優(yōu)化HPLC及使用注意事項

1HPLC維護21.在線脫氣機2.四元／二元/單元泵3.自動進樣器4.二極管陣列檢測器5.可變波長紫外檢測器3在線脫氣機-在線脫氣機4工作原理在線脫氣機5何時需要使用在線脫氣機在線脫氣機6在線脫氣機脫氣機的操作：操作泵之前，用至少兩個體積（標(biāo)準(zhǔn)脫氣機30ml，對微脫氣機10ml）沖洗真空脫氣機，特別是當(dāng)泵關(guān)閉了一段時間后（例如，過夜），以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時。標(biāo)準(zhǔn)脫氣機（G1322A).

標(biāo)準(zhǔn)脫氣機每個通道體積為12ml建議排液操作：5ml/min排液6min以上。微脫氣機（G1379A).微脫每個通道體積為1ml建議排液操作：2ml/min排液5min。切勿用5ml/min流速去排液。7溶劑

用棕色玻璃瓶裝水溶液，可以避免藻類的生長。

過濾溶劑以免其中微粒永久性阻塞毛細(xì)管。避免使用下述可腐蝕鋼鐵的溶劑：

堿金屬鹵化物及其酸溶液(如：碘化鋰、氯化鉀等)。

高濃度無機酸，如硝酸、硫酸.

可能含有過氧化物的色譜純醚(如THF、二氧六環(huán)、二丙基乙醚)。這些在使用前必須用干燥氧化鋁過濾除去過氧化物。

含強絡(luò)合劑的溶液(如EDTA，乙二胺四乙酸)。

四氯化碳與2-異丙醇或四氫呋喃的混合液。8防止堵塞溶劑過濾器及真空腔

污染的溶劑或溶劑瓶里的藻類生長將會縮短溶劑過濾器的使用壽命，并且影響泵的運行。這在水溶劑或磷酸鹽緩沖液(pH

4至7)中尤其如此。下列建議將會延長溶劑過濾器的使用壽命并維持泵的運行。使用滅過菌的溶劑瓶來減緩藻類生長。使用新鮮配制的流動相，特別是水溶劑或鹽緩沖液（建議不超過兩天）。如果應(yīng)用許可，在溶劑中加人0.0001－0.001

M的疊氮化鈉。避免溶劑瓶暴露在直射陽光下。用氬氣置換流動相上層的空氣。長期不用時用水清洗水溶液通道并置換為甲醇日常維護,故障診斷9日常維護,故障診斷檢查溶劑過濾器－擰開脫氣機出口或比例閥入口管線，并使液面高于出口30cm；此時溶劑會因為重力流出，脫氣機或溶劑過濾頭堵塞時，溶劑會流出不暢或不流出。－查看過濾器是否變色．－臨時取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常．清潔溶劑過濾器將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下。先用水沖洗殘留之溶劑，然后將過濾器放在裝有濃硝酸（35％）的燒杯里浸一小時。用二次蒸餾水徹底沖洗過濾器。建議不使用超聲波清洗機清洗。將過濾器重新裝好。建議定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶，每三個月至少清洗一次。注意：不要使用沒有安裝溶劑過濾器的系統(tǒng)．可能會嚴(yán)重堵塞系統(tǒng)10日常維護Question?1.如何簡單判斷脫氣機脫氣是否正常？打開Purge閥，設(shè)定泵的流速2ml/min，提起當(dāng)前所使用溶劑瓶內(nèi)的溶劑過濾頭，使之脫離液面一小段時間，此時溶劑傳送管內(nèi)會產(chǎn)生一小段氣泡，放下過濾頭，讓此段氣泡通過脫氣機，如果脫氣機正常，氣泡應(yīng)消失或縮小。2.如何簡單判斷脫氣機腔體或溶劑過濾頭是否堵塞？

關(guān)閉泵，擰開脫氣機出口或比例閥入口管線,此時溶劑會因為重力流出，脫氣機或溶劑過濾頭堵塞時，溶劑會流出不暢或不流出。11Agilent1100四元泵(G1311A)12Agilent1100四元泵工作原理13Agilent1100泵頭(PumpHead)結(jié)構(gòu)圖Agilent1100泵14嚴(yán)重污染的溶劑出口過濾芯Agilent四元／二元/單元泵日常維護15多通道梯度閥（MCGV）操作要點

