密PH計(jì)等。1.2藥料及藥劑固藍(lán)B鹽、乙酸-1-萘酯、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、95%乙醇(分析純)、土豆、紅薯、茨菇、芋頭、農(nóng)藥(敵敵畏、敵百蟲、甲胺磷、辛硫磷)等。2實(shí)驗(yàn)方法2.1離心液的制備酯酶的提取:將原材料(土豆、紅薯、茨菇、芋頭)洗凈去皮稱取適量,研細(xì)以1∶5加蒸餾水于燒杯中混合,在磁力加熱攪拌器上攪拌上30min后,靜置取上清液在5000r/min的離心機(jī)上離心10min,上清液于4℃下保存,備用。2.2酶促進(jìn)反應(yīng)的最佳條件2.2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定分別移取pH為6.5的磷酸鹽緩沖溶液,1.00mL乙酸-1-萘酯無(wú)水乙醇液,1.00mL酶液,1.00mL固藍(lán)B鹽溶液于10mL容量瓶中,30℃溫度下顯色15min,在400～700nm范圍進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,A最大處即為酶促反應(yīng)最適合吸收波長(zhǎng)。2.2.2吸光度a分別準(zhǔn)確移取0～2.00mL乙酸-1-萘酯無(wú)水乙醇液(以0.50mL為間隔),1.00mL酶液,1.00mL固藍(lán)B鹽溶液于10mL容量瓶中,用pH6.5的磷酸鹽緩沖液定容,35℃條件下水浴恒溫10min,以不加原酶液為空白,在最適波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值A(chǔ)。2.2.3ph對(duì)固藍(lán)b鹽穩(wěn)定性的影響分別準(zhǔn)確移取乙酸-1-萘酯無(wú)水乙醇液的最適用量,1.00mL酶液,1.00mL固藍(lán)B鹽溶液于10mL容量瓶中,分別用pH=4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行定容,置于恒溫35℃下水浴恒溫10min,在最適波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。2.2.4固藍(lán)b鹽緩沖液緩沖液的配制分別準(zhǔn)確移取乙酸-1-萘酯無(wú)水乙醇液的最適用量,1.00mL酶液,1.00mL固藍(lán)B鹽溶液于10mL容量瓶中,用最適pH值的磷酸鹽緩沖液定容。酶促反應(yīng)體系置于30～60℃下水浴恒溫10min(以5℃為間隔),以不加原酶液為空白,在最適波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。2.2.5固藍(lán)b鹽緩沖液的配制分別準(zhǔn)確移取乙酸-1-萘酯無(wú)水乙醇液的最適用量,1.00mL酶液,1.00mL固藍(lán)B鹽溶液于10mL容量瓶中,用最適pH值的磷酸鹽緩沖液定容。酶促反應(yīng)體系于最適溫度下水浴恒溫5～40min(以5min為間隔),以不加原酶液為空白,在最適波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。3抑制率測(cè)定在上述所得酶促反應(yīng)最適條件下,加入敵敵畏、敵百蟲、甲胺磷、辛硫磷在最適波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。抑制率Ⅰ(%)=ΔA未抑制?ΔA抑制ΔA未抑制×100Ⅰ(%)=ΔA未抑制-ΔA抑制ΔA未抑制×100式中,ΔA未抑制:無(wú)農(nóng)藥抑制時(shí)的酶液活性;ΔA抑制:某濃度農(nóng)藥抑制時(shí)酶液活性。4結(jié)果與分析4.1不同部位的酯酶酶促反應(yīng)顯然,由圖1-4可知:各反應(yīng)體系最大吸收峰十分相近,分別在534nm、532nm、533nm、532nm處時(shí),測(cè)得土豆、紅薯、茨菇、芋頭的酯酶酶促反應(yīng)吸光度值最大,酶活性最高。4.2底物用量的影響由表1可知:分別以土豆、紅薯、茨菇、芋頭的酯酶進(jìn)行酶促反應(yīng),當(dāng)?shù)孜镉昧糠謩e為0.50mL、0.50mL、1.00mL、0.50mL時(shí)吸光度值最大,相應(yīng)酶活性最高。4.3配制酶反應(yīng)體系用pH值為3.5～7.0磷酸鹽緩沖液配制酶反應(yīng)體系。表1顯示:土豆、紅薯、茨菇、芋頭的酯酶在pH分別為5.5、6.5、6.5、6.0時(shí)酶活性最高。4.4不同溫度對(duì)紅薯、茨菇、多種酯酶的酶催化反應(yīng)的影響酶促反應(yīng)體系置于30～60℃下水浴。表1顯示:土豆、紅薯、茨菇、芋頭酯酶的酶催化反應(yīng)溫度分別在45℃、40℃、40℃、45℃時(shí)酶活性最大。4.5不同溫濕度時(shí)間對(duì)土壤、紅薯、茨菇、酯酶活性的影響酶促反應(yīng)體系于45℃下水浴恒溫5～40min。實(shí)驗(yàn)表明:土豆、紅薯、茨菇、芋頭酯酶的酶催化反應(yīng)在恒溫時(shí)間分別為13min、25min、25min、5min時(shí)酶活性最大。4.6測(cè)定條件及方法微量分析方法要求靈敏度越高越好。在本研究確定的最佳反應(yīng)條件下測(cè)定了4種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留,以抑制率對(duì)農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)做工作曲線,線性方程及靈敏度見表2～5。5實(shí)驗(yàn)材料的選取酶抑制法檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的關(guān)鍵是酶源的選取和檢測(cè)條件的確定,具有很大的開發(fā)利用前景。作為一種生物活性物質(zhì),植物酯酶極易失活或變性,故實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)選取當(dāng)年生新鮮植物種子。目前研究主要集中在糧食作物小麥及其加工產(chǎn)品上。根據(jù)文獻(xiàn)資料可知,植物酯酶廣泛存在于植物活體中,尤其是淀粉含量高的。因此,本實(shí)驗(yàn)在選材上打破以往慣例,選取幾種塊莖,旨在擴(kuò)大了酶源的選材范圍。6植物酯酶活性的檢測(cè)檢測(cè)限(limitofdetection,LOD)和靈敏度是反映分析方法有效性的重要指標(biāo),乙酰膽堿酯酶和植物酯酶用于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)具有相似的檢測(cè)限,且植物酯酶法測(cè)量精密度較好。試驗(yàn)在選材上,有較大突破,對(duì)含有淀粉的塊莖植物酯酶活性進(jìn)行了初步探討。通過對(duì)4種有機(jī)磷類農(nóng)藥的敏感性試驗(yàn)可以得出,除紅薯酯酶酶