草莓無病毒苗培養(yǎng)研究

草莓無病毒苗培養(yǎng)研究

經(jīng)過幾代人的繁殖，草莓容易感染各種病毒疾病，如草莓、草莓微紅外病、草莓和側(cè)柏病、草莓和側(cè)柏病。葉片褶皺、果實(shí)變形、品質(zhì)惡化、產(chǎn)量下降、植物生長緩慢等幾種現(xiàn)象，并逐年惡化。針對這一難題,我們與美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究中心合作,建立了由組培試管苗繁育無病毒原種、生產(chǎn)用苗,到無病毒母株保存的完整繁育體系。1材料和方法1.1無病毒草莓品種供試的早美光(Earliglow)、矮豐(Mohawk)、瑞星(Latestar)、奇妙(Demarvel)、北斗(Northeaster)和全明星(Allstar)6個(gè)無病毒草莓品種均由本所從美國直接引進(jìn)。1.2方法1.2.1生物固養(yǎng)培養(yǎng)組織在6月份取田間生長健壯的匍匐莖,用0.1%升汞消毒10分鐘,然后在解剖鏡下剝?nèi)∏o尖分生組織0.3～0.4mm,立即置于生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。1.2.2培養(yǎng)基的生長每隔4周取試管苗的叢生芽接種于增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)基的基本成分為MS無機(jī)鹽,附加0.56mmol肌醇、1.2μmol鹽酸硫胺素、1.32μmol6-芐基嘌呤、87.6mmol蔗糖、6g/L瓊脂,pH值5.6。培養(yǎng)基在121℃、131kPa的條件下滅菌20分鐘。培養(yǎng)室的溫度為25℃,光照強(qiáng)度為2000lx,光周期(光照/黑暗)為16/8小時(shí)。在增殖培養(yǎng)基上生長3～4周后,取其培養(yǎng)物的新梢轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基為1/2MS,附加IBA0.05μmol,培養(yǎng)兩周后全部生根,將其移栽于溫室條件下鍛煉。1.2.3溫室訓(xùn)練生根的小植株打開瓶口鍛煉兩天后,移栽于河沙中,然后保存在溫室中的塑料棚內(nèi),使其在較高的濕度下鍛煉3周。1.2.4新葉的種植經(jīng)溫室鍛煉3周后的試管苗,地上部已全部長出新葉,地下部分生了大量新根,此時(shí)將其移于陽光直射的戶外鍛煉5天,然后直接移栽于大田。11月中旬扣小拱棚保溫,試管苗可安全越冬。2結(jié)果分析2.1對主要病毒的脫除效果6個(gè)供試品種匍匐莖的莖尖分生組織在培養(yǎng)基上成活后,按單個(gè)株系離體繁殖,然后將部分試管苗移栽于溫室。經(jīng)2～3個(gè)月試管苗長大后,采取小葉按小葉嫁接法嫁接于指示植物林叢草莓(Fragariavesca)UC4、UC5、UC6和深紅草莓(F.virginiana)UC10上,檢查草莓斑駁病毒、草莓輕型黃邊病毒、草莓皺縮病毒和草莓鑲脈病毒等主要病毒的脫除情況,每株系每處理重復(fù)3～5次。試驗(yàn)證明,所有供試品種的病毒脫除率均在80%以上,經(jīng)鑒定證明確系脫除病毒的株系保留,繼而采用組織培養(yǎng)法擴(kuò)繁。2.2病毒“原苗”的克隆率正在迅速增長2.2.1制備lg-ld-bb快速繁殖法經(jīng)指示植物UC4、UC5、UC6、UC10鑒定脫除所有病毒的株系,作為無病毒良種繁育體系的“原原種”,在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行無菌快速繁殖(圖1)。在附加激素BA0.5mg/L的MS培養(yǎng)基上,光照周期(光照/黑暗)16/8小時(shí)的條件下,早美光、矮豐、北斗、奇妙4個(gè)品種,每月可增殖16～19倍,全明星、瑞星可增殖8倍以上(表1),表明在增殖培養(yǎng)基上各品種的增殖倍數(shù)不同。