當(dāng)鹽溶液和有機溶劑混合時，鹽溶液可能與有機溶劑完全混溶，而不會出現(xiàn)沉淀。但是在梯度閥的混合點，重力作用有可能使鹽顆粒沉淀下來。通常，閥的A通道用于水相/鹽溶液，而泵的B通道用于有機溶劑。如果使用的是這樣的配置，鹽將落回到鹽溶液中，并被溶解。當(dāng)泵使用的不同配置（例如，D-鹽溶液，A-有機溶劑）時，鹽可能會落到有機溶劑中，從而出現(xiàn)問題。

Agilent1100四元泵中使用鹽溶液和有機溶劑時，建議將鹽溶液接到下面的口上，有機溶劑接到上面的梯度閥口上。有機溶劑通道最好直接在鹽溶液通道的上面。建議定期用水沖洗所有MCGV通道，以去除在閥口上可能出現(xiàn)的鹽沉淀。Agilent四元／二元/單元泵日常維護

16更好地使用四元泵

將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面(或較高處)。當(dāng)在四元泵上使用鹽溶液或有機溶劑時，建議將鹽溶液接在底部的梯度閥口上，將有機溶劑接在上面的梯度閥口上。有機通道最好在鹽溶液通道的上面。建議用水定期沖洗所有MCGV通道除去可能在閥口析出得鹽結(jié)晶。操作泵之前，用至少兩個體積（標(biāo)準(zhǔn)脫氣機30ml，對微脫氣機10ml）沖洗真空脫氣機，特別是當(dāng)泵關(guān)閉了一段時間后（例如，過夜），以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時。防止溶劑過濾器堵塞及長菌。當(dāng)濾器表面有黑色或黃色污染層說明濾器發(fā)生了堵塞，請立即清洗或更換之。定期檢查排液閥的濾芯。檢查方法：擰開排液閥，以水作流動相，流速5ml/min，若壓力大于10bar,則須立即更換。

Agilent四元／二元/單元泵日常維護

17Agilent1100系列泵的使用須知

更好地使用泵

當(dāng)泵頭安裝有沖洗附件時，由于該附件中也有密封墊，這樣就會增加活塞桿運動時的阻力。所以開泵前一定要用10％異丙醇，并將其流速調(diào)至約20滴/分鐘使這溶液流過沖洗裝置。10％異丙醇有助于降低水的表面張力，并有抑菌作用。最好不要用其它溶劑代替。

當(dāng)泵頭安裝有沖洗附件而不開啟10％異丙醇，會使密封墊及活塞桿的壽命減短。18Agilent1100自動進樣器使用須知19Agilent1100自動進樣器使用須知使用自動洗針功能自動洗針功能可以把程序設(shè)置為“帶有洗針的進樣”,或?qū)⒆詣酉瘁樄δ馨谶M樣器程序中。當(dāng)使用自動洗針功能時，進樣針在取樣后會轉(zhuǎn)移到洗針步驟。造成攜留效應(yīng)的主要原因是殘留在進樣針外的少量樣品。通過進樣后的洗針功能可以立即洗去針外表面上殘留的樣品。當(dāng)進樣閥轉(zhuǎn)回到主流路時，定量管和針內(nèi)所有的樣品都被沖洗到色譜柱中。這種結(jié)合洗針和沖洗管路的設(shè)計可以把攜留效應(yīng)減低到最小的程度。去掉洗滌瓶蓋為了獲得最佳的分析結(jié)果，裝有溶劑的洗滌瓶是不加蓋的，而且洗滌瓶中的溶劑對樣品組分有較好的溶解作用。如果洗滌瓶有蓋將會有少量樣品留在密封墊上，這樣會把殘留的樣品帶到下一個樣品中。帶有洗針的進樣程序進樣程序中包括了NEEDLEWASH（洗針）命令，當(dāng)這一命令設(shè)置在進樣程序中時，則在進樣前會進入指定的洗滌瓶中洗針。[例]

1DRAW5μL（抽取5μL樣品）

2NEEDLEWASHvial7（洗針到7號瓶）

3INJECT（進樣）20Agilent1100自動進樣器使用須知21Agilent1100自動進樣器使用須知提高進樣量的精度進樣體積小于2

μL當(dāng)進樣閥切換到BYPASS（旁路）位置時，在定量管內(nèi)的流動相壓力降低。當(dāng)進樣針抽取樣品時，流動相進一步降低壓力。如果流動相沒有充分脫氣，在進樣時定量管內(nèi)就會產(chǎn)生小氣泡。在進樣體積小于

2

μL時這些小氣泡就會影響到進樣體積的精密度。為了使進樣體積小于

2

μL時有最佳的進樣精密度，建議使用Agilent

1100系列真空脫氣機，確保流動相充分脫氣。也可以在進樣間隙自動洗針，從而進一步提高進樣體積的精密度。22Agilent1100自動進樣器使用須知提高進樣量精度抽樣速度對粘稠的樣品，計量部件從樣品瓶抽取樣品的速度會影響取樣體積的精密度。如取樣速度太快，在樣品塞中會帶有氣泡，從而影響進樣體積。抽樣速度的默認(rèn)值是200

μL/min(范圍：10-1000

μL/min)，這一速度適合于大多數(shù)樣品的取樣要求。但是對于粘稠的樣品要得到最佳的結(jié)果，設(shè)定的抽樣速度要低于

200

μL/min。進樣器程序中的“DRAW”命令行也用于抽樣速度的設(shè)定，這是為自動進樣器設(shè)置的。推樣速度默認(rèn)的推樣速度為200

μL/min(范圍：10-1000

μL/min)，當(dāng)進行大體積進樣時，就要設(shè)定為較大的推樣速度，加快進樣周期。這就是縮短計量器具從進樣周期開始（當(dāng)注射器活塞回到起始位置時）到推出溶劑所需的時間。進樣器程序中的“EJECT”命令行也用于推樣速度的設(shè)定，這是為自動進樣器設(shè)置的。較快的推樣速度可以加快進樣器程序所需的時間。對于粘稠的樣品要避免使用過快的推樣速度。當(dāng)使用多次抽樣功能時，推樣速度控制著樣品進入針座毛細(xì)管擴大體積部分的速度，對粘稠的樣品要避免使用過快的推樣速度。23Question?1.樣品量太少（某些離心處理的樣品），無法過濾，為了盡量避免堵塞，可以采取什么措施？

在自動進樣器設(shè)置中，適當(dāng)抬高進樣針抽樣時的位置。Agilent1100自動進樣器日常維護24Agilent1100自動進樣器日常維護Question?2.怎樣判斷自動進樣器的轉(zhuǎn)子墊圈磨損？

將第四號管（排液的細(xì)塑料管）提起，正常情況下應(yīng)沒有液體滴出，如有則轉(zhuǎn)子墊圈已磨損。色譜現(xiàn)象：壓力不穩(wěn)，保留時間、峰面積重復(fù)性差，殘留嚴(yán)重。25Agilent1100手動進樣器（G1328A,G1328B)26Agilent1100手動進樣器操作原理27Agilent1100手動進樣器操作原理28Agilent1100手動進樣器使用須知

為了防止虹吸應(yīng)注意使第五第六號放空管的出口與進樣口保持在同一平面29Agilent1100手動進樣器使用須知

為了更好的重現(xiàn)性，應(yīng)進行滿閥進樣，進樣體積最好是樣品環(huán)的5~6倍。一定要使用合規(guī)格的進樣器，規(guī)格為外徑0.028英寸，長2英寸的平頭針。一定不能使用尖針！它會嚴(yán)重刮壞轉(zhuǎn)子墊圈。30Agilent1100手動進樣器日常維護進完樣后一定要及時沖洗進樣器，特別是用鹽或緩沖液作流動相。由于這些溶液會形成結(jié)晶從而磨損墊圈。沖洗方法：

A.將進樣器轉(zhuǎn)至Inject位置，利用液相泵輸送高純水沖洗(這時是沖洗樣品環(huán)及溝槽）.