同樣,各品種的試管苗在增殖培養(yǎng)基上外觀特征也不同,全明星、瑞星和早美光生長健壯,而矮豐、北斗生長勢較弱。2.2.2苗苗移栽鍛煉及成活率把在增殖培養(yǎng)基上形成的叢生芽按單芽分開,轉(zhuǎn)移到1/2MS+IBA0.05mg/L的生根培養(yǎng)基上,3周后諸品種的生根率均達(dá)100%。然后打開瓶口轉(zhuǎn)移到陽光下鍛煉3～4天,再移栽到溫室培養(yǎng)基質(zhì)(河沙、珍珠巖、蛭石等)中鍛煉。溫室的相對濕度應(yīng)保持70%以上。生根的幼苗在16～20℃條件下成活率最高。表2表明,在無溫度控制的溫室條件下,在8～10月份移栽,以10月中旬移栽成活率最高,可達(dá)90%以上。夏季溫度過高,周圍環(huán)境濕度大,試管苗成活率大大降低。因此,試管苗移至溫室鍛煉以9月底至翌年4月為佳。此期移栽成活的試管苗(圖2),可作為草莓無病毒栽培的“原原種”,直接向無病毒苗木繁育組織或農(nóng)戶提供,用來培育“原種”苗。2.3苗苗栽植、繁育溫室鍛煉2～3周后的試管苗,待有新根和新葉長出時(shí)移出溫室,在陽光直射下鍛煉5～7天,然后直接移栽于大田的塑料大拱棚內(nèi),移栽成活率可達(dá)100%(表3),待試管苗長大、有匍匐莖長出時(shí)(圖3),作為“原種”苗保存于防蚜蟲網(wǎng)室內(nèi),作為無病毒核心母株,或直接提供給育苗者進(jìn)行繁育(時(shí)間為當(dāng)年11月至翌年3月上旬)。2.4人工養(yǎng)殖苗種的繁殖與管理在塑料大拱棚內(nèi)充分長大的無病毒試管苗,春季(3月上旬)進(jìn)一步移栽稀植(30cm×40cm)。此期要加強(qiáng)土肥水管理,加快繁殖,同時(shí)要注意與產(chǎn)區(qū)隔離,并及時(shí)防治蚜蟲,以防止病毒再次感染。待5月至6月上旬,即可作為無病毒種苗直接提供給種植者,用來繁殖健壯的生產(chǎn)用苗,以便9月份進(jìn)行大規(guī)模的保護(hù)地栽培。實(shí)踐證明,從10月份移栽的“原原種”苗,至翌年9月份的生產(chǎn)用苗,繁殖倍數(shù)可達(dá)100倍以上(表3)。2.5網(wǎng)室管理復(fù)雜國外無病毒草莓的“原原種”苗(即核心母株),多保存于防蚜蟲的網(wǎng)室內(nèi),因該種網(wǎng)室占地面積大,管理復(fù)雜、費(fèi)工。我們把無病毒“原原種”苗保存在無菌條件下的試管中,置25℃的培養(yǎng)室內(nèi),每月更換一次培養(yǎng)基;在5℃的冰箱內(nèi),6個(gè)月更換一次培養(yǎng)基,達(dá)到了周年快速高倍繁殖、安全省工保存的目標(biāo)。3無病毒苗木計(jì)劃隨著生產(chǎn)、科研水平的不斷提高,草莓病毒病的干擾及對植株生長和產(chǎn)量造成的損失也日益明顯。農(nóng)業(yè)生物技術(shù)發(fā)達(dá)的歐美國家,60～70年代就開始實(shí)施果樹栽培的無病毒計(jì)劃,如美國的IR-2計(jì)劃、加拿大的“核心母株”計(jì)劃和英國的EMLA計(jì)劃等。特別是英國的EMLA計(jì)劃已在國際上推行,在世界各國苗圃內(nèi),凡標(biāo)有“EMLA”號的品種或砧木均為無病毒苗木。在草莓上,英國率先于1966年實(shí)施了“特殊苗木證書”計(jì)劃(Specialstockcertificationscheme),由EMLA每年向果樹核心母株協(xié)會有限公司(NuclearStockAssociationLtd.)的成員提供14個(gè)草莓品種,1200株草莓匍匐莖苗(SSrunners),極大地促進(jìn)了世界草莓無病毒栽培。但上述計(jì)劃是熱處理法脫毒,無病毒母株在網(wǎng)室、溫室保存和網(wǎng)室