B.用閥清洗接頭和注射器沖洗。31Agilent1100手動進樣器日常維護經(jīng)常用濕潤的軟布清潔進樣器，特別是進樣口周圍。請仔細(xì)閱讀進樣器說明書，上面有詳細(xì)使用及其它信息。32Agilent1100手動進樣器日常維護Question.如何判斷手動進樣器的密封圈漏？通常結(jié)合兩方面：從進樣器觀察，進樣后將針拔出，若從進樣口或排空管有液體冒出，顯示密封圈磨損。從結(jié)果看：通常有壓力不穩(wěn)定，峰面積或保留時間不穩(wěn)定和殘留嚴(yán)重。33Agilent1100柱溫箱器使用注意事項及日常維護34Agilent1100柱溫箱器使用注意事項及日常維護連接的管路盡量短，防止熱擴散及峰增寬。如果使用小體積分析柱以及流速小于0.2ml/min時建議使用左邊的柱溫箱(左邊體積較少,3ul).除非特殊應(yīng)用，建議將兩邊溫度設(shè)置一樣。并確保關(guān)好前蓋。35Agilent1100二極管陣列檢測器(G1315B)36Agilent1100二極管陣列檢測器工作原理37Agilent1100二極管陣列檢測器工作原理可變的光進口狹縫系統(tǒng)這一微型狹縫系統(tǒng)是利用硅的機械性能和總體布局微型加工技術(shù)以及精確的制作功能加工而成，它把所需的光學(xué)性能－狹縫和光柵－集中組合到一起，成為一個簡單、緊湊的元件。狹縫寬度直接由儀器上的微處理器來控制，并可用為設(shè)定分析方法的一個實驗參數(shù)。光柵用一個凹面全息光柵來實現(xiàn)分光和光譜成像，光柵把入射光束全部分散成組成它的波長，然后把它反射到二極管陣列上。二極管陣列二極管陣列由1024個光電二極管和一個位于陶瓷基座上的電路組成，在190

---950

nm范圍內(nèi)取樣間隔<

1

nm。38Agilent1100二極管陣列檢測器性能優(yōu)化39Agilent1100二極管陣列檢測器性能優(yōu)化40Agilent1100二極管陣列檢測器性能優(yōu)化41Agilent1100二極管陣列檢測器性能優(yōu)化流通池光路長度對信號值的影響

流通池加長得到的信號值就高，盡管在流通池加長時噪音略有增加，而信噪比有較大的增加。例如，見圖8，把流通池長度由6

mm增加到10

mm，噪音增加10

%，而信號增加70

%。

流通池加長會使池體積也有所增加在我們的例子中為5μL

13

μL，這時峰寬也會增加，如圖8所示，在此例的梯度洗脫中對分離度沒有影響。

經(jīng)驗表明，池體積應(yīng)為半峰高處峰體積的1/3。要測定峰體積，把積分后的峰寬乘以流速再除以3。

圖842Agilent1100二極管陣列檢測器性能優(yōu)化使用較寬的帶寬有降低噪聲的優(yōu)點，能在整個波長范圍內(nèi)降低噪聲－和使用4

nm帶寬相比采用30

nm帶寬，基線噪聲降低約2.5倍。而信號值是4-nm帶寬的75%，在此例中信噪比增大2倍。43Agilent1100二極管陣列檢測器性能優(yōu)化44Agilent1100二極管陣列檢測器性能優(yōu)化45Agilent1100二極管陣列檢測器性能優(yōu)化46Agilent1100二極管陣列檢測器性能優(yōu)化峰寬（響應(yīng)時間）響應(yīng)時間是說明在流通池中光吸收產(chǎn)生突變后出現(xiàn)檢測器信號的快慢，檢測器采用數(shù)值濾波器使響應(yīng)時間與色譜圖中峰寬相適應(yīng)，這一濾波器不影響峰面積和峰的對稱性，正確設(shè)定此濾波器會大大減小基線噪聲（見圖9），但會使峰高略有下降。另外這一濾波器能降低數(shù)據(jù)的速度，優(yōu)化色譜的積分和顯示，能最大限度地減少存儲色譜和光譜的磁盤空間。47Agilent1100二極管陣列檢測器性能優(yōu)化表6列出檢測器對濾波器的選擇。為獲得最佳效果，把峰寬設(shè)定為接近于色譜圖中窄峰的寬度，此時響應(yīng)時間約為峰寬的1/3，這樣會使峰高降低<5

%，峰的加寬不到5

%。在檢測器中峰寬設(shè)定減小會引起峰高增加<5

%，但是基線噪聲增大1.4倍，響應(yīng)時間增大2倍。把峰寬（響應(yīng)時間）增大到推薦值的2倍（過度濾波），則峰高會降低20

%，基線噪聲降低1.4倍。這樣可能會得到最佳的信噪比，但也可能會影響分離度。48Question?1.基線噪音大可能由那些原因引起

泵壓不穩(wěn)，氣泡，色譜柱污染，系統(tǒng)管路污染，流通池污染，燈強度不足，光學(xué)系統(tǒng)老化或污染，參數(shù)設(shè)置不合理Agilent1100檢測器日常維護49Agilent1100其它檢測器使用注意事項及日常維護熒光檢測器：PMTGAIN:放大因子，該值大則信號高，但噪音也會隨之增高，所以需優(yōu)化。LAMP:有兩種模式，standard和economy。RESPONSETIME:通常用4S。由于水性流動相長時間留在流動池會有藻類生長，而藻類會產(chǎn)生熒光，所以可添加有機溶劑如5％的乙腈或甲醇。

熒光檢測器流通池不耐壓，切勿堵塞或彎折出口廢液管！50Agilent1100其它檢測器使用注意事項及日常維護示差折光檢測器使用注意事項及日常維護.溶液瓶和廢液瓶應(yīng)高于泵和檢測器，這樣使流動池產(chǎn)生輕微壓力有助于提高檢測器的性能。RID的耐受壓力最高只有5bar,所以如要串聯(lián)其它檢測器時務(wù)必將RID放在最后。一定要使用控溫功能令光路恒溫，為了防止結(jié)晶應(yīng)將溫度設(shè)置至少高于室溫5℃以上。使用合適的responsetime通常用4S。一定要預(yù)先混合好流動相，如果是四元泵，請使用轉(zhuǎn)接頭(P/N0100-1847)旁路比例閥。某些流動相與柱配合時會造成基線噪音。如乙腈/水作流動相與含氨丙基柱。51Agilent1100其它檢測器使用注意事項及日常維護

RID基線漂移通常是溶劑變化引起的，如乙腈/水混合溶劑乙腈會揮發(fā)。四氫呋喃(THF)會形成過氧化物。某些吸水溶劑等，這些變化都會引起基線的變化從而造成基線漂移。

52Agilent1100HPLC日常維護－總結(jié)1·、定期清洗溶劑過濾頭（35％濃硝酸浸泡1小時，不要使用超聲波清洗）2、流動相應(yīng)經(jīng)過0.45um或更小孔徑的濾器過濾，如果使用濾膜，注意有機膜與水膜的區(qū)別(聚四氟乙烯能適用于所有溶劑)3、根據(jù)情況更換Purge閥內(nèi)的在線過濾頭（Purge閥打開，純水5ml/min，壓力超過10bar時需更換）4、注意清洗在線脫氣機及比例閥，尤其是長期使用水相或緩沖鹽的通路，使用純水沖洗后，再使用甲醇沖洗，可以打開Purge閥，使用5ml/min的流速。污染比較嚴(yán)重時，可以使用IPA清洗。

一般的流程，例如

A：BufferB:MeOHC:WaterD:CH3CN

分析：A:B:D=20:30:50

清洗：C100%30min，B100%30min53安如裝有sealwash組件的，無論是否使用緩沖鹽，開泵之前都應(yīng)該使之充滿流動的液體（10%IPA水溶液）并調(diào)流速為20滴/分鐘。正相色譜、反相色譜切換時應(yīng)使用IPA過渡，長期使用正相，應(yīng)更換正相柱塞密封墊樣品進樣之前最好過濾，如果樣品量太少，可以適當(dāng)抬高進樣針的位置流動相pH大于9.5或小于2.3時，進樣閥應(yīng)更換tefzel

轉(zhuǎn)子密封圈注意不同檢測器流通池耐壓問題，盡量避免使用pH>9.5的流動相，以防腐蝕流通池石英窗，避免使用可能析晶的流動相，防止流通池堵塞

VWD40bar；DAD120bar；MWD120bar；FLD20bar

；RID5bar

RID、FLD永遠(yuǎn)是最后一個檢測器注意不同廠家接頭問題，防止?jié)B漏或毀壞色譜柱和接頭

Agilent1100HPLC日常維護54HPLC常用的色譜柱接頭0.090in.0.130in.0.090in.0.170in.SwagelokWatersParkerRheodyneValcoUptight0.090in.0.080in.TroubleshootingLCFittings,PartII.J.W.DolanandP.Upchurch.LC/GCMagazine6:788(1988)Agilent1100HPLC日常維護－總結(jié)55Agilent1100HPLC日常維護－總結(jié)毛細(xì)管的區(qū)分

Blue